涂宛晴，梁秋兒，謝鵬程，謝 婷，林麗群，陳利國

基于TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路研究消積丸治療?/?小鼠動脈粥樣硬化的機制

涂宛晴，梁秋兒，謝鵬程，謝 婷，林麗群，陳利國*

暨南大學中醫(yī)學院，廣東 廣州 510632

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和動物實驗相結(jié)合的方法探討消積丸治療動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的作用機制。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學進行活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析、基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。50只雄性?∕?小鼠隨機分為對照組、模型組、阿托伐他?。?.3 mg/kg）組和消積丸低、高劑量（8.125、32.500 g/kg）組，模型組和各給藥組以高脂飲食喂養(yǎng)，給予相應(yīng)藥物干預(yù)4周后，采用全自動生化儀分析小鼠血清脂質(zhì)水平；采用ELISA法檢測小鼠血清中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）、Masson和油紅O染色觀察小鼠主動脈竇病理變化；采用Western blotting法檢測小鼠主動脈組織中TNF-α/κB抑制因子激酶β（inhibitor κB kinase β，IKKβ）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路相關(guān)蛋白及CD36蛋白表達。共篩選出消積丸136個活性成分及277個作用靶點，4481個AS疾病相關(guān)靶點，消積丸和AS的共同靶點有205個，核心靶點主要包括TNF、IL-6、NF-κB、IL-1β等。GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，消積丸治療AS主要涉及炎癥反應(yīng)、一氧化氮生物合成等過程，調(diào)控癌癥通路、乙肝通路、TNF信號通路等；在TNF信號通路中進一步篩選得到TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路。動物實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清中三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、IL-1β、IL-6、TNF-α、ox-LDL水平均顯著升高（＜0.01）；主動脈中TNF-α蛋白表達以及IKKβ、NF-κB p65磷酸化水平均顯著升高（＜0.01）；主動脈竇內(nèi)膜不光滑，出現(xiàn)大量膠原纖維和脂質(zhì)沉積（＜0.01），形成明顯的AS斑塊。與模型組相比，消積丸組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、TNF-α、IL-6、ox-LDL水平均顯著降低（＜0.05、0.01），血清中HDL-C水平顯著升高（＜0.01）；主動脈中TNF-α、CD36蛋白表達以及IKKβ、NF-κB p65磷酸化水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；主動脈竇AS斑塊減少，膠原蛋白和脂質(zhì)沉積等情況均得到改善（＜0.05、0.01）。消積丸能夠通過下調(diào)TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達，減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，從而發(fā)揮治療AS的作用。

消積丸；網(wǎng)絡(luò)藥理學；動脈粥樣硬化；腫瘤壞死因子-α/κB抑制因子激酶β/核因子-κB信號通路；炎癥反應(yīng)；脂質(zhì)代謝；大黃素；大黃酚；熊果酸

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種嚴重危害人體，引發(fā)心肌缺血、心肌梗死和腦卒中等多種心血管疾病的慢性炎癥性疾病[1-2]。AS多發(fā)生于大、中血管內(nèi)膜，其早期病變?yōu)橹|(zhì)在血管內(nèi)過多沉積，繼而形成斑塊，嚴重時斑塊破裂，形成血栓[3]。AS發(fā)病率高，每年約2000萬人死于此病，因此尋求有效手段防治AS具有重要意義[4]。AS屬中醫(yī)學“脈積”病證范疇，是氣血凝聚、息積于脈所致，見于多種血管病變。其基本病機為氣滯血瘀、痰瘀凝滯、毒邪侵蝕等，常以活血祛瘀、化痰導(dǎo)滯、清熱解毒等方藥進行辨證治療，抑制斑塊形成，減輕炎癥反應(yīng)[5]。消積丸是臨床上消積導(dǎo)滯的常用中成藥，由大黃、牽牛子、山楂、六神曲、麥芽、五靈脂、青皮、陳皮、三棱、莪術(shù)、香附共11味中藥組成。其中大黃、牽牛子為清熱藥，合用攻下瀉熱，破積行瘀；三棱、莪術(shù)、五靈脂為活血藥，具有破血行氣、消積化瘀之功效；山楂、六神曲、麥芽為消積藥，具有消食化滯、健脾開胃的功效；青皮、陳皮、香附為理氣藥，具有理氣消積、疏肝健脾之功效。諸藥合用共奏消積導(dǎo)滯、行氣活血、化痰祛濕、疏肝健脾之功效，從中醫(yī)理論上可以治療脈積病證，但其具體的作用機制尚未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學是在系統(tǒng)生物學的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代的計算機技術(shù)構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地進行觀察分析，揭示藥物對疾病的影響和作用的一種研究方法[6-7]。中藥復(fù)方通過多種有效活性成分、多個作用靶點和多種作用途徑對疾病進行治療。運用網(wǎng)絡(luò)藥理學研究中藥復(fù)方，可以系統(tǒng)地揭示中藥復(fù)方對疾病網(wǎng)絡(luò)的作用和機制，體現(xiàn)中醫(yī)藥治療疾病的整體性[8]。本研究首先基于網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)探討消積丸防治AS的潛在作用機制，篩選出關(guān)鍵信號通路，然后進行動物實驗驗證，為消積丸防治AS提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性?∕?小鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，許可證號SCXK（蘇）2018-0008，所有小鼠均在暨南大學SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)，自由進食飲水，光照時間8: 00～20: 00。本動物實驗方案獲得暨南大學實驗動物倫理委員會批準（倫理號20201019-03）。

1.2 藥材

大黃（批號20200319）、牽牛子（批號20180630）、山楂（批號20090702）、六神曲（批號19082610）、麥芽（批號19072102）、五靈脂（批號20191120）、青皮（批號200703）、陳皮（批號20081101）、三棱（批號20190710）、莪術(shù)（批號20190731）、香附（批號20072507）均購自北京同仁堂廣州藥業(yè)連鎖有限公司，經(jīng)暨南大學劉紅杰副教授鑒定分別為蓼科植物掌葉大黃L.的干燥根和根莖、旋花科植物裂葉牽牛(L.) Choisy的干燥成熟種子、薔薇科植物山楂Bge.的干燥成熟果實、辣蓼、青蒿、杏仁等藥加入面粉或麩皮混和后，經(jīng)發(fā)酵而成的曲劑、禾本科植物大麥L.的成熟果實經(jīng)發(fā)芽干燥的炮制加工品、鼯鼠科動物復(fù)齒鼯鼠的干燥糞便、蕓香科植物橘Blanco及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮、蕓香科植物橘Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮、黑三棱科植物黑三棱Buch.-Ham.的干燥塊莖、姜科植物蓬莪術(shù)Val.的干燥根莖、莎草科植物莎草L.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

阿托伐他汀鈣片（批號DD6317）購自輝瑞制藥有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）ELISA試劑盒（批號20210318）購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染液、Masson染液、油紅O染液購自Servicebio公司；CD36抗體、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65抗體、磷酸化NF-κB p65（S536）抗體、κ抑制因子激酶β（inhibitor κB kinase β，IKKβ）抗體、磷酸化IKKβ（Y188）抗體、TNF-α抗體購自英國Abcam公司，批號分別為ab133625、ab32536、ab76302、ab124957、ab194519、ab183218；總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒購自深圳雷杜生命科學股份有限公司，批號分別為20210118、20210420、20210421、20210123。

1.4 儀器

酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Chemray 800型全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；VE180型垂直電泳槽、VE186型轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司）；BG-Power 600i型電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；5427R型小型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Cryostar NX50型切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Eclipse E100型正置光學顯微鏡（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學

2.1.1 消積丸靶點的獲取 運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/ tcmsp.php/）獲得消積丸活性成分和作用靶點；利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)換為相對應(yīng)的基因Symbol。

2.1.2 AS相關(guān)靶點獲取 通過人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https://www.genecards.org/）檢索AS相關(guān)基因，將獲得的靶點基因與消積丸對應(yīng)的基因比較分析。

2.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Cytoscape軟件對消積丸-靶點網(wǎng)絡(luò)和AS基因PPI網(wǎng)絡(luò)進行映射，將消積丸與疾病的相交靶點可視化。利用String軟件制作蛋白互作圖。對消積丸治療AS的藥理作用進行深入探討。

2.1.4 關(guān)鍵靶點通路富集 使用DAVID數(shù)據(jù)庫對獲得的消積丸和AS的共同靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2.2 動物實驗

2.2.1 消積丸的制備 按組方取大黃10 g、牽牛子3 g、山楂30 g、六神曲15 g、麥芽15 g、五靈脂6 g、青皮10 g、陳皮10 g、三棱10 g、莪術(shù)10 g、香附6 g，將藥材浸入蒸餾水30 min，武火煮沸，文火煎30 min，將藥液濾過，殘渣中加入蒸餾水，再煎1次，合并2次濾液，水浴濃縮為質(zhì)量濃度為5 g/mL（以生藥量計）的溶液，經(jīng)高效液相色譜儀測定其主要含大黃素112.47 μg/g、大黃酚361.40 μg/g、熊果酸333.93 μg/g[9-10]，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 動物分組、造模和給藥 將50只?∕?小鼠，按體質(zhì)量隨機分為對照組、模型組、阿托伐他?。?.3 mg/kg，臨床等效劑量）組和消積丸低、高劑量（8.125、32.500 g/kg，分別相當于臨床劑量的0.5、2倍）組，每組10只。對照組以普通飲食喂養(yǎng)，模型組和各給藥組以高脂飲食喂養(yǎng)12周。自第8周開始，各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)4周。

2.2.3 血脂水平檢測 第12周末，小鼠稱定質(zhì)量后麻醉，眼球取血，室溫靜置2 h后，4 ℃、4000 r/min離心15 min，吸取上層血清，采用全自動生化儀檢測TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。

2.2.4 血清炎癥因子和ox-LDL水平檢測 按照試劑盒說明書測定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和ox-LDL水平。

2.2.5 主動脈組織HE、Masson和油紅O染色 取各組小鼠心臟組織，清洗后，于4%多聚甲醛溶液中固定，包埋后對主動脈竇區(qū)域進行連續(xù)切片，厚度5 μm，分別進行HE、Masson和油紅O染色，于光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.6 Western blotting檢測主動脈TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白及CD36蛋白表達 分離各組小鼠主動脈，加入裂解液提取蛋白。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別加入一抗和二抗，加入化學發(fā)光試劑后，顯影并固定在X線膠片上。

3 結(jié)果

3.1 消積丸治療AS的靶點

如圖1所示，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共獲得了消積丸136個活性成分和482個作用靶點。從GeneCards獲得了AS相關(guān)靶點4686個，與消積丸靶點取交集，得到205個共有靶點。利用Cytoscape軟件將消積丸與AS的共有靶點進行可視化（圖2）。通過String數(shù)據(jù)庫，獲得PPI圖，圖中的圓形節(jié)點代表蛋白，用直線連接的2個蛋白之間具有一定的相互作用關(guān)系，以節(jié)點的多少和顏色的深淺代表互作關(guān)系的強弱，排名前30的靶點作為核心靶點，包括TNF-α、IL-6、NF-κB、IL-1β等（圖3）。

3.2 GO功能和KEGG通路富集分析

使用DAVID對消積丸與AS的共同靶點進行GO功能富集分析見圖4，發(fā)現(xiàn)主要涉及的生物過程包括調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、一氧化氮生物合成等，在細胞外間隙、胞質(zhì)溶膠等細胞組分中起作用，激活了酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等分子功能。進一步通過KEGG通路富集分析（圖5）篩選出癌癥通路、乙肝通路、TNF信號通路等富集基因數(shù)較多的通路，可能是消積丸參與防治AS的重要作用途徑。基于富集到的TNF信號通路，進一步篩選得到TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路（圖6），開展動物實驗進行驗證。

圖1 消積丸-AS靶點的Venn圖

圖2 消積丸-靶點-AS網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 GO功能富集分析

3.3 消積丸對ApoE?∕?小鼠血清脂質(zhì)水平的影響

如圖7所示，與對照組相比，模型組小鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠血清中TG、TC水平均顯著降低＜0.05、0.01），阿托伐他汀組和消積丸低劑量組小鼠血清中HDL-C水平顯著升高（＜0.05、0.01），LDL-C水平顯著降低（＜0.01）。提示消積丸對?∕?小鼠血清脂質(zhì)水平具有調(diào)節(jié)作用。

3.4 消積丸對ApoE?∕?小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和ox-LDL水平的影響

如圖8所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和ox-LDL水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組血清中IL-6和ox-LDL水平降低（＜0.01），阿托伐他汀組和消積丸高劑量組TNF-α水平明顯降低（＜0.05）。提示消積丸對?∕?小鼠血清炎癥水平具有調(diào)節(jié)作用。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路

CON-對照組；MOD-模型組；ATO-阿托伐他汀組；XL-消積丸低劑量組；XH-消積丸高劑量組 與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下同

圖8 消積丸對ApoE?∕?小鼠血清炎癥因子水平的影響(, n = 4)

3.5 消積丸對ApoE?∕?小鼠主動脈竇AS病變的影響

如圖9所示，對照組小鼠主動脈竇內(nèi)皮完整，分界較清晰，未見明顯病理征象。模型組小鼠主動脈竇內(nèi)膜不光滑，出現(xiàn)大量膠原纖維和脂質(zhì)沉積（＜0.01），可見大量炎性細胞和泡沫細胞堆積，形成明顯的AS斑塊，表示AS模型建立成功。與模型組相比，各給藥組小鼠主動脈竇AS斑塊均不同程度地減少，脂質(zhì)沉積及纖維化等情況均得到改善（＜0.05、0.01）。

3.6 消積丸對ApoE?∕?小鼠主動脈TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白及CD36蛋白表達的影響

為了進一步研究消積丸調(diào)節(jié)脂質(zhì)和炎癥的機制，檢測了TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路中的關(guān)鍵蛋白TNF-α、IKKβ、p-IKKβ、NF-κB p65、p-NF-κB p65。如圖10所示，與對照組相比，模型組小鼠主動脈中TNF-α蛋白表達和IKKβ、NF-κB p65磷酸化水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠主動脈中TNF-α蛋白表達和IKKβ、NF-κB p65磷酸化水平均顯著降低（＜0.05、0.01），消積丸高劑量組和阿托伐他汀組CD36蛋白表達水平明顯降低（＜0.05）。

4 討論

AS是一種以脂質(zhì)代謝異常、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等為主要病理基礎(chǔ)的慢性血管性疾病[11]。其主要病理改變?yōu)橹|(zhì)在血管內(nèi)皮沉積、纖維組織逐漸增生、動脈壁變厚變硬、管腔狹窄，屬中醫(yī)學“脈積”范疇。脈積，因氣血凝積、稽留日久而成，有留著于孫脈、絡(luò)脈、經(jīng)脈、輸脈、伏沖脈之不同，但其病變部位皆在于脈。臨床所見，痰濁、瘀血、毒邪，以及臟腑功能失調(diào)等因素常導(dǎo)致AS斑塊的形成[12]，因于痰濁瘀血、痹阻脈絡(luò)、痰瘀搏結(jié)等病機變化而致AS[13-14]。因此，臨床上常綜合運用理氣祛痰、化濁逐瘀、清熱解毒、健脾益腎等方法進行施治[15]。消積丸由大黃、牽牛子、山楂、六神曲、麥芽、五靈脂、青皮、陳皮、三棱、莪術(shù)、香附11味中藥組成，具有消積活血、行氣導(dǎo)滯、化痰祛濕、疏肝健脾之功效，從中醫(yī)理論上可以治療脈積病證，然而其作用機制尚未完全明確。

圖9 消積丸對ApoE?∕?小鼠主動脈竇AS病變的影響(, n = 3)

圖10 消積丸對ApoE?∕?小鼠主動脈中TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白及CD36蛋白表達的影響(, n = 3)

本研究首先借助網(wǎng)絡(luò)藥理學從多靶點、多角度、多途徑揭示了消積丸治療AS的作用機制，探討了消積丸治療AS的潛在靶點和機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學在構(gòu)建“消積丸-靶點-AS”交互網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，分析消積丸通過復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)對AS的干預(yù)和影響，使用可視化大規(guī)模數(shù)據(jù)直觀清晰地觀察網(wǎng)絡(luò)各個節(jié)點之間的交互，為消積丸治療AS的靶點及機制研究提供新平臺。網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果顯示，共篩選出消積丸136個活性成分及277個作用靶點，4481個AS疾病相關(guān)靶點，消積丸和AS的共同靶點有205個，核心靶點主要包括TNF、IL-6、NF-κB、IL-1β等，這些靶點均與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果表明，消積丸治療AS主要涉及的生物過程為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和一氧化氮生物合成等，主要作用途徑包括癌癥通路、乙肝通路、TNF信號通路等。結(jié)合富集分析，在TNF信號通路中進一步篩選得到炎癥信號通路——TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路。網(wǎng)絡(luò)藥理學研究表明，消積丸可能通過調(diào)節(jié)TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路，改善炎癥反應(yīng)，緩解AS，為后續(xù)實驗研究提供了參考和方向。

1992年，?∕?小鼠成為用于AS領(lǐng)域的首個轉(zhuǎn)基因動物模型。Plump等[16]首次利用胚胎干細胞同源重組和基因敲除技術(shù)培育出?∕?小鼠，發(fā)現(xiàn)該小鼠易誘導(dǎo)形成AS，具有典型的AS病理形態(tài)特征，且斑塊形成的繼發(fā)病變與AS患者非常相似。?∕?小鼠已成為目前研究AS應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)基因小鼠[17]。Rosenfeld等[18]研究發(fā)現(xiàn)，?∕?小鼠動脈內(nèi)膜中的斑塊隨著時間推移而不斷發(fā)展變化，年齡越大的小鼠主動脈內(nèi)越易觀察到AS病變，表現(xiàn)出典型的纖維斑塊。Knouf等[19]發(fā)現(xiàn)，?∕?小鼠本身無法完全攝取肝臟中的TG，導(dǎo)致體循環(huán)中TG大量滯留，脂質(zhì)代謝失常，形成了高脂血癥和AS，并且發(fā)現(xiàn)其斑塊受損部位和斑塊的病變進程均與人類的AS極其相似。Nakashima等[20]將?∕?小鼠進行分組，分別給予西方膳食和普通飼料進行喂養(yǎng)，并對不同飲食下小鼠的AS病變進行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)小鼠的AS病變主要發(fā)生在主動脈及其分支、肺動脈、頭臂動脈以及頸動脈，普通飲食的小鼠8～10周開始出現(xiàn)泡沫細胞，15周時大量平滑肌細胞遷移，20周后纖維帽、細胞外基質(zhì)和平滑肌細胞大量聚集形成明顯可見的纖維斑塊；而給予西方膳食喂養(yǎng)會加速這一過程并形成膽固醇結(jié)晶、壞死和鈣化等更進一步的AS病變。?∕?小鼠模型具有體型小、實驗操作簡便易行、實驗周期較短、繁殖速度快、成本低廉等優(yōu)點，其在正常飲食下也可能發(fā)生AS病變，并且其病變過程和表現(xiàn)與人類的AS病變十分相似。如果給予?∕?小鼠高脂高膽固醇飼料進行喂養(yǎng)，則其形成AS的可能性會顯著增加，疾病的進程也會顯著加快[21]。因此，本研究采用雄性?∕?小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)12周的方式建立AS動物模型。

AS的發(fā)生發(fā)展與脂質(zhì)代謝異常和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[11]。大量研究表明，AS的發(fā)病率隨著血清中LDL-C水平的增加而升高，隨著HDL-C水平的減少而下降[22]。高脂血癥是AS的危險因素，血清中TG水平過高易導(dǎo)致AS的發(fā)生和發(fā)展[23]。因此，調(diào)節(jié)脂質(zhì)分布對于減緩AS進展非常重要。此外，各種炎癥因子對AS的發(fā)生發(fā)展也具有不同程度的作用[24-25]。TNF-α是一種廣泛分布于內(nèi)皮細胞表面的重要炎癥介質(zhì)，是AS的炎性標志物之一，代表AS炎癥活躍程度[24]。IL-6作為強效促炎性細胞因子，可以誘導(dǎo)如IL-1β和TNF-α等炎癥因子的表達，增強炎癥反應(yīng)[26]。IL-1β是一種重要炎性標志物，可以誘導(dǎo)其下游如IL-6等炎癥因子大量產(chǎn)生，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)[27]。本研究結(jié)果顯示，消積丸能夠降低?∕?小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。ox-LDL作為心腦血管疾病生物標志物，通過促進炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)膜脂質(zhì)沉積從而影響AS的發(fā)生發(fā)展[28]。CD36與ox-LDL結(jié)合，參與AS的不同病理過程，具有強烈的致AS作用[29]。高脂飲食的?∕?小鼠是研究AS發(fā)病機制的理想動物模型[30]。在本研究中，與正常飲食的小鼠相比，高脂飲食12周的?∕?小鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、ox-LDL、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著升高；主動脈竇HE、Masson和油紅O染色結(jié)果顯示動脈內(nèi)膜粥樣斑塊形成，脂質(zhì)和膠原蛋白明顯沉積。提示本研究中的AS小鼠模型構(gòu)建成功，脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)可能是?∕?小鼠形成AS病變的重要途徑。阿托伐他汀是一種強效的降膽固醇藥物，具有抑制炎癥細胞和炎癥介質(zhì)釋放、抑制血栓形成、保持斑塊穩(wěn)定等作用，因此在動物實驗中選用阿托伐他汀作為陽性對照藥物[31]。結(jié)果表明，與模型組相比，消積丸和阿托伐他汀均能夠降低小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TG、TC、LDL-C、ox-LDL水平，升高HDL-C水平，降低主動脈中CD36蛋白表達水平，表明消積丸和阿托伐他汀可以調(diào)節(jié)血脂水平，緩解炎癥反應(yīng)，其中高劑量的消積丸的療效與阿托伐他汀接近，且優(yōu)于低劑量的消積丸。此外，消積丸和阿托伐他汀治療組小鼠主動脈竇AS斑塊均有不同程度減少，脂質(zhì)沉積和纖維化等情況均得到改善。提示消積丸能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減輕炎癥反應(yīng)，減緩AS進展，且呈劑量相關(guān)性。

TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號通路，影響AS的發(fā)生與發(fā)展[30]。TNF-α可以與細胞膜表面的TNF受體相關(guān)因子結(jié)合，介導(dǎo)IKKβ/NF-κB信號通路等多種下游信號通路傳導(dǎo)，從而促進炎癥反應(yīng)和AS進程。抑制TNF-α的表達可能會抑制AS晚期病變的形成[31]。NF-κB作為炎癥反應(yīng)中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，通過激活磷酸化κB抑制因子（inhibitor κB，IκB）的p65/p50二聚體，遷移到細胞核中發(fā)揮活性，介導(dǎo)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)AS發(fā)病或加重病情[31]。IKKβ是一種常見的轉(zhuǎn)錄因子，通過磷酸化激活后發(fā)揮其效應(yīng)，對NF-κB的活化起著關(guān)鍵作用[32]。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果篩選出TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路進行體內(nèi)實驗研究，結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠主動脈中TNF-α蛋白表達以及IKKβ和NF-κB p65磷酸化水平均顯著升高，表明TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路的激活與AS密切相關(guān)，與文獻報道一致[30]，提示TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路在AS的整個疾病過程中發(fā)揮重要作用。與模型組相比，消積丸組和阿托伐他汀組小鼠主動脈中TNF-α蛋白表達以及IKKβ和NF-κB p65磷酸化水平均顯著降低，其中高劑量消積丸的下調(diào)作用與阿托伐他汀接近，較低劑量消積丸作用更加明顯。提示消積丸治療AS的作用可能是通過下調(diào)TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法預(yù)測了消積丸治療AS的潛在靶點和作用機制，并進一步通過動物實驗進行驗證。結(jié)果表明，消積丸能夠通過下調(diào)TNF-α/IKKβ/NF-κB信號通路，發(fā)揮減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等作用從而治療AS。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Xiaoji Pills in treatment of atherosclerosis in?∕?mice based on TNF-α/IKKβ/NF-κB signaling pathway

TU Wan-qing, LIANG Qiu-er, XIE Peng-cheng, XIE Ting, Lam Lai Kwan, CHEN Li-guo

School of Traditional Chinese Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, China

To explore the mechanism of Xiaoji Pills (消積丸, XJP) in the treatment of atherosclerosis (AS) by combining network pharmacology and animal experiments.Through network pharmacology, active ingredient-target network construction, protein-protein interaction (PPI) network analysis, gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were performed. Fifty male?∕?mice were randomly divided into control group, model group, atorvastatin (1.3 mg/kg) group and XJP low-, high-dose (8.125, 32.500 g/kg) groups, model group and each administration group were fed with high-fat diet, and after 4 weeks of corresponding drug intervention, lipid levels in serum were analyzed by automatic biochemical analyzer; ELISA method was used to detect the levels of interleukin-1β (IL-1β), IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) in serum. Hematoxylin-eosin (HE), Masson and oil red O staining were used to observe the pathological changes of aortic tissues. Western blotting method was used to detect the expressions of TNF-α/inhibitor κB kinase β (IKKβ)/nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway related proteins and CD36 protein in aortic tissue.A total of 136 active ingredients and 277 targets of XJP, 4481 disease-related targets of AS, and 205 common targets of XJP and AS were screened out, core targets mainly involving TNF, IL-6, NF-κB and IL-1β. GO function and KEGG pathway enrichment analysis showed that the treatment of AS by XJP mainly involved inflammatory reaction, nitric oxide biosynthesis and other processes, regulating cancer pathway, hepatitis B pathway and TNF signaling pathway. TNF-α/IKKβ/NF-κB signaling pathway was further screened in TNF signaling pathway. The results of animal experiments showed that compared with control group, levels of triglyceride (TG), total cholesterol (TC), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), IL-1β, IL-6, TNF-α, ox-LDL in serum of mice in model group were significantly increased (< 0.01), TNF-α protein expression, IKKβ and NF-κB p65 phosphorylation levels in aorta were significantly increased (< 0.01), intima of aortic sinus was not smooth with a large number of collagen fibers and lipid deposition (< 0.01), and obvious AS plaques were formed. Compared with model group, levels of TC, TG, LDL-C, TNF-α, IL-6 and ox-LDL in serum of mice in XJP groups were significantly decreased (< 0.05, 0.01). TNF-α, CD36 protein expressions and IKKβ, NF-κB p65 phosphorylation levels in aorta were significantly decreased (< 0.05, 0.01); aortic sinus AS plaques were decreased, collagen protein and lipid deposition were improved (< 0.05, 0.01).XJP can treat AS by downregulating related proteins expression in TNF-α/IKKβ/NF-κB signaling pathway, reducing inflammation and regulating lipid metabolism.

Xiaoji Pills; network pharmacology; atherosclerosis; tumor necrosis factor-α/inhibitor κB kinase β/nuclear factor-κB signaling pathway; inflammation; lipid metabolism;emodin; chrysophanol; ursolic acid

R285.5

A

0253 - 2670(2022)16 - 5074 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.017

2022-04-15

國家自然科學基金資助項目（81673848）

涂宛晴（1995—），女，碩士研究生，主要從事動脈粥樣硬化相關(guān)研究。E-mail: tuwanqing@126.com

陳利國（1960—），男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事老年病心腦血管疾病相關(guān)研究。E-mail: tchenly@jnu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]