劉金鳳，王曉玫#，李佳園，楊 雪，魏曉嘉，王雨青，呂 研，于佳禾，金重先，王春國，石晉麗*

酸棗仁-五味子配伍對抗焦慮作用的影響及指標(biāo)成分的腸吸收特性研究

劉金鳳1，王曉玫1#，李佳園1，楊 雪1，魏曉嘉1，王雨青1，呂 研1，于佳禾1，金重先1，王春國2*，石晉麗1*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，北京 102488

研究酸棗仁-五味子配伍前后的抗焦慮藥效變化及指標(biāo)成分斯皮諾素、五味子醇甲在焦慮模型大鼠小腸中的吸收特性變化。采用空瓶應(yīng)激（empty bottle stress，EBS）和孤養(yǎng)結(jié)合束縛應(yīng)激（restraint stress，RS）2種焦慮大鼠模型，通過曠場和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)評價酸棗仁-五味子配伍前后的抗焦慮藥效；大鼠離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)和在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)合HPLC法，測定配伍前后酸棗仁中斯皮諾素和五味子中五味子醇甲在焦慮模型大鼠十二指腸、空腸、回腸及整個小腸段的吸收情況。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明酸棗仁、五味子均能減少焦慮模型大鼠的焦慮樣行為，二者配伍后焦慮樣行為的減少更為顯著。在外翻腸囊實(shí)驗(yàn)中，五味子醇甲的吸收量比斯皮諾素約高1個數(shù)量級；配伍后斯皮諾素的吸收量下降，而五味子醇甲吸收量明顯增加，表現(xiàn)在十二指腸、空腸和總吸收量的增加，并且其在空腸和回腸中的穩(wěn)定性增加。在腸灌流實(shí)驗(yàn)中，給藥30 min內(nèi)，斯皮諾素基本完全吸收，但在酸棗仁單用時可能出現(xiàn)外排，配伍后外排減弱；給藥1 h內(nèi)，五味子醇甲基本完全吸收，未表現(xiàn)外排；配伍后斯皮諾素和五味子醇甲的吸收速率常數(shù)（a）和表觀滲透系數(shù)（app）均保持較高水平。酸棗仁-五味子配伍后抗焦慮藥效有所增強(qiáng)；配伍增加了斯皮諾素的溶出，減少了其外排，但降低了其吸收；配伍促進(jìn)了五味子醇甲的吸收，增加了其在空腸和回腸的穩(wěn)定性。從腸吸收屏障網(wǎng)絡(luò)的角度揭示酸棗仁、五味子抗焦慮藥效的發(fā)揮與其中的藥效成分斯皮諾素、五味子醇甲在小腸保持良好的吸收密不可分，酸棗仁與五味子配伍后抗焦慮作用的增強(qiáng)可能與提高五味子醇甲在空腸和回腸的穩(wěn)定性、增加五味子醇甲的吸收有關(guān)，這一結(jié)論為臨床用藥提供了科學(xué)依據(jù)。

腸吸收；焦慮癥；斯皮諾素；五味子醇甲；酸棗仁；五味子；配伍

焦慮癥（anxiety disorder）是一種以焦慮情緒為主的神經(jīng)疾病，以持續(xù)性的焦慮、緊張、驚恐不安等情緒為表現(xiàn)，并伴有自主神經(jīng)紊亂、肌肉緊張以及運(yùn)動不安等癥狀[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）的調(diào)查結(jié)果顯示，我國焦慮癥的12個月患病率為3.0%，終生患病率為4.8%[2]；對于特定人群（如冠心病患者、臨考學(xué)生等），患病比例可達(dá)10%以上[1]。苯二氮?類藥物（如地西泮）和5-羥色胺再攝取抑制劑（如丁螺環(huán)酮）為現(xiàn)階段臨床常用藥物，此類藥物雖療效顯著，但常見成癮性，并易引起頭痛、胃腸功能紊亂等不良反應(yīng)[3]。而中藥治療焦慮癥具有效用顯著、價格低廉、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢，如復(fù)方抗焦慮膠囊[4]、柴胡疏肝散[5]、石菖蒲[6]等。因而，從臨床常見中藥中篩選抗焦慮藥物具有重要意義。

藥對理論形成并脫胎于《神農(nóng)本草經(jīng)》[7]，酸棗仁與五味子合用能補(bǔ)心氣、安心神[8]，用于治療失眠、健忘、焦慮等。其中，酸棗仁（，SZR）來源于鼠李科植物酸棗Mill. var.(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子[9]，藥用歷史悠久，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神、斂汗、生津的功效，屬藥食同源中藥，主要含黃酮、三萜皂苷、生物堿等成分。五味子（，WWZ）是木蘭科植物五味子(Turcz.) Baill. 的干燥成熟果實(shí)[9]，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效，主要含木脂素、揮發(fā)油、降三萜等成分，在我國的應(yīng)用地域貫穿南北，服務(wù)于人口眾多的滿族[10]、蒙古族[11]、瑤族[12]，不僅是常見的中藥，也是常用的民族藥。

酸棗仁-五味子在臨床上常相須為用，配伍比例以1∶1和2∶1為主[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，炒酸棗仁-醋五味子2∶1配伍時，具有顯著的抗焦慮作用[13]。斯皮諾素是酸棗仁的質(zhì)控指標(biāo)之一[9]，為黃酮碳苷，主要通過調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸A型受體（gamma- aminobutyric acid type A receptor，GABAAR）及5-羥色胺1A型受體（5-hydroxytryptamine 1A receptor，5-HT1AR）發(fā)揮抗焦慮作用[14]。五味子醇甲是五味子的質(zhì)控指標(biāo)[9]，屬木脂素，可對抗咖啡因、苯丙胺對自主活動的興奮作用，抑制小鼠由電刺激或長期單居引起的激怒行為；有廣泛的中樞抑制作用，并有安定藥的作用特點(diǎn)[15]。酸棗仁-五味子（5∶1）配伍前后斯皮諾素[16]和五味子醇甲[17]的吸收、消除情況已有報(bào)道，但目前尚無對酸棗仁-五味子（2∶1）這一臨床常用比例配伍前后在焦慮模型動物中腸吸收特性變化的研究，二者配伍的腸吸收機(jī)制尚不明確。

為探究酸棗仁-五味子（2∶1）配伍抗焦慮藥效的發(fā)揮與特征成分吸收之間的關(guān)系，本研究采用已被廣泛證實(shí)有效的空瓶應(yīng)激（empty bottle stress，EBS）大鼠焦慮模型和孤養(yǎng)結(jié)合束縛應(yīng)激（restraint stress，RS）大鼠焦慮模型[18-21]，從軀體、社會和心理3個方面[22]進(jìn)行焦慮的誘導(dǎo)。選擇重復(fù)性好、操作簡便、能避免個體差異[23]的離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)和能準(zhǔn)確反映大鼠給藥后體內(nèi)吸收情況的在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)，考察酸棗仁-五味子（2∶1）配伍對斯皮諾素和五味子醇甲在十二指腸、空腸、回腸及小腸總的吸收量、吸收速率常數(shù)（absorption rate constanta）和表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coefficient，app）的影響，從腸吸收屏障網(wǎng)絡(luò)[24]的角度揭示酸棗仁-五味子（2∶1）配伍后抗焦慮藥效增強(qiáng)的機(jī)制，為臨床用藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級7周齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量150～170 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2016-0002。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)校區(qū)SPF級動物房，環(huán)境溫度（20～22）℃，濕度40%～60%，12 h光暗周期（8: 20～20: 20光照），明暗節(jié)律12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)前給予大鼠不受限制的標(biāo)準(zhǔn)飼料和潔凈飲用水，自主活動。動物實(shí)驗(yàn)操作人員具有國家實(shí)驗(yàn)動物從業(yè)人員上崗證（1119103100128），遵守國際實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（編號BUCM-4-2021032201-1027）。

1.2 藥物

炒酸棗仁（批號20191022，產(chǎn)自河北邢臺，簡稱酸棗仁），醋五味子（批號20190601，產(chǎn)自遼寧，簡稱五味子），均購于河北安國藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)石晉麗教授鑒定，分別為鼠李科植物酸棗Mill. var.(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子、木蘭科植物五味子(Turcz.) Baill. 的干燥成熟果實(shí)。地西泮（diazepam，DZP），北京益民藥業(yè)有限公司，規(guī)格2.5 mg，批號20180402。

1.3 試劑

碳酸氫鈉（批號20170802）、氯化鎂（批號20160616）、葡萄糖（批號20170616），均為分析純，購于北京化學(xué)試劑公司；鹽酸（批號20180528），分析純，購于北京化工廠；氯化鈉（批號20190507）、氯化鉀（批號20190404）、無水磷酸二氫鈉（批號20190419）、無水氯化鈣（批號20180402），均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，批號2009222009）；乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；斯皮諾素對照品（批號wkq16053003；經(jīng)測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.442%）、五味子醇甲對照品（批號wkq16051301，經(jīng)測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.668%）均購于四川省維克奇生物科技有限公司。

1.4 儀器

大鼠束縛裝置（不銹鋼大鼠固定器），購自創(chuàng)博環(huán)球（北京）生物科技有限公司；大鼠曠場、大鼠高架十字迷宮裝置（位于北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院科研中心行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室，軟件：EthoVision XT 9，荷蘭Noldus公司）。FE-20型pH計(jì)、ME104E型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-100E型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；H1650型臺式高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇杰瑞爾電器有效公司）；RE3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；BT100-1F型蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；VORTEX-5型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；LC-20A型高效液相色譜儀（島津公司）；ZORBAX-Aq C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥液的制備

2.1.1 提取物的制備 分別對30 g酸棗仁、30 g五味子、20 g酸棗仁與10 g五味子配伍進(jìn)行提取。先分別以8倍量80%乙醇浸泡30 min，回流提取1 h，趁熱抽濾；再以10倍量水回流提取1 h，趁熱抽濾，合并2次濾液，濃縮，烘干，分別得到酸棗仁、五味子及酸棗仁-五味子提取物，計(jì)算出膏率。

2.1.2 給藥混懸液的制備 以去離子水分別溶解酸棗仁、五味子、酸棗仁-五味子提取物，配制酸棗仁（0.2 g/mL）、五味子（0.1 g/mL）、酸棗仁-五味子（0.3 g/mL）混懸液（均按生藥量計(jì)），同法配制地西泮（0.2 mg/mL）混懸液，用于大鼠ig給藥。

2.1.3 對照品溶液的制備 以10%乙腈水溶液分別配制1 mg/mL的斯皮諾素、五味子醇甲對照品母液；并分別稀釋成質(zhì)量濃度0.5～30 μg/mL、10～600 μg/mL的線性梯度考察溶液；再配制成含斯皮諾素和五味子醇甲分別為10、200 μg/mL的混合對照溶液，用于HPLC分析。

2.1.4 Krebs-Ringer緩沖液（K-R液）的制備 精密稱取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g，溶于500 mL去離子水中；另精密稱取CaCl20.37 g溶于500 mL去離子水中；將二者充分混勻，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，于4 ℃密封冷藏。臨用前加入葡萄糖1.4 g，即得K-R液。

2.1.5 腸吸收供試液的制備 以K-R液為溶劑，分別加入適量酸棗仁、五味子、酸棗仁-五味子提取物，分別超聲20 min，離心（4000 r/min，5 min），取上清液，得到酸棗仁、五味子、酸棗仁-五味子腸吸收實(shí)驗(yàn)供試液，采用HPLC法測定指標(biāo)成分的含量，該供試液用于后續(xù)的離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)和在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)。

2.2 焦慮大鼠模型制備及給藥后焦慮行為測試

2.2.1 EBS大鼠焦慮模型的建立 按文獻(xiàn)方法[13]制備EBS大鼠焦慮模型，并進(jìn)行分組及給藥。將36只150～170 g大鼠隨機(jī)均分為6組（每組6只，離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)和在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)各3只），分別為對照組、模型組、陽性藥（DZP）組、酸棗仁組、五味子組、配伍組，各組大鼠定時喂水訓(xùn)練1周之后進(jìn)行為期2周的EBS造模，于造模第1～7天，按照陽性藥組ig給予DZP 1.0 g/(kg·d)，酸棗仁、五味子和配伍組分別ig給予相應(yīng)提取物1.0、0.5、1.5 g/(kg·d)（均按生藥量計(jì)）對大鼠給藥干預(yù)，給藥容量為5 mL/kg，對照組和模型組ig等容積的水。除對照組外，各造模大鼠均單籠飼養(yǎng)。

2.2.2 RS大鼠焦慮模型的建立 參考文獻(xiàn)方法[13]將造模時間延長至7 d進(jìn)行RS大鼠焦慮模型的建立、分組及給藥。將36只150～170 g大鼠隨機(jī)均分為6組（每組6只，離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)和在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)各3只），分別為對照組、模型組、陽性藥物（DZP）組、酸棗仁組、五味子組、配伍組；在造模的第3天開始ig給藥干預(yù)，給藥劑量及容量同EBS模型，連續(xù)給藥5 d以模擬人類在焦慮狀態(tài)下的主動干預(yù)行為。除對照組外，各造模大鼠均單籠飼養(yǎng)。

2.2.3 焦慮行為測試 選擇經(jīng)典的大鼠曠場裝置和大鼠高架十字迷宮裝置進(jìn)行EBS和RS大鼠模型給藥后焦慮行為測試。大鼠曠場裝置基于1個邊長1 m的正方形，四壁環(huán)繞呈圍墻狀，高50 cm，頂部敞開，大鼠在其中具有開闊的視野，可完全站立、自由嗅探。大鼠高架十字迷宮裝置包括2個開臂與2個閉臂（長度均為50.8 cm）和1個中央平臺區(qū)（邊長10.2 cm的正方形），距地面50 cm。

測試前45 min將大鼠運(yùn)往測試房間進(jìn)行適應(yīng)。將適應(yīng)后的大鼠逐只放入1個塑料盒中，任其自由探索5 min中后分別放入曠場的中心方格和高架十字迷宮的中央平臺處，通過上方攝像頭拍攝大鼠5 min內(nèi)的運(yùn)動情況。記錄大鼠進(jìn)入曠場中央?yún)^(qū)（邊長60 cm的正方形區(qū)域）的次數(shù)及停留的時間、進(jìn)入高架十字迷宮開臂次數(shù)與總?cè)氡鄞螖?shù)的百分比及在開臂內(nèi)運(yùn)動時間與開臂、閉臂內(nèi)的總時間的百分比。每次測試完成后，清除便溺，噴灑70%酒精并擦干，消除氣味對測試的影響。對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以表示。采用GraphPad Prism 9.2.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果服從正態(tài)分布時，進(jìn)行單因素方差（One-way Anova）分析，差異有顯著性時進(jìn)行Tukey多重比較分析；＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯，＜0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

2.3 液相測定條件及方法學(xué)考察

2.3.1 樣品前處理方法及色譜條件 采用HPLC法進(jìn)行樣品中各指標(biāo)成分的含量測定。

（1）樣品前處理方法：將腸吸收樣品置于?20 ℃預(yù)凍后冷凍干燥，以樣品冷凍前體積計(jì)，每200 μL樣品加甲醇500 μL，渦旋混合30 s，冰水浴超聲30 min，3000 r/min離心5 min，取上清液，N2吹干，每200 μL樣品殘?jiān)?0%乙腈水100 μL，渦旋混合30 s，冰水浴超聲5 min，用0.22 μm濾膜濾過，即得待測試樣品溶液。

（2）色譜條件：A相為0.1%甲酸乙腈溶液；B相為0.1%甲酸水溶液；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長254 nm。梯度洗脫：0.01～2.00 min，85% B；2.00～7.00 min，85%～75% B；7.00～17.00 min，75%～15% B；17.00～20.00 min，15% B；20.00～21.00 min，15%～85% B；21.00～30.00 min，85% B。精密量取待測試溶液10 μL注入液相色譜儀，分別計(jì)算斯皮諾素、五味子醇甲的濃度。

2.3.2 專屬性考察 比較空白溶劑、混合對照溶液、空白腸吸收液、外翻腸囊樣品以及腸灌流樣品的色譜峰形及色譜峰分離情況。

2.3.3 線性考察 取各對照品的線性梯度考察溶液，分別進(jìn)樣分析，以峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。

2.3.4 精密度考察 取混合對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各色譜峰峰面積RSD。

2.3.5 重復(fù)性考察 隨機(jī)取一外翻腸囊樣品和在體單向腸灌流樣品，分別平均分裝成6份后，按“2.3.1”項(xiàng)下的樣品前處理方法分別制得重復(fù)性樣品6份，分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，計(jì)算斯皮諾素、五味子醇甲的峰面積RSD。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 分別隨機(jī)取酸棗仁、五味子、酸棗仁-五味子的十二指腸、空腸、回腸段外翻腸囊樣品和在體單向腸灌流樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別在樣品溶液制備0、2、4、8、16、24 h后測定，計(jì)算色譜峰峰面積RSD。

2.3.7 定量限考察 稀釋對照品溶液，以各成分的信噪比（/）約為10，確定其定量限。

2.3.8 空白加樣回收率考察 取空白腸囊吸收樣品和0～15 min腸灌流樣品各7份，1份供含量測定，另6份樣品分別精密加入適量的對照品母液，按“2.3.1”項(xiàng)下操作進(jìn)行前處理及測定，計(jì)算空白加樣回收率[(測得量－樣品含有量)/加入量]，并計(jì)算各成分加樣回收率的RSD。

2.4 各成分在空白腸囊吸收液中的穩(wěn)定性考察

參考文獻(xiàn)方法[25]，收集十二指腸、空腸、回腸段的空白腸囊吸收液。以其為溶劑溶解酸棗仁-五味子提取物，置于密閉容器內(nèi)，放于37 ℃的水浴中孵育2 h，分別于0、0.5、2 h取樣500 μL，進(jìn)行HPLC檢測，根據(jù)各成分的峰面積，計(jì)算其剩余百分率。

2.5 各成分在空白腸灌流液中的穩(wěn)定性考察

參考文獻(xiàn)方法[26]，實(shí)驗(yàn)大鼠禁食48 h，收集空白腸灌流液，以其為溶劑分別溶解酸棗仁、五味子、酸棗仁-五味子提取物，置于密閉容器內(nèi)，放于37 ℃的水浴中孵育2 h，分別于0、0.5、2 h取樣500 μL，進(jìn)行HPLC檢測，根據(jù)各成分的峰面積，計(jì)算其剩余百分率。

2.6 各成分在腸壁的物理吸附性考察

剪下模型大鼠十二指腸、空腸和回腸的腸段各3 cm，將黏膜層翻出，用37 ℃的0.9%氯化鈉溶液將腸囊沖洗干凈，置于6 mL酸棗仁、五味子、酸棗仁-五味子供試液中，37 ℃孵育2 h，測定成分含量變化。重復(fù)測定3次取平均值。

2.7 酸棗仁-五味子配伍前后對焦慮模型大鼠中斯皮諾素和五味子醇甲的腸吸收特性影響

2.7.1 離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)樣品的制備及測定 取禁食24 h（自由飲水）的大鼠，腹腔麻醉后，沿腹中線、腹白線剪開皮膚與肌肉，暴露胃及十二指腸、空腸、回腸等臟器。①取考察腸段：從距幽門2 cm處向下截取10 cm十二指腸段；距幽門15 cm處開始截取10 cm空腸段；從靠近回盲部回腸端上10 cm處向下截取10 cm回腸段；上述腸段分別置于37 ℃恒溫的K-R液中。②沖洗內(nèi)容物：用37 ℃的K-R液沖洗腸段至無內(nèi)容物，剝離腸管表面的腸系膜和脂肪。③制腸囊：將自制硅膠套管短端插入腸管1 cm左右用絲線結(jié)扎牢，結(jié)扎處距腸管插入端0.5 cm；將腸管沿硅膠套管翻轉(zhuǎn)；在套管尾端露出時用K-R液沖洗套管管路；將腸段末端用絲線結(jié)扎成囊狀，結(jié)扎處距腸管末端0.5 cm。④平衡：在腸管中充入37 ℃預(yù)熱的K-R液3 mL，觀察充盈情況并確定無破損，放入浴管中，計(jì)時，平衡5 min，同時調(diào)節(jié)氣流約為每秒1個氣泡。⑤取樣：5 min后將K-R液放出，換成供試液，計(jì)時，在換液后的15、30、45、60、90 min（十二指腸、空腸）及120 min（回腸）分別取樣，每次0.2 mL，同時補(bǔ)充同體積37 ℃預(yù)熱的K-R液，并將各個腸段的15～60 min樣品分別混勻，作為各腸段的混合樣品。⑥記錄及保存：取樣后將腸管取出，測量腸囊內(nèi)剩余藥液體積（）并記錄，取出的樣品記錄體積并置于?20 ℃冷凍保存。

按“2.3.1”項(xiàng)下方法對外翻腸囊樣品進(jìn)行前處理和測定，按公式（1）～（4）計(jì)算各成分累積吸收量（μg）。

十二指腸＝十二混×0.1 mL×4＋十二90 min×0.1 mL×(＋0.2 mL)/0.2 mL （1）

空腸＝空混×0.1 mL×4＋空90 min×0.1 mL×(＋0.2 mL)/0.2 mL （2）

回腸＝回混×0.1 mL×5＋回120 min×0.1 mL×(＋0.2 mL)/0.2 mL （3）

小腸累計(jì)＝十二指腸＋空腸＋回腸 （4）

為腸囊內(nèi)剩余藥液體積；十二混、十二90 min、空混、空90 min、回混、回120 min分別為十二指腸混合樣品、十二指腸90 min樣品、空腸混合樣品、空腸90 min樣品、回腸混合樣品、回腸120 min樣品中考察化合物的質(zhì)量濃度（μg/mL）

2.7.2 在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)樣品的制備及測定 ①麻醉：取禁食48 h（自由飲水）的大鼠，腹腔麻醉，置于37 ℃恒溫環(huán)境下。②插管：沿腹中線剪開皮膚與肌肉，暴露大鼠腹腔，尋找實(shí)驗(yàn)所需腸段，即十二指腸（幽門2 cm處）至回腸末端（回腸-盲腸連接處上行10 cm處）。于相應(yīng)位置剪切（避開血管），于十二指腸處插管并結(jié)扎、固定，以乳膠管插入回腸末端切口處以導(dǎo)出灌流液。將十二指腸處插管連接蠕動泵，用37 ℃的0.9%氯化鈉溶液沖洗腸內(nèi)容物，隨時滴加37 ℃的0.9%氯化鈉溶液以保溫保濕。③平衡：將灌流液進(jìn)、出端高度調(diào)至一致，調(diào)整腸道擺放位置，使灌流液持續(xù)流通。以1 mL/min的體積流量灌流腸管10 min后，再調(diào)整體積流量為0.2 mL/min繼續(xù)平衡20 min。④收集灌流液：平衡完畢，以已稱定質(zhì)量的1號供液瓶迅速換下平衡用藥瓶，出液端以已知質(zhì)量的1?號配對小瓶接液，每隔15 min迅速依次更換已稱定質(zhì)量的供液小瓶和接液小瓶，稱質(zhì)量，計(jì)算灌入和收集的供試液質(zhì)量，分別記為in與out；分別于第15、30、45、60 min收集灌流液，記錄體積，置于?20 ℃凍存。⑤測量：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠處死，剪下腸段，測量長度（），剪開部分腸段，測量腸管周長以得到腸管半徑（）。⑥密度（）測定：分別從已稱定質(zhì)量的供液小瓶和接液小瓶各移出500 μL供試液和收集液，稱質(zhì)量（稱定質(zhì)量后將液體移回原瓶），2次稱質(zhì)量差即為500 μL供試液和收集液各自的質(zhì)量，根據(jù)計(jì)算灌入和收集的供試液密度（in、out），再計(jì)算in與out。

按“2.3.1”項(xiàng)下方法對在體單向腸灌流樣品進(jìn)行前處理和測定，按公式（5）～（7）分別計(jì)算各成分的峰面積比值、吸收速率常數(shù)a（min?1）和表觀滲透系數(shù)app（cm/min）。每組3個生物學(xué)重復(fù)樣本，a和app結(jié)果以表示。

峰面積比值＝out/in（5）

a＝(1－out/in×out/in)×/(π2) （6）

app＝?×ln(out/in×out/in)/(π2) （7）

in和out分別為經(jīng)HPLC測得的每15 min灌流進(jìn)出藥液中對應(yīng)指標(biāo)成分的峰面積；為腸段的長度（cm）；為腸段的內(nèi)半徑（cm）；為灌流速度（mL/min）；in和out分別為進(jìn)出藥液中對應(yīng)指標(biāo)成分的質(zhì)量濃度（g/mL）；in與out分別為每15 min灌流入腸的供試液體積和灌流出腸的供試液體積（mL）

3 結(jié)果

3.1 各提取物出膏率及配伍對指標(biāo)成分溶出的影響

酸棗仁、五味子、酸棗仁-五味子提取物的平均出膏率（由同一批藥材分別提取20次計(jì)算得到）分別為11.60%、32.10%和17.08%。

經(jīng)HPLC測定，腸吸收實(shí)驗(yàn)中的酸棗仁供試液中含斯皮諾素9.19 μg/mL，五味子供試液中含五味子醇甲295.59 μg/mL，酸棗仁-五味子供試液中含斯皮諾素17.02 μg/mL、五味子醇甲268.74 μg/mL。液相測定結(jié)果可見，斯皮諾素在配伍后供試液中的含量與配伍前相比，提高了約1倍，說明配伍能增加斯皮諾素的溶出。

3.2 酸棗仁-五味子配伍前后對焦慮模型大鼠焦慮行為的影響

3.2.1 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如圖1所示，與對照組相比，EBS和RS模型大鼠均表現(xiàn)出焦慮樣行為，體現(xiàn)在進(jìn)入曠場中央?yún)^(qū)的次數(shù)和停留時間減少（＜0.05、0.01）。

在EBS和RS模型下，與模型組相比，陽性藥組大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)和停留時間明顯增加（＜0.05、0.01），說明陽性藥干預(yù)并改善了模型大鼠的焦慮狀態(tài)。除陽性藥組外，各給藥組大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)和在中央?yún)^(qū)停留的時間與模型組相比，均有不同程度的增加，其中，配伍組較模型組增加最多（＜0.05）。EBS和RS焦慮模型大鼠的曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，證實(shí)了酸棗仁、五味子單用及配伍給藥后能不同程度地改善焦慮模型大鼠的焦慮狀態(tài)，且配伍后改善焦慮狀態(tài)的趨勢更為明顯（＜0.05）。

3.2.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如圖2所示，與對照組相比，EBS和RS模型大鼠均表現(xiàn)出焦慮樣行為，體現(xiàn)在進(jìn)入開臂的次數(shù)和時間百分比降低（＜0.05、0.01）。與模型組相比，陽性藥組大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)和時間百分比均增加（＜0.05、0.01），說明陽性藥干預(yù)改善了模型大鼠的焦慮狀態(tài)。

在EBS和RS焦慮模型下，各給藥組大鼠與模型組相比，進(jìn)入開臂的次數(shù)均明顯增加（＜0.05、0.01），說明酸棗仁、五味子單用及配伍給藥均能改善焦慮模型大鼠的焦慮表現(xiàn)；各給藥組大鼠與模型組相比，進(jìn)入開臂時間百分比有不同程度增加，并且配伍后相對于配伍前增加更多，其中，EBS模型下的配伍組大鼠進(jìn)入開臂時間百分比與模型組相比有明顯增加（＜0.05）。

EBS和RS焦慮模型的高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明酸棗仁、五味子單用及配伍給藥后能不同程度地改善焦慮模型大鼠的焦慮狀態(tài)，并且在EBS模型下，配伍后改善焦慮狀態(tài)的趨勢更為明顯（＜0.05、0.01）。

以上行為學(xué)數(shù)據(jù)表明，酸棗仁、五味子配伍后較配伍前更能增加大鼠進(jìn)入曠場中央?yún)^(qū)的次數(shù)和時間，以及進(jìn)入開臂的時間。說明酸棗仁、五味子配伍后較配伍前更能改善焦慮模型大鼠的焦慮狀態(tài)，更好地發(fā)揮抗焦慮藥效。

3.3 HPLC方法學(xué)考察結(jié)果

專屬性考察結(jié)果表明斯皮諾素與五味子醇甲分離良好，無溶劑干擾（圖3）。精密度和重復(fù)性考察結(jié)果斯皮諾素、五味子醇甲的峰面積RSD均小于2.0%，說明精密度和重復(fù)性符合要求。線性關(guān)系考察結(jié)果分別為斯皮諾素回歸方程＝39 338－19 770，2＝0.999，線性范圍為0.5～30 μg/mL；五味子醇甲回歸方程＝9 984.3－94 449，2＝0.999，線性范圍為10～600 μg/mL。斯皮諾素、五味子醇甲的定量限分別為0.24、0.05 μg/mL?？瞻准訕踊厥章蕦?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，斯皮諾素和五味子醇甲在各個樣品中的加樣回收率范圍為91.81%～115.34%，RSD分別為0.05%、0.04%、0.93%和0.33%，回收率符合80%～120%標(biāo)準(zhǔn)，RSD均小于2%，結(jié)果符合要求。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

圖3 空白溶劑(A)、空白腸吸收液(B)、混合對照品(C)、酸棗仁外翻腸囊樣品(D)、五味子外翻腸囊樣品(E)、酸棗仁-五味子外翻腸囊樣品(F) 的HPLC圖譜

外翻腸囊樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果（表1）表明，配伍前后各腸段樣品中的斯皮諾素在24 h內(nèi)均有較高的穩(wěn)定性（含量變化比不超過5.49%，峰面積RSD不超過2.15%）；配伍前后五味子醇甲在十二指腸中均穩(wěn)定（含量變化比不超過1.00%，RSD不超過0.38%），但配伍前五味子醇甲在空腸和回腸樣品中24 h內(nèi)不穩(wěn)定，含量變化比分別為?14.36%、27.41%，峰面積RSD已超過7.94%，而配伍后穩(wěn)定性顯著提高（含量變化比降低至2.54%，RSD降低至0.95%）。在體單向腸灌流樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，斯皮諾素和五味子醇甲在配伍前后均有較高的穩(wěn)定性（含量變化比不超過4.52%，RSD不超過1.47%）。

表1 斯皮諾素、五味子醇甲的穩(wěn)定性考察結(jié)果

Table 1 Stability of spinosin and schisandrin

化合物配伍情況含量變化比/%峰面積RSD/% 十二指腸（外翻腸囊）空腸（外翻腸囊）回腸（外翻腸囊）總腸段（腸灌流）十二指腸（外翻腸囊）空腸（外翻腸囊）回腸（外翻腸囊）總腸段（腸灌流） 斯皮諾素配伍前1.792.565.494.520.630.872.151.47 配伍后5.382.640.581.651.911.020.950.96 五味子醇甲配伍前1.00?14.3627.412.180.327.948.890.86 配伍后1.002.54?0.760.910.380.950.450.76

含量變化比＝(24 h含量－0 h含量)/ 0 h含量

3.4 各成分在空白腸囊吸收液中的穩(wěn)定性考察結(jié)果

在十二指腸、空腸和回腸樣品中，斯皮諾素孵育0.5、2 h的剩余率為89.83%～106.13%，五味子醇甲孵育0.5、2 h的剩余率為92.59%～96.18%；在空白腸囊吸收液中孵育2 h，考察化合物的損失及誤差范圍約在10%以內(nèi)，穩(wěn)定性尚可。

3.5 各成分在空白腸灌流液中的穩(wěn)定性考察結(jié)果

酸棗仁提取物和酸棗仁-五味子提取物中的斯皮諾素分別經(jīng)空白腸灌流液溶解、孵育0.5、2 h的剩余率為99.26%～99.80%；五味子提取物和酸棗仁-五味子提取物中的五味子醇甲分別經(jīng)空白腸灌流液溶解、孵育0.5、2 h的剩余率為99.51%～100.96%；在空白腸灌流液中孵育2 h，考察化合物的損失及誤差范圍約在1%以內(nèi)，穩(wěn)定性較高。

3.6 各成分在腸壁的物理吸附性考察結(jié)果

斯皮諾素和五味子醇甲在腸壁的物理吸附性考察結(jié)果如表2所示。影響吸附后與吸附前含量比值（簡稱比值）的因素包括2方面：①腸壁對該成分的物理吸附作用；②腸壁對供試液中水分的吸收作用。首先，酸棗仁單用時，斯皮諾素在回腸的吸附比值為98.30%，在其他腸段均高于100%，說明酸棗仁單用時，斯皮諾素在回腸腸壁有略微的吸附，在其他腸段吸附作用不明顯。五味子單用時，五味子醇甲在十二指腸、空腸和回腸的比值分別為74.80%、102.61%和89.35%，說明五味子單用時，十二指腸和回腸對五味子醇甲有較強(qiáng)的吸附作用，且十二指腸的吸附更甚，空腸對其沒有明顯的吸附作用。配伍后，腸壁對斯皮諾素和五味子醇甲的吸附作用可能減弱（各腸段比值均高于配伍前），或更多地表現(xiàn)為對供試液中水分的吸收，進(jìn)而導(dǎo)致供試液濃縮，使比值增加，高于100%。綜上，配伍可能降低十二指腸對五味子醇甲、回腸對斯皮諾素和五味子醇甲的物理吸附作用，也可能提高各腸段對供試液中水分的吸收。

表2 斯皮諾素、五味子醇甲在腸壁的物理吸附性考察結(jié)果

Table 2 Physical adsorption of spinosin and schisandrin on intestinal inner wall

腸段斯皮諾素吸附比值/%五味子醇甲吸附比值/% 酸棗仁單用配伍后五味子單用配伍后 十二指腸109.64 111.05 74.80 113.26 空腸102.04 113.85 102.61 111.95 回腸98.30 103.68 89.35 103.64

3.7 酸棗仁-五味子配伍前后對焦慮模型大鼠中斯皮諾素和五味子醇甲的腸吸收特性的影響

3.7.1 斯皮諾素和五味子醇甲在離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果 酸棗仁-五味子配伍前后給藥對EBS和RS模型大鼠離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)中斯皮諾素和五味子醇甲的腸吸收特性影響如表3所示?？梢钥闯觯逦蹲哟技椎奈樟勘人蛊ぶZ素整體約高1個數(shù)量級；在EBS和RS模型下，配伍前的斯皮諾素和五味子醇甲在回腸腸段吸收量均高于其他腸段；配伍后，二者在各腸段的吸收量相當(dāng)，其中，斯皮諾素在回腸腸段的吸收量略低于其他兩腸段。

表3 酸棗仁-五味子配伍對斯皮諾素、五味子醇甲在離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)中吸收量的影響()

Table 3 Effects of Ziziphi Spinosae Semen and Schisandrae Chinensis Fructus compatibility on absorption of spinosin and schisandrin in in vitro everted gut sac experiment ()

成分組別Q十二指腸/μgQ空腸/μgQ回腸/μgQ小腸累計(jì)/μg 斯皮諾素EBS-酸棗仁 18.29±0.03 17.71±0.14 27.83±0.40 63.83±0.56 EBS-配伍 8.69±0.16 8.84±0.17 7.42±0.14 24.95±0.44 RS-酸棗仁 9.82±0.05 6.67±0.06 10.19±0.09 26.68±0.12 RS-配伍 8.08±0.11 7.85±0.12 6.83±0.09 22.76±0.25 五味子醇甲EBS-五味子 98.90±0.43111.30±0.17211.90±3.46422.11±3.55 EBS-配伍178.26±3.19142.96±2.47146.18±2.14467.40±6.77 RS-五味子 55.01±0.36 50.81±0.13118.75±0.48224.57±0.75 RS-配伍161.34±2.17165.80±2.61119.24±1.28446.38±4.72

在離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)中，酸棗仁、五味子配伍后斯皮諾素和五味子醇甲的腸吸收量變化情況如表4所示。配伍后，除RS模型的空腸腸段外，斯皮諾素在兩模型下的各腸段的吸收量均降低，EBS模型下總吸收量降低38.88 μg，RS模型下總吸收量降低3.92 μg。配伍后，五味子醇甲在兩模型下的小腸總吸收量較配伍前均有所增加，事實(shí)上，除回腸段外，五味子醇甲的吸收量均增加，EBS模型下總吸收量增加45.29 μg，RS模型下總吸收量增加221.81 μg，約增加1倍。以上結(jié)果說明配伍降低了斯皮諾素的吸收，但促進(jìn)了五味子醇甲在十二指腸和空腸的吸收。從數(shù)值來看，配伍促進(jìn)五味子醇甲增加的吸收量大于斯皮諾素降低的吸收量，尤其在RS模型下，五味子醇甲的吸收增加量（221.81 μg）遠(yuǎn)大于斯皮諾素的吸收降低量（3.92 μg）。

變化量=配伍后－配伍前

3.7.2 斯皮諾素在在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果 酸棗仁-五味子配伍前后給藥，對EBS和RS模型大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)中斯皮諾素的腸吸收特性如表5所示。峰面積比值越小，表明吸收越好；a值越大，表明吸收越快；app是衡量物質(zhì)滲透性的參數(shù)，通常該參數(shù)的數(shù)值越大，表明物質(zhì)越易于滲透即易于吸收，有研究者[27]認(rèn)為當(dāng)app大于4×10?4cm/min時，說明該物質(zhì)有較好的吸收。，

表4 酸棗仁-五味子配伍后斯皮諾素、五味子醇甲在離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)中吸收量的變化

Table 4 Changes in absorption of spinosin and schisandrin after compatibility of Ziziphi Spinosae Semen and Schisandrae Chinensis Fructus in in vitro everted gut sac experiment

成分動物模型Q變化量/μg 十二指腸空腸回腸小腸 斯皮諾素EBS?9.60?8.87?20.41?38.88 RS?1.741.18?3.36?3.92 五味子醇甲EBS79.3631.66?65.7245.29 RS106.33114.990.49221.81

表5 焦慮模型大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)中酸棗仁-五味子配伍對斯皮諾素吸收特性的影響()

Table 5 Effects of Ziziphi Spinosae Semen and Schisandrae Chinensis Fructus compatibility on absorption of spinosin in in vivo single-pass intestinal perfusion experiment of anxiety model rats ()

樣品考察時段/min峰面積比值/%Ka/(×10?3min?1)Papp/(×10?3 cm·min?1) EBS-酸棗仁 0～15 0.8819.40±0.474.69±0.55 15～30 0.8420.00±0.486.21±0.10 30～45 8.8320.00±0.275.85±0.78 45～60 34.0617.40±1.563.39±0.73 EBS-配伍 0～15 0.0020.50±0.097.91±0.78 15～30 0.0020.60±0.078.35±0.98 30～45 33.8518.60±1.214.28±0.91 45～60 86.5514.10±2.162.07±0.55 RS-酸棗仁 0～15 0.8019.60±0.334.91±0.53 15～30 1.8619.70±0.315.16±0.64 30～45 63.3511.70±4.831.85±0.88 45～60 128.03?7.24±9.44?1.98±0.78 RS-配伍 0～15 0.0020.50±0.087.92±0.77 15～30 4.9720.40±0.127.26±0.84 30～45 21.8417.80±1.923.96±0.11 45～60 42.5415.20±1.872.40±0.57

在EBS和RS焦慮大鼠模型下，灌流的前2個時段（0～30 min）中，配伍前后斯皮諾素的峰面積比值均不高于4.97%，說明供試液中的斯皮諾素近完全吸收，隨著灌流過程的推進(jìn)（30～60 min），峰面積比值逐漸增加，甚至達(dá)到128.03%，樣品吸收逐漸減弱，甚至出現(xiàn)了外排現(xiàn)象。在30～60 min時段內(nèi)，在EBS模型下，配伍后斯皮諾素的峰面積比值明顯大于配伍前，說明配伍后斯皮諾素的吸收降低，此結(jié)果與離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致；而在RS模型下，配伍后斯皮諾素的峰面積比值降低，其變化趨勢與之相反，原因有待進(jìn)一步討論。

在EBS和RS焦慮大鼠模型下，斯皮諾素在配伍前后的絕大部分吸收時段（RS-酸棗仁的45～60 min時段除外）的a均不低于11.70×10?3/min，app均不低于1.85×10?3cm/min，表明斯皮諾素在兩模型下的吸收速率較快，且吸收良好[27]。在0～30 min時段，配伍后，兩焦慮模型下斯皮諾素的a和app均有升高趨勢，說明配伍可能促進(jìn)斯皮諾素的初始（0～30 min）吸收。而在30～60 min時段，在EBS模型下，配伍后斯皮諾素的a和app均有不同程度降低，說明配伍后斯皮諾素的吸收降低；而在RS模型下，斯皮諾素的a和app均明顯升高，其變化趨勢與之相反，原因有待進(jìn)一步討論。值得注意的是，酸棗仁單獨(dú)給藥（RS-酸棗仁）至45～60 min時，峰面積比值大于100%，a和app均呈負(fù)值，說明此時機(jī)體對斯皮諾素的處理以外排為主，且這種外排現(xiàn)象在配伍后（RS-配伍）得到改善。

以上現(xiàn)象表明，在腸吸收初期（0～30 min），配伍給藥可能促進(jìn)斯皮諾素的吸收，但在后期（30～60 min），配伍可能導(dǎo)致其吸收降低；除此之外，配伍還能減輕小腸對斯皮諾素的外排作用。

3.7.3 五味子醇甲在在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果 酸棗仁-五味子配伍前后給藥，對EBS和RS模型大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)中五味子醇甲的腸吸收特性結(jié)果如表6所示。在EBS和RS焦慮大鼠模型中，配伍前后供試液中的五味子醇甲在灌流的全過程近完全吸收（峰面積比值極?。?，并且隨著灌流過程的推進(jìn)，樣品吸收沒有減弱的趨勢（峰面積比值沒有明顯增加，均小于1%），持續(xù)保持較高的吸收；各個吸收時段的a均不低于0.013 50/min，app均大于5.75×10?3cm/min，表明五味子醇甲在兩模型下的吸收速率較快，且吸收良好[27]。并且配伍給藥后，兩模型下五味子醇甲在各時段的a和app均不同程度升高，說明配伍可能促進(jìn)五味子醇甲的吸收。其中，EBS模型下五味子單獨(dú)給藥（EBS-五味子）組的a有較大的標(biāo)準(zhǔn)誤差，此現(xiàn)象可能與灌流前后灌流液體積、密度的變化及小腸長度的差異有關(guān)，而腸道對水分的交換和利用或許是以上差異在大鼠體內(nèi)的表現(xiàn)形式。以上現(xiàn)象表明，五味子醇甲在配伍前后均保持較高水平的吸收，且配伍能促進(jìn)五味子醇甲的吸收。

表6 焦慮模型大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)中酸棗仁-五味子配伍對五味子醇甲腸吸收特性的影響()

Table 6 Effects of Ziziphi Spinosae Semen and Schisandrae Chinensis Fructus compatibility on absorption of schisandrin in in vivo single-pass intestinal perfusion experiment of anxiety model rats ()

考察樣品考察時段/ min峰面積比值/%Ka/(×10?3min?1)Papp/(×10?3 cm·min?1) EBS-五味子 0～15 0.0313.60±6.575.75±0.15 15～30 0.0513.80±6.686.82±0.29 30～45 0.0013.50±6.535.92±0.51 45～60 0.0713.60±6.596.33±0.39 EBS-配伍 0～15 0.1120.50±0.017.56±0.74 15～30 0.1120.50±0.018.01±1.00 30～45 0.0320.30±0.307.74±1.60 45～60 0.0020.50±0.077.38±0.44 RS-五味子 0～15 0.1120.10±0.376.52±0.99 15～30 0.0620.30±0.156.62±0.75 30～45 0.1720.10±0.256.41±1.06 45～60 0.6319.90±0.335.76±0.99 RS-配伍 0～15 0.0720.60±0.048.23±0.43 15～30 0.0920.60±0.078.21±0.86 30～45 0.6720.20±0.347.24±1.39 45～60 0.4920.40±0.077.10±0.39

綜合腸吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，配伍前后，斯皮諾素和五味子醇甲的吸收情況均較好，且五味子醇甲的小腸總吸收量遠(yuǎn)高于斯皮諾素（約高1個數(shù)量級）；配伍可能促進(jìn)斯皮諾素的初始吸收（0～30 min），但降低后期（30～60 min）的吸收，并降低斯皮諾素的小腸總吸收量；另外，配伍能減輕酸棗仁中斯皮諾素的外排作用，并促進(jìn)五味子中五味子醇甲的吸收。以上結(jié)果說明酸棗仁、五味子抗焦慮藥效的發(fā)揮與其藥效物質(zhì)斯皮諾素、五味子醇甲良好的吸收密不可分；配伍后抗焦慮作用的增強(qiáng)可能與促進(jìn)五味子醇甲的吸收有關(guān)。

4 討論

本研究采用EBS和RS 2種焦慮大鼠模型，通過離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)和在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)合HPLC法，分別考察了酸棗仁-五味子藥對在配伍前后的指標(biāo)成分斯皮諾素和五味子醇甲在焦慮模型大鼠中的腸吸收特性。結(jié)果表明，酸棗仁-五味子配伍前后，斯皮諾素和五味子醇甲均保持良好的吸收，在此基礎(chǔ)上抗焦慮作用得以發(fā)揮；配伍雖增加了斯皮諾素的溶出量，減少了小腸對斯皮諾素的外排，但降低了斯皮諾素的吸收。配伍促進(jìn)了五味子醇甲的吸收，并增加了其在空腸和回腸中的穩(wěn)定性，因此，本研究認(rèn)為五味子醇甲是配伍后抗焦慮藥效增強(qiáng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

4.1 酸棗仁-五味子配伍抗焦慮指標(biāo)成分的選擇

斯皮諾素有廣泛的中樞藥理作用，如鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮等[28]，研究證實(shí)其抗焦慮機(jī)制由GABAAR和5-HT1AR調(diào)節(jié)[14]。除斯皮諾素外，酸棗仁的質(zhì)控指標(biāo)還有酸棗仁皂苷A，但其不能透過血腦屏障與GABA受體完全結(jié)合[29]，經(jīng)大鼠胃腸代謝后生物利用度非常低（1.32%）[30]。另有研究推測黃酮類成分可能是酸棗仁中的主要抗焦慮成分[31]，因此，本研究僅考察了酸棗仁中黃酮類化合物斯皮諾素的腸吸收特性。

五味子醇甲為木脂素類化合物，容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[32]，可增加大鼠紋狀體及下丘腦多巴胺含量，發(fā)揮中樞抑制作用[33]，具有雌激素活性[34]，有利于避免因雌激素缺乏所致的焦慮樣行為[35]。除五味子醇甲外，五味子中還含有五味子甲素和乙素，但在道地外產(chǎn)區(qū)外的五味子中并未檢測到[36]或含量較低[37]；其藥理活性與抗焦慮作用可能不直接相關(guān)，故本研究未將其納入有效成分進(jìn)行研究。

4.2 在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)大鼠禁食時間的選擇

在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)，研究人員首先參考常規(guī)禁食時間[38-39]，分別嘗試禁食12、18、24、36 h，但發(fā)現(xiàn)2種焦慮模型大鼠十二指腸處的食糜無法沖洗干凈，導(dǎo)致灌流液不能順暢流出，實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。并且焦慮模型大鼠暴露腹腔后可見大量分散的脂肪，推測原因是焦慮引起大鼠中腦-邊緣多巴胺系統(tǒng)胞外多巴胺濃度減少，導(dǎo)致過量攝食作為補(bǔ)償[40]，因而造成十二指腸處食糜較多。將禁食時間延長至48 h后，大鼠十二指腸及后續(xù)腸段的食糜可沖洗干凈，因此本實(shí)驗(yàn)在滿足動物福利最大化的前提下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將大鼠禁食時間調(diào)整為48 h。

4.3 在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)中，斯皮諾素的外排作用及原因分析

RS模型下的在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)30～60 min時段，斯皮諾素在配伍后峰面積比值異常降低、a和app異常升高。觀察酸棗仁單獨(dú)給藥30～60 min時段的數(shù)據(jù)可見，此時斯皮諾素峰面積比值過高（分別為63.35%、128.03%）；a和app數(shù)值過低，甚至在45～60 min時段出現(xiàn)負(fù)值，說明在45～60 min時段，機(jī)體對斯皮諾素的處理以外排為主。而在30～45 min時段，推測外排作用已經(jīng)發(fā)生，并導(dǎo)致了上述參數(shù)的異常變化。

上述外排作用在配伍后得到改善，分析其原因，斯皮諾素主要在小腸中消化吸收[41]，但生物利用度低，其外排現(xiàn)象與P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白等均有關(guān)[42]；五味子中的木脂素既是P-糖蛋白的底物又是其抑制劑[43-44]，推測在配伍后，木脂素類成分與P-糖蛋白發(fā)生作用，抑制并減輕了斯皮諾素的外排。

4.4 配伍后斯皮諾素、五味子醇甲的腸吸收特性及其與抗焦慮藥效增強(qiáng)的關(guān)聯(lián)

配伍后斯皮諾素的吸收降低，對其原因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，斯皮諾素和五味子醇甲的腸吸收過程均為主動轉(zhuǎn)運(yùn)[45-46]，主動轉(zhuǎn)運(yùn)需要細(xì)胞膜上的膜蛋白或標(biāo)志酶作為載體參與到轉(zhuǎn)運(yùn)過程，但載體數(shù)量有限，當(dāng)需要與載體結(jié)合達(dá)到轉(zhuǎn)運(yùn)的成分增多時，成分間的競爭導(dǎo)致其中部分成分不能與載體結(jié)合達(dá)到轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收。因此，推測配伍后五味子中包括五味子醇甲在內(nèi)的木脂素類成分與斯皮諾素競爭載體，而五味子醇甲與載體的結(jié)合能力更強(qiáng)，因而導(dǎo)致與斯皮諾素結(jié)合的載體減少，不能達(dá)到有效的轉(zhuǎn)運(yùn)，因而致其吸收量降低。結(jié)合斯皮諾素在配伍前保持較好的吸收及其抗焦慮藥效[14,28]，提示斯皮諾素可能是酸棗仁中抗焦慮的重要成分，但并非配伍后抗焦慮藥效增加的關(guān)鍵成分。

兩腸吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)，配伍促進(jìn)了五味子中五味子醇甲的吸收，外翻腸囊實(shí)驗(yàn)表明配伍主要促進(jìn)五味子醇甲在十二指腸和空腸的吸收。另外，外翻腸囊樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，配伍使五味子醇甲在空腸、回腸中的穩(wěn)定性大幅提高，有研究[17]提示酸棗仁能顯著減少五味子醇甲在動物體內(nèi)的消除，增加其滯留時間。因而推測可能是酸棗仁中的某些化學(xué)成分在配伍后與五味子醇甲相互作用，增加了五味子醇甲的穩(wěn)定性，或抑制其降解，因而在一定程度上促進(jìn)了其吸收。

腸吸收實(shí)驗(yàn)中，雖然斯皮諾素的吸收降低，但五味子醇甲的吸收升高，并且在離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)中五味子醇甲總吸收量的增加遠(yuǎn)大于斯皮諾素的減少。五味子醇甲有廣泛中樞抑制作用，并有安定藥的作用特點(diǎn)，能抑制小鼠長期單居引起的激怒行為[15]。作為抗焦慮藥效指標(biāo)，五味子醇甲吸收量的大幅增加或許可在一定程度上拮抗斯皮諾素的外排[42,47-49]并彌補(bǔ)其吸收量的降低，進(jìn)而保證配伍后抗焦慮藥效的發(fā)揮，乃至增強(qiáng)。因此，本研究認(rèn)為五味子醇甲或許是促使配伍后抗焦慮藥效增強(qiáng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。另一方面，五味子中的木脂素成分也被研究證實(shí)有顯著的抗焦慮作用，能顯著抑制束縛應(yīng)激引起的焦慮癥[50]，因此，配伍后抗焦慮藥效的增強(qiáng)也可能與五味子中其他木脂素類成分的吸收變化有關(guān)。

已有的研究表明，酸棗仁與五味子合用時，能減慢斯皮諾素的代謝，提高其生物利用度[16]；棗仁安神方中的酸棗仁能顯著減緩五味子中五味子醇甲的消除，延長其作用時間[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酸棗仁-五味子配伍后，促進(jìn)了五味子醇甲的吸收，并增加其在小腸中的穩(wěn)定性。結(jié)合五味子醇甲的抗焦慮活性，酸棗仁-五味子配伍進(jìn)而發(fā)揮更好的抗焦慮藥效，可能是促進(jìn)活性成分吸收和延緩其代謝共同作用的結(jié)果。

本研究從腸吸收屏障網(wǎng)絡(luò)的角度，初步揭示了酸棗仁、五味子抗焦慮藥效的發(fā)揮與其中的藥效成分斯皮諾素、五味子醇甲在小腸保持良好的吸收有關(guān)；并且酸棗仁-五味子藥對配伍后通過增加藥效成分五味子醇甲的吸收、提高其穩(wěn)定性，進(jìn)而增強(qiáng)了抗焦慮作用。后續(xù)可對藥效成分的代謝動力學(xué)進(jìn)行研究，更進(jìn)一步說明其生物利用度改變的原因。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect ofandcompatibility on anti-anxiety activty and intestinal absorption properties of effective components

LIU Jin-feng1, WANG Xiao-mei1, LI Jia-yuan1, YANG Xue1, WEI Xiao-jia1, WANG Yu-qing1, LYU Yan1, YU Jia-he1, JIN Zhong-xian1, WANG Chun-guo2, SHI Jin-li1

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 2. Research Institute of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To study the changes in anti-anxiety effects and the intestinal absorption properties of the key ingredients (spinosin and schisandrin) in two anxiety rat models, before and after the compatibility of Suanzaoren (, SZR) and Wuweizi (, WWZ) herb pair.Two anxiety rat models which were empty bottle stress (EBS) at the same time isolation and restraint stress (RS) combined with isolation were used to evaluate the anti-anxiety effect of before and after compatibility of SZR and WWZ by open field experiments and elevated cross maze experiments. The absorption of spinosin and schisandrin before and after compatibility of SZR and WWZ in duodenum, jejunum, ileum and the whole small intestine of anxiety model rats were determined by theeverted gutexperiment andsingle-pass intestinal perfusion experiment combined with HPLC.The results of behavioral experiment showed that both SZR and WWZ could reduce the anxiety-like behavior of anxious rats, and the reduction of the anxiety-like behavior was more significant after the compatibility of the two. For theeverted gutexperiment, the absorption of schisandrin was about one order of magnitude higher than that of spinosin. After compatibility, the total absorption of spiniosin showed a downward trend, the absorption of schisandrin increased, which was manifested in the increase of duodenum, jejunum, and total absorption. Meanwhile, the schisandrin had good stability in jejunum and in ileum. For thesingle-pass intestinal perfusion experiment, the absorption of spinosin was fast and completed in 30 min of perfusion. The efflux may occur when SZR used alone. However, after compatibility, this efflux effect was weakened to a certain extent. Schisandrin was also absorbed quickly and completely within 1 h of perfusion, and no efflux effect was observed. And after compatibility, the absorption rate constant (a) and apparent permeability coefficient (app) of spinosin and schisandrin were both increased.The anti-anxiety effect was enhanced after the compatibility of SZR and WWZ. The dissolution of spinosin was increased, the efflux effect of spinosin was reduced, the absorption of spinosin was decreased, and the absorption and the stability of schisandrin in jejunum and ileum were increased after the compatibility of SZR and WWZ. From the perspective of intestinal absorption barrier network, this study revealed that the anti-anxiety effect of SZR and WWZ is closely related to the good absorption of spinosin and schisandrin in small intestine, the enhancement of anti-anxiety effect after the compatibility of SZR and WWZ may be related to the improvement of stability of schisandrin and the increase of absorption of schisandrin. This conclusion provides scientific basis for clinical medication.

intestinal absorption; anxiety disorder; spinosin; schisandrin;;; compatibility

R285

A

0253 - 2670(2022)16 - 5093 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.019

2022-02-20

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2012ZX09102-201-018）

劉金鳳（1990—），女，碩士研究生，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: 15210691464 E-mail: jinfeng0902049@126.com

石晉麗，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究。E-mail: shijl@vip.sina.com

王春國，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: wangcg1119@126.com

#共同第一作者：王曉玫（1993—），女，碩士研究生，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: 17812013713 E-mail: 467115394@qq.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]