王小平，薛志鵬，杜少兵，周慧慧，白吉慶，李 菁，王鵬飛，謝李紅，陳 妮

基于PI3K/PDK1/Akt信號(hào)通路研究丹參-紅花藥對(duì)對(duì)寒凝血瘀型心肌缺血大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

王小平，薛志鵬，杜少兵，周慧慧，白吉慶，李 菁，王鵬飛，謝李紅，陳 妮

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046

研究丹參-紅花藥對(duì)對(duì)異丙腎上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO）誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、復(fù)方丹參滴丸（73 mg/kg）組和丹參-紅花低、中、高劑量（4、8、16 g/kg）組，給予相應(yīng)藥物干預(yù)7 d。于第6天開始ig藥物1 h后，大鼠于0 ℃的冰浴中寒冷刺激4 min，sc ISO（85 mg/kg），連續(xù)2 d。采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法測(cè)定各組大鼠心肌梗死面積；采用TUNEL法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察各組大鼠心肌組織病理變化；采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血漿中肌酸激酶同工酶（creatine kinase，CK）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、CK-肌紅蛋白（myoglobin，MB）活性及心肌肌鈣蛋白-I（cardiac troponin-I，CTn-I）、CTn-T、C反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）、MB、末端利鈉肽前體（-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）和B型腦利鈉肽（B-brain natriuretic peptides，BNP）水平；采用Western blotting檢測(cè)各組大鼠心肌組織中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1，PDK1）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、p-Akt、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、p-eNOS、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）、p-NF-κB p65、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）和Caspase-9蛋白表達(dá)。丹參-紅花藥對(duì)顯著抑制ISO誘導(dǎo)的心肌缺血模型大鼠的心肌梗死面積（＜0.01）；改善心肌組織病理變化；顯著抑制心肌細(xì)胞的凋亡（＜0.05、0.01）；顯著降低血漿中心肌酶活性以及心肌蛋白水平（＜0.05、0.01）；顯著上調(diào)心肌組織中Bcl-2、PDK1、p-eNOS、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），降低Bax、Cyt C、剪切型Caspase-3（cleaved Caspase-3）、cleaved Caspase-9和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）。丹參-紅花藥對(duì)能夠通過調(diào)控PI3K/PDK1/Akt信號(hào)通路，從而發(fā)揮對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌缺血的保護(hù)作用。

丹參-紅花藥對(duì)；心肌缺血；磷脂酰肌醇3-激酶/磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1/蛋白激酶B信號(hào)通路；心肌酶；心肌蛋白；丹參素；羥基紅花黃色素A；迷迭香酸；紫草酸；丹酚酸B

缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）的發(fā)病率及死亡率逐年上升，給國(guó)家和人民帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)IHD主要采用藥物干預(yù)及手術(shù)治療，然而手術(shù)治療可能出現(xiàn)心肌缺血-再灌注（myocardial ischemia-reperfusion，MI/R），造成不可逆的心肌二次損傷[4-5]。中藥已有上千年的藥用歷史，能夠有效地緩解IHD患者的癥狀，其多成分、多靶點(diǎn)治療的特點(diǎn)及整體觀念對(duì)病理機(jī)制復(fù)雜的IHD展現(xiàn)出較好的臨床療效[6-7]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參具有改善微循環(huán)、增加冠脈血流、擴(kuò)血管、清除自由基、抗炎、抗氧化、抑制血小板凝集等作用，臨床常用于治療心肌缺血、心肌梗死、腦缺血等心腦血管疾病[8-12]。紅花具有降壓、抗炎、抗心律失常、抗氧化、抗腫瘤、抗缺血等作用，臨床常用于治療冠心病、心絞痛、腦血栓等多種心腦血管疾病[13-15]。丹參-紅花常作為活血化瘀藥對(duì)被廣泛用于治療冠心病、心絞痛等缺血性心血管疾病，其藥理作用及臨床療效顯著[16]。復(fù)方丹參滴丸由丹參、三七、冰片組成，具有活血化瘀之功效，用于治療冠心病心絞痛等癥，且給藥，與丹參-紅花藥對(duì)的功效、臨床應(yīng)用及給藥途徑均一致，本研究以復(fù)方丹參滴丸為陽性對(duì)照藥物，采用鹽酸異丙腎上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO）構(gòu)建急性心肌缺血大鼠模型，基于磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1，PDK1）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路探討丹參-紅花藥對(duì)對(duì)心肌缺血的保護(hù)機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2020-030，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)0043215，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK（川）2020-030。動(dòng)物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)中心的動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度（75±5）%，12 h光照/黑暗交替，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行（批準(zhǔn)號(hào)SUCMDL-20190309001）。

1.2 藥材

丹參飲片（產(chǎn)地山東，批號(hào)160821）、紅花飲片（產(chǎn)地新疆，批號(hào)181012）購(gòu)自安徽澤華國(guó)藥飲片有限公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)白吉慶教授鑒定分別為唇形科植物丹參Bge.的干燥根及根莖、菊科植物紅花L.的干燥花，均符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

復(fù)方丹參滴丸（批號(hào)202012）購(gòu)自天津天士力制藥股份有限公司；戊巴比妥鈉（批號(hào)57-33-0）購(gòu)自德國(guó)Merck公司；ISO（批號(hào)I5627-5G）、2,3,5-三苯基氯化四唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC，批號(hào)T8877-100G）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蘇木素（批號(hào)517-28-2）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；醇溶性伊紅Y（批號(hào)15086-94-9）購(gòu)自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；肌紅蛋白（myoglobin，MB）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml016170）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase，CK）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml076416）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml-E5734）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml076592）、CK-MB檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml-slisa-4870）、心肌肌鈣蛋白-I（cardiac troponin-I，CTn-I）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml092662）、CTn-T檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml076416）、C反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml092609）、末端利鈉肽前體（-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml028489）和B型腦利鈉肽（B-brain natriuretic peptides，BNP）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ml076416）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TUNEL檢測(cè)試劑盒（批號(hào)WLA029a）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)WLA004）、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）抗體（批號(hào)WL01980）、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-NF-κB p65）抗體（批號(hào)WL02169）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)WL01556）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)WL01637）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號(hào)WL02117）、Caspase-9抗體（批號(hào)WL03421）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗體（批號(hào)WL01789）、Akt抗體（批號(hào)WL0003b）、p-Akt抗體（批號(hào)WLP001）、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（批號(hào)WLA023）、β-actin抗體（批號(hào)WL01845）購(gòu)自沈陽萬類生物科技有限公司；p-eNOS抗體（批號(hào)9570）購(gòu)自美國(guó)CST公司；細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）抗體（批號(hào)AC909）購(gòu)自碧云天生物；PI3K抗體（批號(hào)ab191606）、p-PI3K抗體（批號(hào)ab182651）、PDK1抗體（批號(hào)ab90444）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.4 儀器

KD-3358型切片機(jī)（浙江金華科迪公司）；顯微鏡（日本Nikon公司）；DYCZ-24DN型蛋白電泳儀、WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一公司）；H-2050R型超速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀公司）；BioTek ELx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 丹參-紅花藥對(duì)的制備

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹參-紅花藥對(duì)（3∶1）時(shí)療效最佳，故按照質(zhì)量比3∶1取丹參、紅花飲片適量，加8倍量的水室溫浸泡1 h，45 ℃浸泡提取3次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，采用HPLC法測(cè)定干燥后粉末中主要成分丹參素、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.70、17.20、1.76、4.58、55.18 mg/g。取適量粉末，加水溶解至質(zhì)量濃度為1.6 g/mL（以生藥量計(jì)）的溶液，作為高劑量組藥液；按照2倍稀釋得中、低劑量組藥液。

2.2 動(dòng)物分組與給藥

SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、復(fù)方丹參滴丸（73 mg/kg）組和丹參-紅花低、中、高劑量（4、8、16 g/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的1、2、4倍）組，每組10只。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig等體積純凈水，1次/d，連續(xù)7 d。于第6天開始ig藥物1 h后造模，除對(duì)照組外，其余各組大鼠于0 ℃的冰浴中寒冷刺激4 min，然后sc ISO（85 mg/kg），1次/d，連續(xù)2 d。

2.3 樣本收集

末次sc ISO 12 h后，大鼠ip 2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心，用于心肌酶以及心肌蛋白的檢測(cè)；取出心臟，用于蘇木素-伊紅（HE）、TTC、TUNEL染色和相關(guān)蛋白檢測(cè)。

2.4 丹參-紅花對(duì)模型大鼠心肌梗死的影響

取各組大鼠心臟，切開后快速將心室部分切片，經(jīng)2% TTC溶液室溫處理25 min，用10%福爾馬林溶液固定。未梗塞的心肌被染成紅色，而梗塞的心肌未被染色。數(shù)碼相機(jī)拍照，輸入電腦，用Image J軟件分析染色切片的圖像，計(jì)算梗死面積[16]。

2.5 丹參-紅花對(duì)模型大鼠心肌病理的影響

取固定的心臟，修塊，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯處理后石蠟包埋，切片（5 μm），溫水展片并移到載玻片上，烘干，依次放入二甲苯I、II中進(jìn)行脫蠟，進(jìn)行HE染色，滴加中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察并拍照[12,16]。

2.6 丹參-紅花對(duì)模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

取固定的心臟，梯度乙醇處理后，二甲苯浸泡至標(biāo)本透明，石蠟包埋，切片（5 μm），溫水展片并移至載玻片上，烘干，依次以二甲苯、梯度乙醇和蒸餾水處理，PBS漂洗后，依次滴加0.1% Triton X-100、3% H2O2、TUNEL反應(yīng)液、Converter-POD和DAB底物處理，PBS漂洗，浸入蘇木素染色，自來水沖洗，浸入1%鹽酸乙醇中處理，自來水沖洗，依次浸入梯度乙醇和二甲苯中處理，中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察并拍照，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率[12,16]。

凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)

2.7 丹參-紅花對(duì)模型大鼠心肌酶以及心肌蛋白的影響

按試劑盒說明書測(cè)定大鼠血清中CK、AST、LDH、CK-MB活性及CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平。

2.8 丹參-紅花對(duì)模型大鼠PI3K/PDK1/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

取各組大鼠心肌組織，切割成小塊，液氮研磨，加入裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h；分別加入NF-κB p65（1∶500）、p-NF-κB p65（1∶500）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶1000）、Caspase-3（1∶500）、Caspase-9（1∶500）、eNOS（1∶500）、p-eNOS（1∶500）、PDK1（1∶500)、Cyt C（1∶500）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶500）、PI3K（1∶500）、p-PI3K（1∶500）、β-actin（1∶1000）抗體，4 ℃孵育過夜；分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶5000），室溫孵育2 h，加入ECL試劑顯色，暗室曝光。使用Gel Pro Analyzer軟件分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 丹參-紅花對(duì)寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌梗死的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌梗死面積顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組和丹參-紅花中、高劑量組大鼠心肌梗死面積均顯著降低（＜0.01）。

3.2 丹參-紅花對(duì)寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌病理的影響

如圖2所示，對(duì)照組大鼠心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，染色均勻，胞核染清晰，紋理清晰，偶見心肌間質(zhì)散在炎性細(xì)胞；模型組心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，心肌細(xì)胞界限不清，心肌間質(zhì)疏松、充血、腫脹，伴有多量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維斷裂，細(xì)胞核固縮、碎裂，有溢出，說明造模成功；與模型組比較，各給藥組心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)均得到不同程度改善。

A-對(duì)照組 B-模型組 C-復(fù)方丹參滴丸組 D-丹參-紅花低劑量組 E-丹參-紅花中劑量組 F-丹參-紅花高劑量組 與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 丹參-紅花對(duì)寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌病理的影響

3.3 丹參-紅花對(duì)寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.4 丹參-紅花對(duì)寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌酶及心肌蛋白的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿中CK、AST、LDH、CK-MB活性及CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血漿中CK、AST、CK-MB活性及CTn-T水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；復(fù)方丹參滴丸組和丹參-紅花中、高劑量組大鼠血漿中LDH活性及CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖3 丹參-紅花對(duì)寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響(, n = 10)

圖4 丹參-紅花對(duì)寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠血漿中心肌酶活性以及心肌蛋白水平的影響(, n = 10)

3.5 丹參-紅花對(duì)寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌組織PI3K/PDK1/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，各組eNOS、NF-κB p65、PI3K、Akt、Caspase-3前體（pro Caspase-3）和pro Caspase-9蛋白表達(dá)水平無顯著差異。與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中p-PI3K、PDK1、p-Akt、p-eNOS和Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），p-NF-κB p65、Bax、Cyt C、剪切型Caspase-3（cleaved Caspase-3）和cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織中p-Akt和p-eNOS蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）；復(fù)方丹參滴丸組和丹參-紅花中、高劑量組大鼠心肌組織中p-PI3K、PDK1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），Bax、Cyt C、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

4 討論

機(jī)體功能性改變或器質(zhì)性病變導(dǎo)致冠脈血流和心肌需求之間不平衡，會(huì)引起心肌缺血（主要包括急性心肌缺血和慢性心肌缺血），導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同程度的心肌損害。引起IHD的原因較多，如血壓波動(dòng)范圍大；心臟的血管畸形；冠脈硬化、閉塞、狹窄；情緒緊張、焦慮以及睡眠不足等。IHD可刺激心肌細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生纖維化，促進(jìn)心肌間質(zhì)重構(gòu)，損傷心臟，同時(shí)當(dāng)心肌缺血時(shí)，血漿中心肌酶活性以及心肌蛋白水平會(huì)異常升高，長(zhǎng)時(shí)間的缺血會(huì)引發(fā)心肌梗死。血漿中心肌酶活性以及心肌蛋白水平的異常升高、心肌細(xì)胞凋亡、心肌梗死面積被認(rèn)為是評(píng)價(jià)急性心肌缺血的主要指標(biāo)。CK、AST、LDH、CK-MB、CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP和BNP是心肌梗死早期診斷的敏感指標(biāo)，心肌損傷發(fā)病6～9 h后血漿中上述指標(biāo)出現(xiàn)增高并持續(xù)數(shù)天，因此，上述指標(biāo)對(duì)心肌損傷的敏感性和特異性都較高。雖然上述指標(biāo)在心肌梗死后開始升高的時(shí)間和持續(xù)的時(shí)間存在差異，但在心肌梗死12 h后，上述指標(biāo)仍處于異常水平，因此本研究在末次sc ISO后12 h取血測(cè)定上述心肌酶活性和心肌蛋白水平，結(jié)果顯示，模型組CK、AST、LDH、CK-MB活性以及CTn-I、CTn-T、CRP、MB、NT-proBNP、BNP水平均顯著高于對(duì)照組，表明心肌梗死12 h后，上述指標(biāo)仍處于異常水平。

圖5 丹參-紅花對(duì)寒凝血瘀型心肌缺血模型大鼠心肌組織PI3K/PDK1/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 10)

中醫(yī)中藥治療IHD有著幾千年的經(jīng)驗(yàn)積累，其治療效果顯著，越來越受到人們的重視，然而中藥“方-證”的對(duì)應(yīng)關(guān)系及其作用機(jī)制尚不明確。采用適宜的動(dòng)物模型研究中醫(yī)藥理論是提高中醫(yī)藥臨床療效、提高中醫(yī)診療水平、促進(jìn)中醫(yī)藥發(fā)展和中藥現(xiàn)代化的有效途徑[17-18]。目前主要通過開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支或藥物誘導(dǎo)復(fù)制心肌缺血模型。然而開胸手術(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率低，實(shí)驗(yàn)難度大，要求技術(shù)人員要有豐富的心導(dǎo)管實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和嫻熟的技術(shù)；藥物誘導(dǎo)法操作簡(jiǎn)單，與人心臟陣發(fā)性疼痛的病理處境接近，ISO是常用的藥物之一，復(fù)制的心肌缺血模型不但具有心絞痛的病理狀態(tài)而且模型的病理狀態(tài)穩(wěn)定[19-20]。中醫(yī)認(rèn)為心肌缺血多為心脾肝腎虛，心脈失養(yǎng)，血瘀、寒凝、氣滯，痹阻心脈，其中血瘀是病理關(guān)鍵[18,21]。本研究參考寒凝血瘀證動(dòng)物模型[22]和心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ蚚12]的制備，結(jié)合寒凝血瘀型心肌缺血疾病的冬季發(fā)病特點(diǎn)，采用ISO和寒冷刺激聯(lián)合的方法，建立大鼠寒凝血瘀證心肌缺血模型，結(jié)果顯示，模型大鼠爪尾部呈現(xiàn)紫色，身體蜷縮、少動(dòng)，甚至出現(xiàn)寒戰(zhàn)等癥狀，心肌組織病理、血漿中心肌酶活性和心肌蛋白水平與對(duì)照組比較均有顯著性差異，表明建立的寒凝血瘀心肌缺血大鼠模型符合中醫(yī)證侯特點(diǎn)，因此本研究參照文獻(xiàn)方法[12,22]和前期實(shí)驗(yàn)積累，選用ISO同時(shí)聯(lián)合寒冷刺激制備寒凝血瘀型的心肌缺血大鼠模型，研究丹參-紅花活血化瘀藥對(duì)抗心肌缺血的作用機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/PDK1/Akt信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮生成等保護(hù)心臟[23-24]。激活的PI3K不能直接使Akt磷酸化，需要和PDK1結(jié)合，最終激活A(yù)kt，活化的Akt可使eNOS磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源性NO的產(chǎn)生。NO具有促進(jìn)內(nèi)皮再生、血管舒張等作用，從而改善動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病引起的心肌缺血、缺氧或壞死；激活的Akt通過激活抗凋亡蛋白Bcl-2或激活NF-κB p65使其進(jìn)入細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄抗凋亡基因，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。研究表明，PI3K/Akt途徑可以調(diào)控藥物對(duì)ISO引起的心肌缺血性損傷的保護(hù)作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心肌組織中PI3K/Akt通路被抑制，導(dǎo)致p-PI3K、PDK1和p-Akt蛋白表達(dá)水平降低；丹參-紅花藥對(duì)能夠顯著上調(diào)ISO誘導(dǎo)的p-PI3K、PDK1和p-Akt蛋白表達(dá)的降低。表明丹參-紅花可能通過調(diào)控PI3K/PDK1/Akt信號(hào)通路來保護(hù)心肌缺血。

PI3K/PDK1/Akt信號(hào)通路能夠通過調(diào)控Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族。Bcl-2蛋白家族包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，能夠控制線粒體外膜的通透性，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。線粒體釋放Cyt C并激活Caspase-9，隨后激活Caspase-3[26]。Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，是Caspase家族的關(guān)鍵成員。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織中Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞凋亡的特征一致。TTC結(jié)果顯示丹參-紅花對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌缺血具有顯著的抑制作用，進(jìn)一步通過HE染色結(jié)果看出，模型組大鼠心肌細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮等凋亡的現(xiàn)象，丹參-紅花可以顯著改善心肌細(xì)胞形態(tài)，推測(cè)丹參-紅花能夠抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證此推測(cè)，本研究進(jìn)一步通過TUNEL染色檢測(cè)丹參-紅花藥對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，而丹參-紅花藥對(duì)能夠顯著降低ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，證實(shí)了丹參-紅花對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。此外，Western blotting結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織中促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達(dá)水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平顯著降低；丹參-紅花能夠顯著降低促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達(dá)，升高抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，表明其可能通過調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮抗ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，丹參-紅花藥對(duì)能夠通過調(diào)控PI3K/ PDK1/Akt信號(hào)通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Zhou M G, Wang H D, Zeng X Y,. Mortality, morbidity, and risk factors in China and its provinces, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017 [J]., 2019, 394(10204): 1145-1158.

[2] 中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告編寫組. 中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020概要 [J]. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2021, 36(6): 521-545.

[3] GBD Diseases and Injuries Collaborators. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019 [J]., 2020, 396(10258): 1204-1222.

[4] 張桂歡, 田海. 胚胎干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病研究的進(jìn)展 [J]. 心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 30(3): 360-363.

[5] 李澤華, 關(guān)賢頌, 蔣路平. 黃芪甲苷通過NRF2/HO-1信號(hào)通路減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷 [J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2021, 37(12): 2147-2153.

[6] 甘家麗, 曾妙, 黃洋, 等. 中藥基于PI3K/Akt信號(hào)通路防治心肌缺血/再灌注損傷的研究進(jìn)展 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2020, 35(7): 3527-3529.

[7] Zhang K J, Zheng Q, Zhu P C,. Traditional Chinese medicine for coronary heart disease: Clinical evidence and possible mechanisms [J]., 2019, 10: 844.

[8] 王云龍, 房岐, 鄭超. 丹參化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥業(yè), 2020, 29(15): 6-10.

[9] 萬新煥, 王瑜亮, 周長(zhǎng)征, 等. 丹參化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2020, 51(3): 788-798.

[10] 郝晨偉, 李正翔, 張銘慧, 等. 丹參及其配伍制劑治療冠心病的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(13): 4096-4106.

[11] 馮科冉, 李偉霞, 王曉艷, 等. 丹參化學(xué)成分、藥理作用及其質(zhì)量標(biāo)志物 (Q-Marker) 的預(yù)測(cè)分析 [J]. 中草藥, 2022, 53(2): 609-618.

[12] Wang X P, Wang P F, Bai J Q,. Investigating the effects and possible mechanisms of Danshen-Honghua herb pair on acute myocardial ischemia induced by isoproterenol in rats [J]., 2019, 118: 109268.

[13] Wang C L, Gao Y, Zhang Z K,. Safflower yellow alleviates osteoarthritis and prevents inflammation by inhibiting PGE2 release and regulating NF-κB/SIRT1/AMPK signaling pathways [J]., 2020, 78: 153305.

[14] Chen H F, Ma Y N, Chen M,. Safflower extract improves depression in mice by inhibiting the TLR4-NLRP3 inflammation signaling pathway [J]., 2021, 10(7): 8015-8023.

[15] Sun L P, Shi F F, Zhang W W,. Antioxidant and anti-inflammatory activities of safflower (L.) honey extract [J]., 2020, 9(8): E1039.

[16] Bai J Q, Wang X P, Du S B,. Study on the protective effects of Danshen-Honghua herb pair (DHHP) on myocardial ischaemia/reperfusion injury (MIRI) and potential mechanisms based on apoptosis and mitochondria [J]., 2021, 59(1): 335-346.

[17] 王珊珊, 范乃兵, 鞠曉云, 等. 動(dòng)物模型在中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究 [J]. 今日畜牧獸醫(yī), 2019, 35(12): 57-58.

[18] 馮雨菲, 何貴新, 申永艷, 等. 心肌缺血中醫(yī)動(dòng)物模型制備及中醫(yī)藥防治新進(jìn)展 [J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2022, 28(7): 555-560.

[19] 范英蘭, 胡麗萍, 朱竟赫, 等. 心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ蛯?shí)驗(yàn)研究進(jìn)展 [J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué), 2018, 35(1): 72-75.

[20] 閆陽, 姚禹, 陳起帆. 藥物致心肌損傷的方法舉例與評(píng)估 [J]. 臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志, 2017, 4(31): 6125-6126.

[21] 李思成, 王華, 吳松, 等. “心與小腸相表里”理論在心肌缺血疾病中的運(yùn)用 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2020, 31(1): 153-155.

[22] 楊延澤, 鄧毅, 楊秀娟, 等. 當(dāng)歸配伍不同藥對(duì)寒凝血瘀模型大鼠活血作用研究 [J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2019, 35(20): 2626-2630.

[23] 趙丹丹, 瞿惠燕, 楊濤, 等. 鹿紅方調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路抑制心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志, 2022, 29(7): 67-72.

[24] 周瑞, 唐志書, 蘇潔, 等. 正源方通過調(diào)控PI3K/AKT通路對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究[J]. 中藥材, 2022, 45(2): 462-466.

[25] 劉晨杰, 姚麗, 張力, 等. B型鈉尿肽對(duì)急性心肌缺血損傷發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制 [J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2020, 39(3): 1356-1361.

[26] Obeng E. Apoptosis (programmed cell death) and its signals-A review [J]., 2021, 81(4): 1133-1143.

Protective mechanism ofetdrug pair on myocardial ischemia rats with cold coagulation and blood stasis syndrome based on PI3K/PDK1/Akt signaling pathway

WANG Xiao-ping, XUE Zhi-peng, DU-Shao-bing, ZHOU Hui-hui, BAI Ji-qing, LI Jing, WANG Peng-fei, XIE Li-hong, CHEN Ni

College of pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China

To study the protective effect and mechanism of Danshen (et)-Honghua () on myocardial ischemia rats induced by isoprenaline hydrochloride (ISO).Rats were randomly divided into control group, model group, Compound Danshen Dropping Pills (73 mg/kg) group andet-low-, medium-and high-dose (4, 8, 16 g/kg) groups, rats were given corresponding drug for 7 d. 1 h after ig drug on 6th day, rats were stimulated with cold in ice bath at 0 ℃ for 4 min and sc ISO (85 mg/kg) for 2 d. 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining was used to determine the myocardial infarction area of rats in each group; TUNEL method was used to detect myocardial cell apoptosis of rats in each group; Hematoxylin-eosin (HE) staining method was used to observe the pathological changes in myocardial tissue of rats in each group; ELISA method was used to detect creatine kinase (CK), aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH), CK-myoglobin (MB) activities and cardiac troponin-I (CTn-I), CTn-T , C-reaction protein (CRP), MB,-terminal pro-brain natriuretic peptide (NT-proBNP), B-brain natriuretic peptides (BNP) levels in plasma of rats in each group; Western blotting was used to detect phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), phosphorylated PI3K (p-PI3K), pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1 (PDK1), protein kinase B (Akt), p-Akt, endothelial nitric oxide synthase (eNOS), p-eNOS, B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65), p-NF-κB p65, Bcl-2 associated X protein (Bax), cytochrome C (Cyt C), cysteine-aspartate protease-3 (Caspase-3) and Caspase-9 protein expressions in myocardial tissue of rats in each group.et-significantly inhibited the myocardial infarction area in ISO-induced myocardial ischemia model rats (< 0.01), improved the pathological changes of myocardial tissue, significantly inhibited the apoptosis of cardiomyocytes (< 0.05, 0.01), significantly decreased myocardial enzyme activities and myocardial protein levels in plasma (< 0.05, 0.01), significantly increased protein expression levels of Bcl-2, PDK1, p-eNOS, p-PI3K and p-Akt in myocardial tissue (< 0.05, 0.01), decreased protein expression levels of Bax, Cyt C, cleaved Caspase-3 (cleaved Caspase-3), cleaved Caspase-9 and p-NF-κB p65 (< 0.05, 0.01).et-drug pair can exert a protective effect on ISO-induced myocardial ischemia by regulating PI3K/PDK1/Akt signaling pathway.

et-drug pair; myocardial ischemia; PI3K/PDK1/Akt signaling pathway; myocardial enzymes; cardiac proteins; Danshensu; hydroxysafflor yellow A; rosmarinic acid; shikoric acid; salvianolic acid B

R285.5

A

0253 - 2670(2022)16 - 5085 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.018

2022-04-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81974544）；陜西省科學(xué)技術(shù)廳資助項(xiàng)目（2019SF-286）；陜西省教育廳資助項(xiàng)目（18JS025）

王小平（1976—），女，碩士生導(dǎo)師，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (029)38185165 E-mail: wangxiaoping323@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]