劉 蘭張東雪張勝雷白亞玲

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 腎內(nèi)科,石家莊 050011)

血管鈣化能夠增加心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂、腦卒中的風(fēng)險(xiǎn),是增加心血管疾病發(fā)病率和死亡率的重要危險(xiǎn)因素[1-2]。 血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)凋亡是血管鈣化的重要機(jī)制之一[3]。 此外,研究發(fā)現(xiàn)[4],miRNAs在細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化、細(xì)胞轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡中起重要作用。 miR-30b 是miR-30 家族的一員[5],在人體組織中廣泛表達(dá),且已有報(bào)道顯示,miR-30b 能夠靶向調(diào)控人主動(dòng)脈瓣瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的鈣化[6]。 但miR-30b在血管平滑肌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究對(duì)大鼠VSMCs 進(jìn)行體外培養(yǎng),在高磷環(huán)境中探討miR-30b 參與調(diào)節(jié)大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取SPF 級(jí)雄性健康SD 大鼠6 只,4 周齡,體重約80~100 g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(冀)2020-002],合格證編號(hào):1305090。 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(冀)2018-001],環(huán)境溫度18℃~24℃,濕度40%~60%,12 h/12 h 明/暗循環(huán)環(huán)境,飼料、飲水均經(jīng)過高壓滅菌處理。 本研究已通過河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)審核(2021KY044),所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在3R 原則的指導(dǎo)下給與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)液(批號(hào):31600-034)(美國(guó)Gibco公司); 胎牛血清(批號(hào): A0500-3210) (美國(guó)Cegrogen 公司);β-甘油磷酸(批號(hào):SLCD0875)(美國(guó)Sigma 公司);RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒(批號(hào):R11068.5)(銳博生物公司);miR-30b 的抑制物(批號(hào):R11035.4)(銳博生物公司); GAPDH 抗 體( 批 號(hào): AP0063) ( 美 國(guó)Proteintech,公司);BAX 抗體(批號(hào):50599-2-Ig)(美國(guó)Proteintech 公司);Bcl-2 抗體(批號(hào):AF6139)(美國(guó)Affinity 公司);山羊抗兔二抗(批號(hào):5220-0336)(美國(guó)Seracare 公司)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(批號(hào):QuantStudio DX)(美國(guó)life 公司);倒置相差顯微鏡(批號(hào):Axio Observer D1)(日本OLYMPUS 公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(批號(hào):150i)(美國(guó)Sheldon 公司);酶標(biāo)儀(批號(hào):CytationⅢ (美國(guó)Biotek 公司);蛋白電泳儀(批號(hào):10025025 Rev A 12-0625 0312)(美國(guó)BIO-RAD 公司); 凝膠成像系統(tǒng)(批號(hào): FR0146) (美國(guó)Proteinsimple 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽渑c分組

對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行稱重,根據(jù)體重腹腔注射200 mg/kg 的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,75%乙醇溶液浸泡消毒10 min 后,經(jīng)腹部中線縱行切口,依次分離進(jìn)入胸腔,取大鼠胸主動(dòng)脈,分離中膜層,剪成1 mm×1 mm×1 mm 的小塊,均勻鋪于瓶底,組織貼壁法對(duì)VSMCs 行原代培養(yǎng)。 貼壁細(xì)胞占底壁的80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代,使用PBS 液沖洗2 次,胰酶消化1 min,加入等量完全培養(yǎng)基,吹打混勻,收集細(xì)胞并離心后,按1 ∶2 進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 傳代至第3~4 代將細(xì)胞分為兩組:正常組和高磷組(給予10 mmol/L β-甘油磷酸鹽),干預(yù)7 d 后檢測(cè)miR-30b、BAX、Bcl-2等指標(biāo)的變化。 為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-30b 對(duì)VSMCs的作用,給予轉(zhuǎn)染miR-30b 的抑制物inhibitor-30b,將細(xì)胞分為3 組:(1)正常組:細(xì)胞未轉(zhuǎn)染;(2)inhibitor-NC 組:轉(zhuǎn)染20 μmol/L 抑制物的對(duì)照inhibitor-NC 5 μL;(3) inhibitor-30b 組: 轉(zhuǎn) 染20 μmol/L 抑制物inhibitor-30b 2.5 μL。 轉(zhuǎn)染72 h 后檢測(cè)凋亡情況。 為進(jìn)一步驗(yàn)證高磷環(huán)境中miR-30b的作用,給予轉(zhuǎn)染miR-30b 的類似物mimic-30b,將細(xì)胞分為3 組:(1)高磷組:10 mmol/L β-甘油磷酸鹽培養(yǎng),細(xì)胞未轉(zhuǎn)染;(2)高磷+mimic-NC 組:10 mmol/L β-甘油磷酸鹽培養(yǎng),轉(zhuǎn)染20 μmol/L 類似物的對(duì)照mimic-NC 5 μL;(3)高磷+mimic-30b 組:10 mmol/L β-甘油磷酸鹽培養(yǎng),轉(zhuǎn)染20 μmol/L 類似物mimic-30b 5 μL。 轉(zhuǎn)染72 h 后檢測(cè)凋亡情況。

1.3.2 細(xì)胞SM22α 免疫組化染色

取出細(xì)胞用4%的中性福爾馬林固定30 min,PBS 洗3 次,0.3% Triton-100,作用20 min,PBS 洗3次,H2O2作用15 min,PBS 洗3 次,加入5%山羊清封閉在37℃孵育30 min,加入SM22α 一抗4℃過夜,次日,PBS 洗3 次,加入二抗A 液,作用30 min,PBS 洗3 次,加入二抗B 液,作用30 min,PBS 洗3次,加入DAB 顯色液作用30 s,自來水洗3 次,蘇木素復(fù)染,脫水封片。

1.3.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

接種于96 孔板中的血管平滑肌細(xì)胞融合達(dá)60%~70%給予刺激,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。 取MTT(5 mg/mL)各檢測(cè)孔加入20 μL,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,取二甲基亞砜各檢測(cè)孔加入150 μL,于室溫振蕩10 min。 酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值,記錄結(jié)果。

1.3.4 流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡

給予刺激后,收集細(xì)胞,根據(jù)試劑說明書進(jìn)行Annexin V-PE/7-AAD 雙重染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè),右上象限Annexin V 為陽(yáng)性、7-AAD 為陽(yáng)性,為晚期凋亡細(xì)胞;右下象限Annexin V 為陽(yáng)性、7-AAD 為陰性,為早期凋亡細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)各組miR-30b 表達(dá)

分別提取各組的miR-30b。 實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。銳博生物提供的miR-30b 和U6 的引物,U6 為內(nèi)參,反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃ 10 min;變性95℃ 10 s、退火60℃ 20 s,40 個(gè)循環(huán),重復(fù)3 次。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)Bcl-2、BAX 蛋白的表達(dá)

提取各組VSMCs 的蛋白質(zhì),配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠(10%),加樣20 μg 蛋白質(zhì),進(jìn)行電泳1.5 h(95 V 恒壓)。 后轉(zhuǎn)膜1 h(恒壓95 V),洗膜3 次,牛清(5%)封閉1 h。 加入一抗稀釋液(BAX 1 ∶2000,Bcl-2 1 ∶1000,GAPDH 1 ∶5000),4℃孵育過夜,次日加二抗稀釋液(1 ∶5000),37℃孵育1 h。使用蛋白成像系統(tǒng)照膜,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,正態(tài)分布的計(jì)量資料結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高磷對(duì)VSMCs 增殖凋亡的影響

2.1.1 VSMCs 的原代培養(yǎng)及細(xì)胞鑒定

VSMCs 原代培養(yǎng)第3 天,即有血管平滑肌細(xì)胞從組織塊周圍爬出,長(zhǎng)至第7 天,組織塊周圍的細(xì)胞相互融合在一起,平行排列、呈束狀,部分重疊在一起,呈“峰-谷”狀生長(zhǎng)。 單個(gè)細(xì)胞呈梭形、不規(guī)則形,以梭形為主,細(xì)胞核為卵圓形。 細(xì)胞SM22α 免疫組化染色可見細(xì)胞漿內(nèi)呈棕黃色,胞質(zhì)內(nèi)的肌動(dòng)蛋白被染成棕黃色,呈絲狀沿細(xì)胞長(zhǎng)軸平行分布細(xì)胞核為藍(lán)色,SM22α 染色為陽(yáng)性,表明細(xì)胞為血管平滑肌細(xì)胞,見圖1。

注:A:原代培養(yǎng)第3 天的組織塊及爬出的血管平滑肌細(xì)胞;B:原代培養(yǎng)第7 天的組織塊及爬出的血管平滑肌細(xì)胞;C:血管平滑肌細(xì)胞SM22α 的免疫組化染色,呈棕黃色為陽(yáng)性。圖1 VSMCs 的原代培養(yǎng)及細(xì)胞鑒定Note.A, Tissue block and crawled vascular smooth muscle cells on the 3rd day of primary culture.B, Tissue block and crawled vascular smooth muscle cells on the 7th day of primary culture.C, Immunohistochemical staining of SM22α, a vascular smooth muscle cell, was brown and positive.Figure 1 Primary culture and cell identification of VSMCs

2.1.2 高磷對(duì)大鼠VSMCs 凋亡的影響

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,與正常組比較,高磷組細(xì)胞凋亡顯著增多(t=-12.841,P<0.001),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見圖2。

2.1.3 高磷對(duì)大鼠VSMCs 增殖的影響

MTT 結(jié)果顯示:與正常組比較,高磷組細(xì)胞增殖能力于12、24、36、48 h 均顯著降低(P<0.05)。高磷組與正常組比較,0、12、24、36、48 h 分別為(t=0.105,P=0.921,t=13.03,P<0.001,t=16.892,P<0.001,t=12.659,P<0.001,t=18.049,P<0.001),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見圖3。

2.1.4 高磷對(duì)BAX、Bcl-2 表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示,高磷組VSMCs 促凋亡基因BAX 上調(diào)(t=-4.727,P=0.009)、抑凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)明顯下降(t=-14.872,P<0.001),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見圖4。

2.2 高磷對(duì)大鼠VSMCs miR-30b 表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示,與正常組比較,高磷組VSMCs miR-30b 的表達(dá)明顯下降(1.00±0.00 vs 0.387±0.05,t=19.497,P<0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),提示高磷能夠抑制miR-30b 的表達(dá),見圖5。

注:A:正常組與高磷組的流式結(jié)果;B:正常組與高磷組凋亡細(xì)胞百分比。 與正常組相比,???P<0.001。 圖2 兩組血管平滑肌細(xì)胞的凋亡情況(n=3)Note.A, Flow results of normal group and high phosphorus group.B, Percentage of apoptotic cells in normal group and high phosphorus group.Compared with normal group,???P<0.001.Figure 2 Apoptosis of vascular smooth muscle cells in two groups

注:A:各組細(xì)胞的MTT 結(jié)果;B:各組細(xì)胞不同時(shí)間段的顯微鏡下照片。 與正常組相比,???P<0.001。圖3 兩組血管平滑肌細(xì)胞的增殖情況(n=3)Note.A, MTT results of cells in each group.B, Microscopic photos of cells in each group at different time periods.Compared with normal group,???P<0.001.Figure 3 Proliferation of vascular smooth muscle cells in two groups

2.3 miR-30b 對(duì)VSMCs 增殖凋亡的影響

2.3.1 miR-30b 低表達(dá)對(duì)VSMCs 凋亡的影響

流式結(jié)果顯示,與正常組比較,inhibitor-30b 組VSMCs 凋亡增多(P<0.001),與inhibitor-NC 組比較,inhibitor-30b 組VSMCs 凋亡增多(P<0.001)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),提示miR-30b 低表達(dá)能夠促進(jìn)VSMCs 凋亡,見圖6。

2.3.2 miR-30b 低表達(dá)對(duì)VSMCs 增殖的影響

MTT 結(jié)果顯示:與正常組和inhibitor-NC 組比較,inhibitor-30b 組細(xì)胞增殖能力于12、24、36、48 h均顯著降低(P<0.05)。 正常組和inhibitor-NC 組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 見圖7。

注:與正常組相比,??P<0.01,???P<0.001。圖4 兩組血管平滑肌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況(n=3)Note.Compared with normal group, ??P<0.01,???P<0.001.Figure 4 Expression of vascular smooth muscle cells related proteins in two groups

注:與正常組相比,???P<0.001。圖5 兩組血管平滑肌細(xì)胞的miR-30b 的表達(dá)(n=3)Note.Compared with normal group,???P<0.001.Figure 5 Expression of miR-30b in vascular smooth muscle cells of the two groups

注:與正常組相比,???P<0.001;與inhibitor-NC 組相比, ###P<0.001。圖6 各組血管平滑肌細(xì)胞的凋亡情況(n=3)Note.Compared with normal group,???P<0.001.Compared with inhibitor-NC group, ###P<0.001.Figure 6 Apoptosis of vascular smooth muscle cells in each groups

2.3.3 miR-30b 低表達(dá)對(duì)BAX、Bcl-2 表達(dá)的影響

Western blot 印跡結(jié)果結(jié)果顯示,inhibitor-30b組VSMCs 促凋亡基因BAX 上調(diào)(P< 0.01)、抑凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)明顯下降(P<0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見圖8。

2.3.4 miR-30b 高表達(dá)對(duì)VSMCs 凋亡的影響

流式結(jié)果顯示,與高磷組比較,高磷-mimic-30b組VSMCs 凋亡減少(P<0.01),與高磷-mimic-NC 組比較,高磷-mimic-30b 組VSMCs 凋亡減少(P<0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),提示miR-30b 高表達(dá)能夠抑制VSMCs 凋亡,見圖9。

2.3.5 miR-30b 高表達(dá)對(duì)BAX、Bcl-2 表達(dá)的影響

Western blot 印跡結(jié)果顯示,與高磷組和高磷-mimic-NC 組比較,高磷-mimic-30b 組VSMCs 促凋亡基因BAX 下調(diào)、抑凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)明顯上調(diào),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見圖10。

注:與正常組相比, ?P<0.05;與inhibitor-NC 組相較, #P<0.05。圖7 各組血管平滑肌細(xì)胞的增殖情況Note.Compared with normal group, ?P < 0.05.Compared with inhibitor-NC group, #P<0.05.Figure 7 Proliferation of vascular smooth muscle cells in each groups

注:a:正常組;b:inhibitor-NC 組;c:inhibitor-30b 組。 與正常組相比,??P<0.01;與inhibitor-NC 組比較, ##P<0.01。圖8 各組血管平滑肌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況(n=3)Note.a, Normal group.b, Inhibitor-NC group.c, Inhibitor-30b group.Compared with normal group, ??P<0.01.Compared with inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 8 Expression of vascular smooth muscle cell related proteins in each groups

注:與高磷組相比,??P<0.01;與高磷-mimic-NC 組相比, ##P<0.01。圖9 miR-30b 高表達(dá)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響(n=3)Note.Compared with High phosphorus group group, ??P<0.01.Compared with High phosphorus-mimic-NC group, ??P<0.01.Figure 9 Effect of miR-30b overexpression on apoptosis of vascular smooth muscle cells

注:a:高磷組;b:高磷-mimic-NC 組;c:高磷-mimic-30b 組。 與高磷組相比, ?P<0.05;與高磷-mimic-NC 組相比, #P<0.05。圖10 miR-30b 高表達(dá)對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=3)Note.a, High phosphorus group.b, High phosphorus-mimic-NC group group.c, High phosphorus-mimic-30b group.Compared with High phosphorus group, ?P<0.05.Compared with High phosphorus-mimic-NC group group, ?P<0.05.Figure 10 Effect of miR-30b overexpression on expression of related proteins

3 討論

心血管疾病死亡率增高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素是血管鈣化[7]。 而細(xì)胞凋亡是調(diào)控血管鈣化的重要機(jī)制之一[8]。 而參與細(xì)胞凋亡的機(jī)制有多種,高磷血癥是導(dǎo)致血管中膜鈣化的重要危險(xiǎn)因素之一[9],而VSMCs 是血管中膜的重要組成成分。 因此本研究采用大鼠VSMCs,給予高磷刺激,探究血管平滑肌細(xì)胞凋亡和血管鈣化的發(fā)生機(jī)制。 本研究結(jié)果顯示,高磷可導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡,其機(jī)制可能是通過下調(diào)miR-30b 表達(dá),促進(jìn)凋亡蛋白BAX表達(dá),抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá),進(jìn)而引起血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生了凋亡。

本研究給予高磷刺激,觀察細(xì)胞增殖凋亡情況。 MTT 結(jié)果提示高磷刺激的血管平滑肌細(xì)胞增殖顯著減弱,流式檢測(cè)結(jié)果提示高磷刺激的血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生了凋亡。 有研究表明,高磷可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡,與本研究結(jié)果一致[10]。 高磷誘導(dǎo)發(fā)生凋亡的血管平滑肌細(xì)胞中miR-30b 表達(dá)顯著降低,促進(jìn)凋亡蛋白BAX 表達(dá)顯著升高,抑凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)顯著降低。 表明miR-30b 參與了高磷誘導(dǎo)的VSMCs 的凋亡過程。

miRNAs 是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA,長(zhǎng)約18~24 個(gè)核苷酸,具有調(diào)控功能,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程調(diào)控血管鈣化[11]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA30 家族參與調(diào)控血管鈣化[12-13]。有關(guān)人結(jié)直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)miR-30b 可誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1 的停止和細(xì)胞凋亡[14]。 有關(guān)人主動(dòng)脈瓣的研究發(fā)現(xiàn)miR-30b 是主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的多功能調(diào)節(jié)器[6]。 Xu 等[15]在人肺成纖維細(xì)胞WI-38 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,下調(diào)miR-30b 后人肺成纖維細(xì)胞WI-38 細(xì)胞的BAX 表達(dá)升高,凋亡增加。 有研究證實(shí),BAX 被激活并轉(zhuǎn)移到線粒體,引起線粒體外膜通透化,導(dǎo)致細(xì)胞破壞,誘導(dǎo)凋亡[16]。 BAX 和Bcl-2 是一對(duì)正負(fù)凋亡調(diào)節(jié)因子,BAX 起促進(jìn)凋亡作用,Bcl-2 起抗凋亡作用[17]。 本研究為探究miR-30b 與VSMCs 凋亡的關(guān)系,給予轉(zhuǎn)染miR-30b 的抑制物,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-30b 的抑制物后,流式檢測(cè)結(jié)果及MTT 顯示,VSMCs 凋亡細(xì)胞增多、增殖顯著降低;促凋亡蛋白BAX 上調(diào)、抑凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)明顯下降,表明miR-30b 抑制物能夠上調(diào)BAX,下調(diào)Bcl-2,促進(jìn)了VSMCs 發(fā)生凋亡。

綜上,本研究在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高磷可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡,可能機(jī)制是通過抑制miR-30b 表達(dá),促進(jìn)BAX 表達(dá),抑制Bcl-2 表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致VSMCs 發(fā)生凋亡。