吳文棋莊旭輝王姝晨李靜靜王 霞王 勇馬武華?

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州 510006;2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院麻醉科,廣州 510000;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科,廣州 510006;4.晉城市人民醫(yī)院麻醉科, 山西 晉城 048000)

支氣管哮喘(bronchial asthma)是在兒童及成人中最常見(jiàn)的慢性非傳染性疾病之一, 據(jù)統(tǒng)計(jì)全球共有3.34 億哮喘患者[1]。 流行病學(xué)顯示我國(guó)成人及兒童哮喘發(fā)病率均呈逐年上升趨勢(shì), 給醫(yī)療系統(tǒng)及社會(huì)都造成了巨大負(fù)擔(dān)[2]。 氣道重塑(airway remodeling)是慢性哮喘的重要病理特征, 是導(dǎo)致哮喘患者持續(xù)氣道阻塞, 糖皮質(zhì)激素等治療不敏感的重要因素[3-4]。 已有大量研究證實(shí), 在支氣管哮喘患者中, 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在氣道重塑的發(fā)展進(jìn)程中起關(guān)鍵作用[5-6]。 因此, 尋找有效的干預(yù)目標(biāo)及靶標(biāo)分子來(lái)抑制支氣管上皮細(xì)胞EMT 進(jìn)程, 以改善氣道重塑并提高糖皮質(zhì)激素類藥物的敏感性, 對(duì)改善支氣管哮喘患者疾病轉(zhuǎn)歸及生活質(zhì)量至關(guān)重要。

絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 信號(hào)通路包含3 種不同的級(jí)聯(lián)通路, 這些級(jí)聯(lián)根據(jù)其MAPK 關(guān)鍵蛋白命名, 包括細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶 (extracellular signalrelated kinases, ERK)、Jun 氨基末端激酶 (Jun Nterminal kinase, JNK)、和p38-MAPK。 據(jù) 報(bào) 道, ERK/MAPK 通路與細(xì)胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡有關(guān)[7]。 有研究報(bào)道ERK/MAPK 作為關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與各類纖維化疾病中的EMT 進(jìn)程[8-9]。 本研究旨在驗(yàn)證ERK/MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在哮喘氣道重塑模型/支氣管上皮細(xì)胞EMT 進(jìn)程中的激活情況, 并探討ERK/MAPK 抑制劑PD98059對(duì)該進(jìn)程的影響, 為通路抑制劑的臨床應(yīng)用積累基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B(購(gòu)于美國(guó)生物標(biāo)準(zhǔn)品資源中心)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于Gibco 公司;重組 TGF-β1 購(gòu) 于 peprotec 公 司; CCK-8 試 劑MedChemExpress 公 司、 PD98059 購(gòu) 于MedChemExpress 公司;Edu 細(xì)胞增殖試劑盒、Cy3 抗兔IgG 購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;transwell遷移板購(gòu)于Corning 公司;vimentin 一抗、α-SMA 一抗、GAPDH 一抗購(gòu)于CST 公司;p-ERK1/2 一抗、ERK1/2 一抗購(gòu)于上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司。

Multiskan GO 酶標(biāo)儀購(gòu)于賽默飛公司;BGgdsAUTO710PRO 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)于北京百晶生物技術(shù)有限公司;IX73 倒置熒光顯微鏡顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯株式公社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理

將BEAS-2B 細(xì)胞培養(yǎng)于10%FBS 和1%青/鏈霉素配置的DMEM 高糖培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)條件37℃、5% CO2;重組TGF-β1 使用10 mmol/L citric acid 溶解配置為50 μg/mL 溶液, 后用細(xì)胞培養(yǎng)液配置為5 ng/mL 溶液。 PD98059 使用DMSO 溶解為40 mmol/L 溶液儲(chǔ)存于-20℃冰箱, 并用細(xì)胞培養(yǎng)液配置為2.5、5、10、20、40 μmol/L 溶液。 實(shí)驗(yàn)分組:正常組(Con 組), 模型組(TGF-β1 5 ng/mL), 干預(yù)組(TGF-β1 5 ng/mL +PD98059 2.5~40 μmol/L)。

1.3.2 細(xì)胞免疫熒光觀察細(xì)胞α-SMA 蛋白表達(dá)定位情況

將BEAS-2B 細(xì)胞以3000 個(gè)/孔接種于96 孔板, 設(shè)置正常組, 模型組(TGF-β1 5 ng/mL), 培養(yǎng)24 h 后, 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同的處理干預(yù)72 h。 棄去培養(yǎng)液, 4%多聚甲醛固定10 min, 使用封閉液室溫孵育1 h, 加入兔抗多克隆抗體(1 ∶200)過(guò)夜, Cy3 抗兔IgG 孵育1 h, DPAI 孵育10 min 后在倒置熒光顯微鏡顯微鏡下采集分析圖像。

1.3.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力

將BEAS-2B 細(xì)胞以3000 個(gè)/孔接種于96 孔板, 設(shè)置空白組、正常組(Con 組)、模型組(TGF-β1 5 ng/mL), 干預(yù)組(TGF-β1 5 ng/mL+PD98059 2.5~40 μmol/L, 共5 個(gè)濃度梯度)。 培養(yǎng)24 h, 待細(xì)胞貼壁后更換為含5 ng/mL TGF-β1 及2.5、5、10、20、40 μmol/L PD98059 的細(xì)胞培養(yǎng)液, 設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔, 在培養(yǎng)箱孵育72 h。 處理結(jié)束后, 每組每孔加入CCK-8 10 μL, 在培養(yǎng)箱孵育2 h 后在酶標(biāo)儀下測(cè)450 nm 下吸光度值, 細(xì)胞存活率(%)= ((A 實(shí)驗(yàn)孔-A 空白孔)/(A 對(duì)照孔-A 空白孔))×100%。

1.3.4 Edu 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

將BEAS-2B 細(xì)胞以3000 個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板, 設(shè)置正常組, 模型組(TGF-β1 5 ng/mL), 干預(yù)組(TGF-β1 5 ng/mL+PD98059 10 μmol/L), 培養(yǎng)24 h后, 參考課題組以往研究及前人研究對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同的處理干預(yù)72 h[10-11]。 干預(yù)結(jié)束后每組每孔加入50 μmol/L Edu 試劑, 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在培養(yǎng)箱孵育4 h。 嚴(yán)格按照Edu 細(xì)胞增殖試劑盒說(shuō)明書操作, 其結(jié)果由Edu 陽(yáng)性細(xì)胞(綠色)與hochest 33442 陽(yáng)性細(xì)胞(藍(lán)色)的比率表示細(xì)胞增殖率。

1.3.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

細(xì)胞分組及處理同1.3.4, 將BEAS-2B 細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6 孔板, 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同的處理干預(yù)72 h。 將處理完畢的細(xì)胞用胰酶消化后, 用無(wú)血清培養(yǎng)基配成每毫升7000 個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液, 加入300 μL 細(xì)胞懸液到Transwell 小室, 下室加入含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液700 μL, 培養(yǎng)箱孵育12 h 后, 將小室風(fēng)干, 結(jié)晶紫染色15 min, 在顯微鏡觀察并隨機(jī)計(jì)數(shù)3 個(gè)視野的細(xì)胞。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)EMT 標(biāo)志蛋白及ERK/MAPK 蛋白表達(dá)情況

細(xì)胞分組及干預(yù)同1.3.5, 每孔加入RIPA 裂解液, 細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞, 4℃ 15000 r/min 離心。取上清液, 采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。 加入5× Lodding Buffer 后煮沸使蛋白變性。 配置SDS-PAGE凝膠。 經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫下使脫脂奶粉封閉1 h后, 4℃孵育一抗過(guò)夜, 室溫孵育二抗1 h, 化學(xué)發(fā)光儀發(fā)光成像, Image J 分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 數(shù)據(jù)使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行展示。各組正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)。 如實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布,檢驗(yàn)多組數(shù)據(jù)組間差異采用單因素方差分析(One way ANOVA)。 當(dāng)方差齊,多組間兩兩組間比較采用LSD 檢驗(yàn), 方差不齊時(shí)采用dunnett’sT3 檢驗(yàn)。P<0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α-SMA 蛋白在支氣管上皮細(xì)胞及氣道重塑/上皮間質(zhì)化細(xì)胞模型表達(dá)、定位

結(jié)果如圖1 所示, 與正常組相比, TGF-β1(5 ng/mL)可使細(xì)胞α-SMA 表達(dá)增多, 表現(xiàn)為細(xì)胞胞質(zhì)紅色熒光更亮更密。 結(jié)果提示TGF-β1 成功誘導(dǎo)BEAS-2B 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型。

2.2 PD98059 及TGF-β1 對(duì)支氣管上皮細(xì)胞存活率的影響

結(jié)果如圖2 所示, 與正常組相比, 模型組的細(xì)胞存活率沒(méi)有影響(P>0.05)。 與模型組相比, PD98059 與在2.5、5、10、20 μmol/L 濃度與TGF-β1共孵育處理對(duì)細(xì)胞存活率沒(méi)有影響(P>0.05)。 而PD98059 濃度增加到40 μmol/L 時(shí), 可對(duì)BEAS-2B活性產(chǎn)生明顯抑制作用(P<0.05)。

注:與正常組相比, ?P<0.05。圖2 PD98059 及TGF-β1 對(duì)支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞存活率的影響Note.Compared with Con group, ?P<0.05.Figure 2 Effect of PD98059 and TGF-β1 on the survival rate of bronchial epithelial cells

2.3 PD98059 及TGF-β1 對(duì)支氣管上皮細(xì)胞增殖能力的影響

為排除增殖對(duì)細(xì)胞遷移的結(jié)果造成的影響, 使用Edu 增殖試劑盒檢測(cè)細(xì)各組細(xì)胞增殖情況。 結(jié)果如圖3 所示:正常組Edu 陽(yáng)性率為(44.42±2.42), 模型組Edu 陽(yáng)性率為(42.01±6.93), 干預(yù)組Edu 陽(yáng)性率為(41.43±4.29)。 3 組間Edu 陽(yáng)性率無(wú)顯著差異(P>0.05)。 結(jié) 果 提 示TGF-β1 及PD98059 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞增殖無(wú)影響(表1)。

表1 各組細(xì)胞增殖能力比較(±s)Table 1 Comparison of proliferation ability among groups

表1 各組細(xì)胞增殖能力比較(±s)Table 1 Comparison of proliferation ability among groups

組別Groups陽(yáng)性細(xì)胞率(%)Edu positive cell rate F P正常組Con group 44.42±2.42模型組TGF-β1 group 42.01±6.93干預(yù)組TGF-β1+PD98059 group 41.43±4.29 0.314 0.742

圖3 PD98059 及TGF-β1 對(duì)支氣管上皮細(xì)胞增殖能力的影響Figure 3 Effect of PD98059 and TGF-β1 on the proliferation of bronchial epithelial cells

2.4 PD98059 及TGF-β1 對(duì)支氣管上皮細(xì)胞增殖能力的影響

結(jié)果如圖4 所示:與正常組相比, 模型組細(xì)胞遷移數(shù)明顯增加(P<0.05), 與模型組相比, PD98059干預(yù)后BEAS-2B 細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少(P<0.05)。結(jié)果表明PD98059 能抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移(表2)。

表2 各組細(xì)胞遷移能力比較 (±s)Table 2 Comparison of migration ability among groups

表2 各組細(xì)胞遷移能力比較 (±s)Table 2 Comparison of migration ability among groups

注:與正常組相比, ?P<0.05;與模型組相比, #P<0.05。Note.Compared with Con group, ?P<0.05.Compare with TGF-β1 group, #P<0.05.

組別Groups遷移率(%)Migration rate F P正常組Con group 100.00±0.00模型組TGF-β1 group 231.47±19.65?干預(yù)組TGF-β1+PD98059 group 157.76±6.46#91.321 <0.001

圖4 PD98059 及TGF-β1 對(duì)支氣管上皮細(xì)胞遷移能力的影響Figure 4 Effect of PD98059 and TGF-β1 on the migration of bronchial epithelial cells

2.5 PD98059 及TGF-β1 對(duì)支氣管上皮細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白和ERK/MAPK 通路蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖5 所示:與正常組相比, 模型組細(xì)胞vimentin、α-SMA 和p-ERK 表達(dá)升高(P<0.05), 與模型組相比, PD98059 干預(yù)后BEAS-2B 細(xì)胞vimentin、α-SMA 和p-ERK 表達(dá)下降(P<0.05)。 結(jié)果表明PD98059 能抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT 和ERK/MAPK 通路激活(表3)。

圖5 PD98059 及TGF-β1 對(duì)支氣管上皮細(xì)胞EMT 標(biāo)志蛋白和ERK/MAPK 通路蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of PD98059 and TGF-β1 on the expression of EMT protein and ERK/MAPK pathway protein in bronchial epithelial cells

表3 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比較(±s)Table 3 Comparison of protein expression level among groups

表3 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比較(±s)Table 3 Comparison of protein expression level among groups

注:與正常組相比, ?P<0.05;與模型組相比, #P<0.05。Note.Compared with Con group, ?P<0.05.Compare with TGF-β1 group, #P<0.05.

組別Groups Vimentin α-SMA p-ERK正常組Con group 0.47±0.01 0.43±0.15 0.16±0.09模型組TGF-β1 group 1.09±0.08? 1.36±0.05? 0.64±0.10?干預(yù)組TGF-β1+PD98059 group 0.85±0.01# 0.77±0.07# 0.35±0.11#F 114.680 62.232 16.411 P 0.000 0.000 0.004

3 討論

本研究以TGF-β1 誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞EMT模型, 檢測(cè)TGF-β1 干預(yù)及TGF-β1 及PD98059 聯(lián)合干預(yù)BEAS-2B 細(xì)胞的細(xì)胞活力、增殖能力、遷移能力及EMT 進(jìn)程標(biāo)志蛋白表達(dá)情況。

本研究參考Doerner 等[10]報(bào)道建立TGF-β1 誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型, 模擬臨床患者哮喘氣道重塑的情況。 觀察到BEAS-2B 細(xì)胞α-SMA 蛋白、vimentin 蛋白表達(dá)增多, 細(xì)胞遷移能力增加而且不影響細(xì)胞增殖, 提示細(xì)胞造模成功。 在TGF-β1 造模后,加入ERK/MAPK 通路抑制劑PD98059 作為干預(yù)組,在文獻(xiàn)報(bào)道中,PD98059在BEAS-2B 上的干預(yù)劑量從10 ~ 30 μmol/L 不等[12-14],且Tian 等[13]報(bào)道PD98059 在30 μmol/L時(shí)已經(jīng)對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生抑制作用。 因此,本研究設(shè)置濃度梯度檢測(cè)PD98059 對(duì) BEAS-2B 細(xì)胞活性的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD98059 濃度增加到40 μmol/L時(shí), 可對(duì)BEAS-2B 活性產(chǎn)生明顯抑制作用。 為控制PD98059 對(duì)細(xì)胞活性抑制而可能帶來(lái)的影響, PD98059 采用10 μmol/L 濃度用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一種生物學(xué)過(guò)程, 上皮細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞, 失去細(xì)胞間的緊密連接, 獲得的遷移能力和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力, 伴隨著E-cadherin 的減少以及間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源蛋白:vimentin和α-SMA 等的增加[15]。 其中α-SMA 負(fù)責(zé)構(gòu)成間質(zhì)細(xì)胞纖維的主要成分, 參與細(xì)胞骨架的重塑[16]。近年來(lái), 隨著對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化研究的不斷深入, 由TGF-β1 誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在哮喘患者氣道重塑中的作用愈發(fā)受到關(guān)注[17-18]。 TGF-β1 作為在炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)因素中的核心因子, 已被證實(shí)與哮喘炎癥與重塑起關(guān)鍵作用[19]。

氣道重塑作為慢性哮喘的重要病理特征, 其典型變化包括上皮損傷、粘液腺增生、上皮下基底膜沉積、血管生成和氣道平滑肌增加[20]。 氣道重塑是長(zhǎng)期過(guò)敏源暴露及氣管炎性損傷的結(jié)果[21], 是導(dǎo)致哮喘患者激素治療不敏感的重要因素。 因此探索氣道重塑發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及潛在的治療靶點(diǎn)是支氣管哮喘研究領(lǐng)域亟需解決的重難點(diǎn)。

在本研究中, 我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1 誘導(dǎo)BEAS-2B中p-ERK1/2 表達(dá)明顯上升, 通過(guò)使用PD98059 抑制EKR/MAPK 可以抑制細(xì)胞遷移、α-SMA 蛋白、vimentin 蛋白的表達(dá), 進(jìn)而抑制EMT 進(jìn)程。 ERK/MAPK 通路是所有 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的信號(hào)級(jí)聯(lián)通路, 其中分為ERK1~5 五個(gè)亞族, 而ERK1/2 途徑是目前研究最火熱的MAPK 途徑[22]。ERK1/2 亞族能被生長(zhǎng)因子或者激素刺激并激活Raf/MEK/ERK 級(jí)聯(lián)通路, 最終激活下游MAPK 信號(hào)并且發(fā)生磷酸化入核, 導(dǎo)致相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄[23]。最近的研究發(fā)現(xiàn)抑制ERK/MAPK 通路可以在癌癥、纖維化等疾病中發(fā)揮治療作用。 此外, 考慮到ERK/MAPK 通路參與細(xì)胞增殖生長(zhǎng)過(guò)程[24], 因此本研究篩選出對(duì)細(xì)胞活力與增殖能力無(wú)影響的藥物濃度參與Transwell 實(shí)驗(yàn), 證明了PD98059 抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的遷移細(xì)胞數(shù)增多與抑制細(xì)胞增殖無(wú)關(guān), PD98059 通過(guò)抑制BEAS-2B 遷移能力導(dǎo)致遷移細(xì)胞數(shù)的減少。 本研究結(jié)果提示ERK 通路在支氣管上皮細(xì)胞EMT 中發(fā)揮重要作用, 通過(guò)抑制ERK/MAPK 通路介導(dǎo)的EMT 可能成為治療支氣管哮喘患者的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。 與之類似的是, 張愛(ài)芝等[25]研究發(fā)現(xiàn)激活大鼠平滑肌細(xì)胞可以有效促進(jìn)cyclinD1 和氣道重塑。 Zha 等[26]報(bào)道PD98059可以通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞的EMT 進(jìn)程, 減輕腎纖維化。 以上研究與本研究結(jié)果一致, 說(shuō)明了PD98059 通過(guò)抑制EMT 進(jìn)程在治療哮喘氣道重塑中的潛在價(jià)值。

本研究的不足之處在于我們的實(shí)驗(yàn)僅在ERK/MAPK 通路上對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞EMT 進(jìn)行研究與分析, 但事實(shí)上, MAPK 通路中P38 通路及JNK 通路也參與了該過(guò)程[5]。 我們計(jì)劃在未來(lái)拓展研究, 試圖更加充分的認(rèn)識(shí)氣道重塑中EMT 的發(fā)展進(jìn)程。

綜上所述, 本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1 可能通過(guò)ERK/MAPK 通路促進(jìn)人支氣管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程, PD98059 可以通過(guò)抑制ERK/MAPK 通路的激活抑制支氣管上皮細(xì)胞EMT 進(jìn)程。