李 磊吳東良李尚點閻 玥史 琦李春雷李友林?

(1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029;2.中日友好醫(yī)院 中醫(yī)肺病二部,國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(肺病慢性咳喘),中醫(yī)藥防治過敏性疾病北京市重點實驗室(BZ0321),中日友好醫(yī)院呼吸中心,國家呼吸疾病臨床研究中心,北京 100029)

慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary emphysema, COPD)是全世界主要的呼吸系統(tǒng)健康問題,通常是由長期吸入有毒顆粒或氣體(如香煙煙霧),及宿主因素相互作用所致,其中至少80%病例是由吸入煙草煙霧引發(fā)[1],在工業(yè)國家甚至可達到95%以上[2]。 盡管COPD 是一種復雜的異質性疾病,主要特征是慢性氣道炎癥(支氣管炎)和/或肺氣腫、粘液堵塞、氣道感覺神經(jīng)敏感以及肺功能下降,但其早期癥狀不顯易被忽視,待其發(fā)展加重或并發(fā)癥發(fā)生方被識別,加之目前無有效阻止本病誘發(fā)或進展的治療方法,故其致殘率和死亡率高,在全球主要死因中位列第三[3]。 目前估計COPD 已影響全球3.28 億人,在未來20 年內,它將成為主要的死亡原因之一[4],盡管構成了主要的公共衛(wèi)生問題,但相關研究仍缺乏資金[5]。 COPD 防治當中的許多疾病負擔和醫(yī)療保健占用都與其合并癥和感染病毒或細菌惡化的管理有關[6]。 應用吸入糖皮質激素和支氣管擴張藥有益于改善COPD患者癥狀和延緩病情惡化,但臨床療效有限,無法逆轉組織病變或改變驅動慢性進展的因素,并且對肺功能下降的影響有限[7]。 加深對COPD 發(fā)生和發(fā)展的分子途徑和反應的理解,將有助于急需的有效治療藥物的開發(fā)[8]。 然而,獲取COPD 患者全程信息尤為困難,并且多數(shù)臨床病例通常僅代表疾病過程中特定時間的“快照”[6],故本目標的實現(xiàn)需要建立于動物研究基礎之上,亟需建立符合臨床實際情況且準確反映疾病病理生理的COPD 動物模型。因此,本文借助數(shù)據(jù)挖掘方式,對最近10 年涉及COPD 模型建立的文獻進行檢索并整理分析,以期為COPD 模型的開發(fā)所涉及的實驗動物的特征選擇,造模方法與周期及結局評價等多重建模因素提供參考。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

以“慢性阻塞性肺疾病”合并“動物模型”為主題詞在中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫中進行搜索,時間為2011 年1 月~2021 年7 月22 日。 收集COPD 動物模型相關研究的文獻。 總共523 篇文獻,其中知網(wǎng)224 篇,萬方299 篇,刪除重復后剩余455 篇,通過閱讀題目及摘要,篩選出227 篇,再經(jīng)詳細查閱后刪除綜述類、評論類及重復文獻或無法提取數(shù)據(jù)的文獻,剩余176 篇。

1.2 篩選標準

納入標準:在檢索范疇內,選取COPD 動物模型的實驗文獻,語種不限;排除標準:綜述類文獻,會議論文和學位論文,重復發(fā)表的僅取1 次。 另外,聯(lián)合的疾病或證型不限,給予藥物干預與否不限,少數(shù)信息不全(如動物年齡、體重等)的文獻亦納入分析,最終從523 篇文獻中納入176 篇有效文獻,包括17 篇英文文獻,159 篇中文文獻。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗動物名稱、種類等均參照《實驗動物和動物實驗技術》進行規(guī)范,統(tǒng)一處理具有不同名稱的動物種類。 將收集的文獻中涉及的動物種別、造模方法與周期、檢測指標、給藥時間、陽性對照藥與證候情況等以統(tǒng)一格式錄入Microsoft Excel 2013,采取雙人錄入方法,確保信息的質量控制,并進行整理歸納,建立COPD 動物模型的數(shù)據(jù)庫。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用Microsoft Excel 2013 對COPD 動物模型的數(shù)據(jù)庫中的信息進行統(tǒng)計分析,定量或定性歸納造模要素,由于部分信息不全或未進行詳細描述,故各項數(shù)據(jù)的總和可能不等,以具體統(tǒng)計結果為準。

2 結果

2.1 實驗動物種別

將176 篇有效文獻中應用的實驗動物種類及性別進行匯總統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),主要包括3 類實驗動物,即大鼠、小鼠、小型豬,其中使用最多的是SD 大鼠(83次,47.16%),其次為Wistar 大鼠(59 次,33.52%),C57 小鼠(14 次,7.95%),豚鼠(6 次,3.41%),小型豬(4 次,2.27%),BALB/c 小鼠(3 次,1.70%),其他小鼠包括A/J 小鼠、KM 小鼠、敘利亞金黃倉鼠和金黃地鼠,共5 次(2.84%),未知大鼠(2 次,1.14%);實驗動物性別以雄性為主,共140 次,占比79.55%,雌雄各半(雌雄同用)或雌性則較少,分別為24 次和8 次,占比13.64%和4.55%,4 項研究未對性別進行描述,見表1。

表1 慢阻肺模型實驗動物種別頻數(shù)分布Table 1 Types distribution of experimental animals for COPD

2.2 造模周期與方式

在176 篇文獻中,共有175 篇文獻明確寫有造模方法,將其進行分類規(guī)范后統(tǒng)計得出,造模方式中應用最多的是煙霧暴露聯(lián)合脂多糖(91 次,52%),其他>3 次的造模方式主要有4 種,包括單純煙霧暴露34 次(19.43%),脂多糖6 次(3.43%),煙霧暴露聯(lián)合肺炎克雷伯桿菌5 次(2.86%),煙霧暴露聯(lián)合彈性蛋白酶4 次(2.29%),詳見表2。

表2 慢阻肺造模方式分類及使用頻次Table 2 Classification and frequency of use of COPD models

在應用煙霧暴露的147 篇文獻中,48 篇未對煙熏箱進行描述,剩余文獻中使用自制煙熏箱84 次(84.85%),使用非自制煙熏箱15 次(15.15%),其中兩項應用僅鼻暴露系統(tǒng)[9-10]。

COPD 作為常見慢性病之一,造模周期(model period, MP)較長,可分為30 d 以內、30~60 d、60~90 d、90~120 d、120~150 d、150 d 6 個時間段,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),造模周期多在3 個月內,其中MP≤30 d 最多,共75 次(42.61%),30 d < MP ≤ 60 d 和60 d< MP ≤ 90 d 均為36 次,各占比20.45%,見表3。

表3 慢阻肺模型造模周期Table 3 Modeling cycle of COPD model

2.3 檢測指標

將176 篇文獻中的全部檢測指標進行分類統(tǒng)計,若同一組織被用于檢測不同的指標,如肺組織既做病理檢測又做免疫組化,則分別進行統(tǒng)計;若同一組織被用于檢測多個同類型指標,如肺組織同時檢測IL-6、IL-8、TNF-α 等,則把這些指標統(tǒng)一歸屬于肺組織勻漿指標。 一般狀況包括皮毛、食量、活動度、精神狀態(tài)、舌象、爪色等宏觀特征,呼吸系統(tǒng)特征和體重單獨計數(shù)。 統(tǒng)計結果發(fā)現(xiàn),共有21 種不同類型的指標,累計頻數(shù)552 次,其中檢測較多的依次是肺組織病理(137 次,24.82%)、肺功能(79次,14.31%)、一般狀況(63 次,11.41%)、肺泡灌洗液(56 次,10.14%)、血清(46 次,8.33%)、肺組織勻漿(42 次,7.61%)等,詳見表4。

表4 慢阻肺模型檢測指標分類及使用頻次Table 4 Classification and frequency of use of COPD model test indicators

2.4 模型給藥時間、陽性對照藥及評估指標

將所有文獻歸納統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),共有89 項研究涉及給藥干預,但僅有46 項含有陽性對照藥,給藥時間選擇多為28 d(13 次,28.26%),其次為14 d(8 次,17.39%);陽性對照藥的應用方面較為繁雜,共涉及26 不同藥物,其中兩項研究應用了兩種陽性對照藥物,分別予以計數(shù),應用最多的陽性對照藥是氨茶堿(7 次),其次為地塞米松和固本咳喘片(各4次),見表5。

表5 慢阻肺模型給藥時間與陽性對照藥情況Table 5 Duration of drug administration and positive control drugs

在使用藥物及陽性對照藥物的文獻中,給藥效果的評估指標較多,其中使用頻次由多到少排名前五的依次是肺組織病理(28 次,60.87%)、肺組織免疫組 化(26 次, 56.52%)、 一 般 狀 況(22 次,47.83%)、肺功能(20 次,43.48%)、血清(19 次,41.30%),見表6。

表6 給藥后效果評估指標的分類及使用頻次Table 6 Classification and frequency of use of evaluation indexes after administration

2.5 模型證候造模情況

納入的文獻中僅有18 篇涉及證候造模,包括了7 個證型,即肺氣虛證、脾虛證、肺脾兩虛證、陰虛痰飲證、痰濕/熱證、痰瘀阻肺證、寒燥證,以虛證較多,其中造模頻次最高的證候是肺氣虛證,共8 篇,見圖1。

圖1 慢阻肺實驗動物模型證候造模情況Figure 1 Syndrome modeling of experimental animal model of COPD

3 討論

COPD 動物模型應是與人類COPD 臨床病癥特點高吻合度的疾病模型,但目前尚未完全實現(xiàn)。 造模的首要考慮因素為模型動物的選擇,動物種類方面涉及鼠類、兔子、豬、狗等[11]。 通過表1 可知,COPD 模型的建立多使用SD 大鼠、Wistar 大鼠和C57 小鼠。 既往研究發(fā)現(xiàn),大鼠體積和肺表面積較大故便于操作,煙霧暴露后易出現(xiàn)纖維化沉積,但其缺點在于與人類的遺傳相似性較低,單足體氣道結構,粘膜纖毛清除率較高,沒有杯狀細胞,粘膜腺很少[12-16],大鼠支氣管炎癥的介導物與人類不同,且對熏煙誘導的肺氣腫樣損傷的抵抗力較強[17];小鼠具有遺傳異質性,對肺損傷可出現(xiàn)多種反應,成本低,種類豐富,但限于專一經(jīng)鼻呼吸,體積小使肺參數(shù)測量困難,粘膜下腺數(shù)目少單足體氣道分支,難以復制重度COPD[18-21]。 Vlahos 等[22]學者綜合了繁殖周期、飼養(yǎng)成本、可操作性與基因信息等因素認為小鼠是最常見選擇,研究還發(fā)現(xiàn)小鼠性別對煙霧的耐受性差異明顯,雌性較雄性小鼠的對煙霧抵抗力差[23],若同一項研究中雌雄同用,造模后肺部損傷程度可能不同,故多數(shù)研究僅用雄性小鼠,這與本研究調查結果相一致。

理想的COPD 動物模型應再現(xiàn)人類疾病的主要特征[24],慢支和肺氣腫是其最主要特征。 由表2 得知,COPD 最常用的造模方式為煙霧暴露聯(lián)合脂多糖或單純煙霧暴露,前者更能模擬人類COPD 急性加重期的病理特點,后者與穩(wěn)定期基本特點相似[25]。 脂多糖是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要促炎性糖脂成分,有研究發(fā)現(xiàn)它與煙霧暴露聯(lián)合可引發(fā)氣道炎癥和肺功能的顯著改變[26],能較好復制感染引起的COPD 急性發(fā)作[27],這與COPD 的主要病因一致,即煙霧和氣道感染,而且經(jīng)鼻吸入脂多糖是一種模擬人類COPD 發(fā)育的方法,該方法表現(xiàn)出細菌定植和急性加重[15]。 與單純煙霧暴露的小鼠相比,應用脂多糖有助于在更短的時間內建立肺氣腫特征小鼠模型[28],并更好重現(xiàn)了COPD 的肺部炎癥特征,小氣道病變和氣道重塑更為明顯,病理生理改變與人類類似,更加符合本病自然發(fā)病過程[29]。 本研究還發(fā)現(xiàn)煙霧暴露時多選擇自制染毒箱,但其相關參數(shù)不明或描述甚少,如箱體體積、通風孔面積,以及煙霧中CO 含量、NO 含量、溫度和濕度等;同時,既往研究中對不同實驗動物或建模方法的成功率鮮有提及,這些因素影響了模型的穩(wěn)定性和可重復性,限制了模型規(guī)范化的形成。 在造模周期方面,整體上周期偏長,多在3 個月內,以30 d以內居多(表3),部分研究單純煙霧暴露周期長達6 個月或以上[30-31]。

COPD 模型應具備慢性支氣管炎、黏液分泌過多、小氣道重塑、肺氣腫、肺功能受損等特征,這些特征可從肺功能、肺組織病理、肺泡灌洗液、血清或肺組織勻等指標檢測中驗證。 臨床上1 秒率是人群COPD 確診的金標準,但其在動物模型評價方面的地位有待進一步深入探究。 雖然目前尚無統(tǒng)一模型判定標準,但幾乎所有研究均包括病理形態(tài)學指標,因其對氣道重塑和肺實質的破壞程度的敏感性比肺功能強[32],其中平均線性截距,破壞指數(shù)和凋亡指數(shù)尤為重要[33]。 本研究亦發(fā)現(xiàn),肺組織病理是模型評價應用最多的指標,其次為肺功能及動物一般狀況(表4),若3 者變化方向趨于一致,且變化情況與COPD 人群吻合度較高,則更能體現(xiàn)模型構建的成功性。

COPD 模型的建立最主要的目的之一即為開發(fā)新藥,故涉及給藥時間和陽性對照藥的選擇。 從表5 得知,目前研究中給藥時間多為28 和14 d,COPD屬慢性病,病程較長,故可探索延長給藥時間,當然,這與給藥劑量相關,因為不同藥物對機體發(fā)生作用的劑量和致毒效力不同。 嚴格來講,需經(jīng)過藥效學實驗、急性毒性實驗和長期毒性實驗來確定給藥劑量和時間,但很少有文獻述及給藥時間確立的緣由,故本結果須慎重解釋。 本研究結果提示,陽性對照藥之西藥多選用氨茶堿、地塞米松,中藥則多用固本咳喘片。 在中醫(yī)證候方面,研究涉及相對較多的是穩(wěn)定期虛證[34-35],即肺氣虛證、脾虛證和肺脾兩虛證(圖1)。 現(xiàn)有指南中涵蓋的證型未能全面復制于動物模型,且病證結合模型的評價指標缺乏特異性和穩(wěn)定性,不同證候判斷方面僅依靠癥狀,無法實現(xiàn)宏觀指標的等效替代,同時缺乏特異性微觀指標;再者,缺乏對病證結合模型的干預順序及穩(wěn)定性的探究,如先進行證候造模后進行COPD 造模,或二者顛倒,亦或同時進行,目前偏于先病后證,但臨床中COPD 患者在疾病形成前往往已有證候存在,因此有必要探索在煙霧暴露前進行證候造模因素的干預,查驗證候對COPD 模型建立的影響。 此外,還需考慮模型所處疾病分期,合并癥的建立情況及模型死亡率,畢竟現(xiàn)有文獻很少報道造模期間的實驗動物的死亡率。 臨床實踐中,COPD 分為急性加重期和穩(wěn)定期,但在模型評價方面缺乏本病不同時期的特異性指標,盡管部分研究[34,36-38]對此進行初步探索,但尚無定論。 目前造模方式往往難以達到急性期的狀態(tài),甚至僅達到穩(wěn)定期的1、2 級狀態(tài)[39]。

本文通過對最近10 年COPD 模型相關文獻數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),選用SD/Wistar 大鼠或C57 小鼠作為實驗動物,采用煙霧暴露聯(lián)合脂多糖滴注或單純煙霧暴露造模,周期在3 個月內,能夠有效提升COPD造模的成功率。 模型評價指標建議綜合肺組織病理、肺功能、一般狀況和肺泡灌洗液等結果。 當然,具體研究時當視研究目的、實驗條件等選用不同的造模方法。 總之,結合臨床研究獲得的知識,單用或聯(lián)用煙霧暴露的動物模型是尋找COPD 及其不同疾病時期或合并癥新療法的重要工具[6]。 期望通過本文的簡要闡述能為COPD 的模型建立和受試藥物評價提供一些方法學的參考。