劉 瑩，賈 蘭，張曉喻，胡慧玲，郭欣悅，王戰(zhàn)國, , 5*

腸道菌群紊亂對瀉心湯藥效成分大黃素藥動學(xué)的影響

劉 瑩1，賈 蘭2，張曉喻2，胡慧玲3，郭欣悅4，王戰(zhàn)國1, 4, 5*

1. 成都大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610106 2. 四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610730 4. 成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106 5. 成都大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院整合醫(yī)藥學(xué)產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新研究中心，羌醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)研究推廣基地既協(xié)同創(chuàng)新研究中心，四川 成都610106

通過比較大黃素以及配伍瀉心湯藥效成分（鹽酸小檗堿、黃芩苷）前后在正常和抗生素致菌群紊亂大鼠中的藥動學(xué)差異，揭示腸道菌群對瀉心湯藥效成分大黃素藥動學(xué)的影響。通過ig混合抗生素建立菌群紊亂大鼠模型，經(jīng)高通量16S rDNA測序技術(shù)進(jìn)行模型評價。采用β-葡萄糖醛酸酶水解法處理血液樣品，通過血液中總大黃素質(zhì)量濃度表征大黃素的體內(nèi)藥動學(xué)特征。通過比較正常和抗生素致菌群紊亂大鼠中大黃素及其配伍鹽酸小檗堿和黃芩苷前后的藥動學(xué)差異特征評價腸道菌群對瀉心湯藥效成分大黃素藥動學(xué)的影響。與正常大鼠相比，單獨(dú)ig大黃素，菌群紊亂大鼠中大黃素在0～12 h內(nèi)基本無吸收，即在0～12 h內(nèi)生物利用度極顯著降低；大黃素配伍鹽酸小檗堿和黃芩苷后，菌群紊亂大鼠中大黃素在0～12 h內(nèi)生物利用度仍然顯著降低。與單獨(dú)ig大黃素相比，大黃素配伍鹽酸小檗堿和黃芩苷后，菌群紊亂大鼠模型中大黃素在0～12 h內(nèi)的體內(nèi)生物利用度顯著升高；然而，正常大鼠中大黃素在0～12 h內(nèi)的體內(nèi)生物利用度顯著降低。大黃素單獨(dú)給藥或配伍瀉心湯藥效成分后在菌群紊亂大鼠模型中藥動學(xué)均顯著改變，表明腸道菌群能夠顯著影響瀉心湯藥效成分大黃素的藥動學(xué)特征。

瀉心湯；大黃素；鹽酸小檗堿；黃芩苷；抗生素；腸道菌群；藥動學(xué)

人體攜帶著大量的微生物，其中很大一部分位于胃腸道中[1]。胃腸道約有100萬億個微生物，其中專性厭氧菌占99.9%，是腸道優(yōu)勢菌群[2]。腸道微生物主要分為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和梭桿菌門（Fusobacteria）6大門，其中厚壁菌門和擬桿菌門為主要優(yōu)勢菌群[3]。抗生素過度使用會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)并發(fā)生代謝異常[4]，中藥或中藥配伍常與抗生素聯(lián)合用藥[5-6]，而抗生素的濫用是否會對中藥及復(fù)方配伍后體內(nèi)藥動學(xué)產(chǎn)生影響是值得研究的問題。

瀉心湯是具有代表性的清熱解毒的中藥方劑，具有抗炎、廣譜抗菌、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用[7]。瀉心湯由大黃、黃芩和黃連組成，《中國藥典》2020年版中三黃片由瀉心湯衍生而來，其組方如下：大黃以大黃藥材（300 g）代表，黃連以鹽酸小檗堿（5 g）代表，黃芩以富含黃芩苷（黃芩苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于85%）的黃芩浸膏（21 g）代表。依據(jù)瀉心湯衍生的三黃片中總蒽醌類、生物堿類（鹽酸小檗堿）、黃酮類（黃芩浸膏）含量關(guān)系，結(jié)合總大黃素在大黃中的含量，選擇代表性的藥效成分大黃素、鹽酸小檗堿和黃芩苷（比例約為1∶3∶9）開展初步研究。研究者已從成分、藥效學(xué)、藥動學(xué)等方面對瀉心湯配伍合理性進(jìn)行了研究[8-9]。中藥在口服后同時作用于機(jī)體與腸道菌群，二者不可避免地存在相互作用[10]，本課題組前期研究表明瀉心湯藥效成分在正常大鼠中存在顯著的藥動學(xué)相互作用[11-13]；另一方面，菌群失調(diào)或紊亂狀態(tài)下，瀉心湯藥效成分及配伍前后體內(nèi)藥動學(xué)特征是值得研究的命題。本研究從瀉心湯組方出發(fā)，擬通過比較大黃素以及配伍瀉心湯藥效成分前后在正常和抗生素致菌群紊亂大鼠中的藥動學(xué)差異，揭示腸道菌群對瀉心湯藥效成分大黃素藥動學(xué)的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠24只，6周齡，體質(zhì)量（150±10）g，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證編號SCXK（川）2015-030。動物于室溫（25±2）℃、濕度（60±5）%的環(huán)境下飼養(yǎng)，12 h明暗交替，自由進(jìn)食飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號20180412）。

1.2 藥品與試劑

大黃素（批號2017060202）、黃芩苷（批號2017041202）、鹽酸小檗堿（批號2017052302）原料藥購自長沙中仁生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%）；對照品大黃素（批號17110704）、1,8-二羥基蒽醌（批號17101504）購自成都曼斯特生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于99.9%；β-葡萄糖醛酸酶（批號P1541397）、硫酸新霉素（批號2017071501）、桿菌肽（批號2017090301）、納他霉素（批號2017082301）購自成都化夏化學(xué)試劑有限公司；超純水由優(yōu)普超純水機(jī)制備；肝素鈉（批號2016041801）購自成都孟德爾科技有限公司；甲酸（批號2017102601）、甲醇（批號2017082301）均為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

2695型高效液相儀（美國Waters公司）；Applied Biosystems GeneAmp 9700型系列PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；TGL-16C型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；PHS-2F型PH測定儀（上海雷磁儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；JN300-1型氮吹儀（蘇州吉米諾儀器有限公司）；BP211D型電子天平（北京塞多利斯儀器有限公司）。

2 方法

2.1 腸道菌群紊亂大鼠模型的建立

精密稱取硫酸新霉素5.0 g，桿菌肽5.0 g，納他霉素1.25 mg，于100 mL量瓶中，加入生理鹽水溶解，定容，得抗生素混合溶液。SD大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組，每組12只。模型組大鼠ig抗生素混合溶液，1次/d，連續(xù)7 d。

2.2 腸道菌群紊亂大鼠模型的驗(yàn)證

2.2.1 糞便收集 造模第7天，在ig抗生素混合溶液2 h后，采集各組大鼠的新鮮糞便樣品，每只大鼠取樣3份，糞便放入滅菌后的冷凍管中并保存于?80 ℃冰箱中，用于16S rDNA測序。

2.2.2 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物純化 PCR擴(kuò)增引物序列：515F（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。樣品設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)并將PCR（PCR采用KOD-401B:TOYOBOKOD-Plus-NeoDNAPolymerase）反應(yīng)終止于線性擴(kuò)增期，PCR結(jié)束后將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測條件5 V/cm、20 min，使用OMEGA膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。參照電泳初步檢測結(jié)果，PCR回收產(chǎn)物用Qubit 2.0（美國Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

2.2.3 16S rDNA基因測序 將擴(kuò)增后的各組糞樣DNA產(chǎn)物送至上海維基生物科技有限公司，進(jìn)行16S rDNA基因V3～4區(qū)通量測序。

2.3 藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 正常組分為2組，每組6只，分別ig大黃素（C1組）、大黃素＋鹽酸小檗堿＋黃芩苷（C2組）；模型組分為2組，每組6只，分別ig大黃素（T1組）、大黃素＋鹽酸小檗堿＋黃芩苷（T2組）。

2.3.2 給藥劑量 為考察腸道菌群對瀉心湯藥效成分大黃素藥動學(xué)的影響，依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合瀉心湯所制備的三黃片（《中國藥典》2020年版）中大黃素、鹽酸小檗堿、黃芩苷含量約為1∶3∶9的比例關(guān)系，確定大黃素、鹽酸小檗堿和黃芩苷的大鼠ig給藥劑量分別為33.40、100.20、300.60 mg/kg。

2.3.3 取血時間 正常組和模型組大鼠ig受試藥物前后于0、0.16、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、16、24 h斷尾取血0.3 mL，置于肝素化離心管中，12 000 r/min離心5 min，取上清100 μL，待測。

2.4 血漿樣品的處理

本研究擬重點(diǎn)考察腸道菌群對瀉心湯中大黃素藥動學(xué)的影響，鑒于大黃素為多酚羥基化合物，體內(nèi)經(jīng)歷廣泛的II相代謝過程[14-17]，其中尤以腸道和肝臟中的尿苷二磷酸葡糖苷酸轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphate glucuronide transferase，UGT）介導(dǎo)發(fā)生的葡萄糖醛酸結(jié)合為主，故擬采用β-葡萄糖醛酸苷酶處理血漿樣品以表征其體內(nèi)總大黃素的暴露程度。采用液液萃取法對樣品進(jìn)行前處理，取待測血漿樣品100 μL，加入20 μL 0.5 mol/L的醋酸溶液（含2 mg/mL維生素C）調(diào)節(jié)pH值至5.0，加入β-葡萄糖醛酸苷酶（1000 U/mL）100 μL，渦旋1 min，在37 ℃水浴中孵化30 min，加入內(nèi)標(biāo)液1,8-二羥基蒽醌20 μL（20 μg/mL）混勻，加入1 mL醋酸乙酯，渦旋萃取5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清，37 ℃氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶，12 000 r/min離心5 min，取上清液待測。

2.5 血漿樣品測定方法學(xué)考察

2.5.1 色譜條件 C18色譜柱（250 mm×14.6 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.4%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～4 min，60% A；4～27 min，60%～80% A；27～30 min，80%～60% A。波長254 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.5.2 專屬性 取大鼠空白血漿、空白血漿加內(nèi)標(biāo)（1,8-二羥基蒽醌）、空白血漿加內(nèi)標(biāo)加大黃素對照品、大鼠ig大黃素2 h后的血漿樣品，按“2.4血漿樣品的處理”項(xiàng)下方法處理后，采用上述色譜條件進(jìn)樣分析。

2.5.3 大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 精密稱取大黃素和1,8-二羥基蒽醌對照品適量，以甲醇為溶劑分別配制成質(zhì)量濃度為300、200 μg/mL的儲備液，于4 ℃儲存。吸取適量的內(nèi)標(biāo)1,8-二羥基蒽醌儲備液，以甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為20 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。吸取大黃素儲備液，按倍數(shù)稀釋法用甲醇配制成系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液（標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測成分大黃素的質(zhì)量濃度為0.586、1.172、2.344、4.688、9.375、18.750、37.500、75.000、150.000 μg/mL）。取空白血漿樣品100 μL，加入20 μL不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，再加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液、100 μL水和20 μL醋酸溶液，渦旋混勻，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，采用上述建立的HPLC分析方法檢測。記錄峰面積，計(jì)算對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算線性范圍（大黃素血藥質(zhì)量濃度為0.117～30.000 μg/mL）。另取定量下限質(zhì)量濃度樣品，平行5份，分別計(jì)算質(zhì)量濃度，并得平行樣品質(zhì)量濃度之間RSD。

2.5.4 精密度和準(zhǔn)確度 取高、中、低3個質(zhì)量濃度（30.00、1.88、0.47 μg/mL）的質(zhì)控血漿（對照品與內(nèi)標(biāo)溶液加入到空白血漿），按“2.4”項(xiàng)下方法處理，各平行制備5份，代入線性方程，計(jì)算測定值，與加入量比較，并計(jì)算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度。不同質(zhì)量濃度的5份血漿樣品平行進(jìn)樣，連續(xù)測定3 d，每日繪制隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算實(shí)測質(zhì)量濃度，并計(jì)算日間精密度和準(zhǔn)確度。

2.5.5 穩(wěn)定性 按“2.4”項(xiàng)下方法制備高、中、低質(zhì)量濃度的3組血漿樣品，每組5個平行，考察室溫放置4 h穩(wěn)定性、24 h穩(wěn)定性、反復(fù)凍融3次樣品穩(wěn)定性（?4 ℃凍存、室溫解凍，反復(fù)3次）。

2.5.6 提取回收率 以高、中、低3個質(zhì)量濃度的血漿質(zhì)控樣品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理樣品，利用HPLC進(jìn)行分析檢測，記錄其峰面積，以血漿中測得大黃素的峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度對照品溶液中大黃素峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算出3個質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的回收率。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用DAS 2.0醫(yī)學(xué)藥動學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件和非房室模型計(jì)算得出藥動學(xué)參數(shù)。采用PASW statistics 18軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin Pro Protable軟件作圖。

3 結(jié)果

3.1 腸道菌群紊亂模型驗(yàn)證

3.1.1 大鼠腸道菌群組成差異性分析 與正常大鼠相比，在門水平上主要檢測到12種菌門的變化，腸道菌群紊亂大鼠腸道菌落的變形菌門的相對豐度得到顯著提高，而擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度顯著降低（圖1-A）；在科水平上也出現(xiàn)了2組差異較大的12種菌科，模型組的BacteroidaLes S24-7 group、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）和氨基酸球菌科（Acidaminococcaceae）的相對豐度顯著降低，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、理研菌科（Rikenellaceae）和腸球菌科（Enterococcaceae）相對豐度顯著增加，特別是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）菌群豐度增加最為顯著（圖1-B）；在屬水平上，模型組腸道中分支桿菌屬、志賀氏桿菌屬、、泛菌屬的相對豐度顯著增加，毛螺菌屬Lachnospiraceae NK4A136 group、普雷沃氏菌屬Prevotella 9、乳桿菌屬、桿菌屬coprostanoligenes group、普雷沃氏菌屬Prevotellaceae Ga6A1 group、瘤胃梭菌屬5、9的相對豐度顯著降低（圖1-C）。可見，模型組腸道菌群在門、科、屬水平上均出現(xiàn)一定程度的紊亂。

圖1 各組大鼠腸道菌群門 (A)、科 (B)和屬 (C)水平的相對豐度

3.1.2 大鼠腸道菌群多樣性分析 Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是用來代表微生物菌落多樣性的指數(shù)，其數(shù)值越大，說明微生物菌落的多樣性越高；Chao1指數(shù)常用來估計(jì)物種總數(shù)，其所呈現(xiàn)的值越大，代表該指定環(huán)境中群落的豐富程度越大；Faith’s PD指數(shù)是Alpha水平上最常用的系統(tǒng)發(fā)育多樣性度量方法。如圖2所示，正常組和模型組的腸道菌群多樣性存在顯著差異，4種Alpha多樣性評價指數(shù)均顯示正常組的值均高于模型組，即表明造?？山档湍c道菌群多樣性。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 專屬性 如圖3所示，空白血漿內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)對所要檢測的大黃素及內(nèi)標(biāo)1,8-二羥基蒽醌無干擾，同時無論是在血漿中加入大黃素、內(nèi)標(biāo)還是ig大黃素后血漿樣品中3者峰形皆良好，分離度大于1.5，符合生物樣品的測定要求。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 以大黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），大黃素與內(nèi)標(biāo)（1,8-二羥基蒽醌）峰面積比值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為＝0.141 3＋0.079 4（2＝0.999 1）。結(jié)果表明本方法在0.117～30.000 μg/mL呈良好的線性關(guān)系，大黃素的定量下限為0.117 μg/mL。

與正常組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

A-空白大鼠血漿 B-空白大鼠血漿＋內(nèi)標(biāo) C-空白大鼠血漿＋內(nèi)標(biāo)＋大黃素 D-正常組大鼠ig大黃素后2 h的血漿 IS-內(nèi)標(biāo)（1,8-二羥基蒽醌）

3.2.3 精密度和準(zhǔn)確度 如表1所示，血漿中大黃素的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度和精密度均小于15%，符合要求。

3.2.4 穩(wěn)定性 如表2所示，大黃素血漿樣品在高、中、低3個質(zhì)量濃度下，在不同儲藏條件（室溫下放置于4 h、24 h以及?4 ℃下反復(fù)凍融3次）處理下，RSD均低于20%，大黃素在樣品中的穩(wěn)定性良好，符合要求，見表2。

3.2.5 提取回收率 如表3所示，大黃素在高、中、低3個質(zhì)量濃度下的回收率均≥80%，表明本方法的提取回收率達(dá)到生物樣品測定要求。

3.3 藥動學(xué)

正常大鼠和抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂大鼠ig大黃素（33.4 mg/kg），將得到的血漿樣品不經(jīng)過β-葡萄糖醛酸酶處理，在“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，各個時間點(diǎn)所采集的血漿樣品中幾乎檢測不到大黃素原型的存在。將血漿樣品經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶處理后測定血漿樣品中總大黃素含量，各采樣時間點(diǎn)總大黃素的藥時曲線見圖4。

表1 大黃素血漿樣品中精密度和準(zhǔn)確度

Table 1 Precision and accuracy of emodin in plasma samples

質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度(n =5)日間精密度和準(zhǔn)確度(n =5) 實(shí)測值/(μg·mL?1)RSD/%RE/%實(shí)測值/(μg·mL?1)RSD/%RE/% 30.0030.08±0.405.400.2629.63±0.822.77?1.23 1.881.97±0.075.704.821.93±0.010.783.01 0.470.47±0.0612.76?1.040.49±0.013.853.67

表2 大黃素血漿樣品的穩(wěn)定性(n = 5)

Table 2 Stabilities of emodin in plasma samples (n = 5)

儲藏條件質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)實(shí)測值/(μg·mL?1)RE/%RSD/% 室溫放置4 h30.0031.27±1.584.225.05 1.881.98±0.245.5612.12 0.470.51±0.068.9811.76 室溫放置24 h30.0031.13±2.273.767.29 1.882.16±0.1814.968.33 0.470.54±0.0514.179.26 ?4 ℃反復(fù)凍融3次30.0029.30±1.48?2.325.05 1.881.79±0.13?4.767.26 0.470.39±0.06?12.6415.38

表3 大黃素血漿樣品的回收率(n = 5)

Table 3 Recovery of emodin in plasma samples (n = 5)

質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)實(shí)測值/(μg·mL?1)回收率/% 30.0024.16±0.5880.53±1.93 1.881.70±0.0290.54±1.16 0.473.31±0.1690.08±7.65

正常大鼠給予大黃素配伍鹽酸小檗堿和黃芩苷前后，體內(nèi)總大黃素的藥動學(xué)參數(shù)見表4，與單獨(dú)給予大黃素（C1組）相比，大黃素配伍鹽酸小檗堿和黃芩苷（C2組）總大黃素的AUC0～t減少了38.96%，而max減少了41.04%。菌群紊亂大鼠模型單獨(dú)ig大黃素（T1組）后，通過酶處理血漿樣品中總大黃素僅在16、24 h時檢測到，分別為0.412、3.010 μg/mL，在0～12 h內(nèi)未檢測到大黃素，與正常大鼠（C1組）相比，在0～12 h內(nèi)生物利用度顯著降低。菌群紊亂大鼠模型ig大黃素配伍鹽酸小檗堿和黃芩苷（T2組）后，在0～12 h內(nèi)體內(nèi)大黃素質(zhì)量濃度低于正常組（C2組），但在12 h后體內(nèi)大黃素含量有明顯升高的趨勢。

從圖4可以看出，大黃素?zé)o論是單獨(dú)給藥還是聯(lián)合給藥，在檢測的24 h內(nèi)，前12 h腸道菌群紊亂組均導(dǎo)致大黃素體內(nèi)吸收減弱，生物利用度降低，但在12 h后大黃素的吸收有逐步增強(qiáng)的趨勢，鑒于模型組均發(fā)現(xiàn)16、24 h高暴露量的大黃素，且菌群紊亂大鼠單獨(dú)ig大黃素（T1組）在16 h后仍處于增加趨勢，后期可考慮延長采血時間以得到其24 h后的藥動學(xué)參數(shù)。與單獨(dú)ig大黃素相比，大黃素配伍鹽酸小檗堿和黃芩苷后，菌群紊亂大鼠模型中大黃素在0～12 h內(nèi)的體內(nèi)生物利用度顯著升高；然而，正常大鼠模型中大黃素在0～12 h內(nèi)的體內(nèi)生物利用度顯著降低。

圖4 正常大鼠和腸道菌群紊亂大鼠ig大黃素及大黃素聯(lián)合鹽酸小檗堿和黃芩苷后血液中總大黃素的藥時曲線

表4 大黃素在C1組和C2組的藥動學(xué)參數(shù)(, n = 6)

Table 4 Pharmacokinetic parameters of emodin in C1 group and C2 group (, n = 6)

參數(shù)單位C1組C2組 AUC0～tmg?L?1?h61.875±14.64337.769±8.401* AUC0～∞mg?L?1?h69.314±16.02970.225±15.692 MRT0～th8.630±1.05110.419±1.589 VRT0～th32.886±4.97541.499±7.746 t1/2zh7.162±2.52213.221±8.866 Tmaxh3.167±0.7532.667±1.033 Cmaxmg?L?16.048±1.6163.566±0.877* CLzL?h?1?kg?10.505±0.1230.497±0.116 VzL?kg?15.137±1.8109.151±5.924

與C1組比較：P＜0.05

*< 0.05 vs C1 group

4 討論

4.1 腸道菌群紊亂影響大黃素的體內(nèi)藥動學(xué)

混合抗生素溶液給藥后，腸道菌群中有益菌減少，類似大腸桿菌的有害菌（致病菌）數(shù)量增加，造成腸道菌群紊亂，同時伴隨著腸道內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，腸道菌群失調(diào)患者的糞便pH值由正常糞便的5.0～6.5增至6.0～8.0[18]，而消化道中不同的pH環(huán)境可影響藥物的解離狀態(tài)，故消化道pH會對藥物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，從而影響對藥物的吸收。本研究結(jié)果顯示，抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂同樣導(dǎo)致大腸桿菌在內(nèi)的致病菌大量增加，引起消化道pH改變可能是大黃素在前12 h吸收差的原因之一。

腸道菌群紊亂會導(dǎo)致有益菌減少、致病菌大量增加，伴隨2種結(jié)果腸道中短鏈脂肪酸分泌量減少、內(nèi)毒素炎癥因子大量產(chǎn)生，短鏈脂肪酸尤其是丁酸的減少導(dǎo)致腸道屏障功能減弱，內(nèi)毒素炎癥因子入血會引起炎癥反應(yīng)，破壞腸道功能造成腸道損傷[19]。而大黃素的吸收主要發(fā)生在腸道中，那么腸道菌群紊亂造成的腸生理功能改變是影響大黃素吸收的另一個可能的因素。

4.2 聯(lián)合用藥影響大黃素在腸道菌群紊亂大鼠體內(nèi)藥動學(xué)

研究表明，大黃酸聯(lián)合用藥導(dǎo)致體內(nèi)生物利用度降低，這種聯(lián)合用藥所產(chǎn)生的變化可能是由于藥物相互作用所導(dǎo)致。由于腸道中與吸收相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體和外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，藥物相互競爭、抑制或誘導(dǎo)影響轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而影響藥物的吸收[6]。聯(lián)合用藥可能會影響藥物的體內(nèi)吸收，不過在菌群的介導(dǎo)作用下這種影響會相對減弱。

大黃素屬于酚酸類物質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)歷廣泛的II相代謝，尤其是葡糖糖醛酸代謝，以形成葡糖糖醛酸結(jié)合物等，而在腸道中這些結(jié)合物又會被腸道菌群所產(chǎn)生的葡萄糖醛酸苷酶等水解酶水解，釋放出原型藥物，進(jìn)而被小腸重新吸收入體循環(huán)。由于抗生素的干擾，導(dǎo)致腸道菌群的種類和數(shù)量被抑制，進(jìn)一步抑制了菌群活性，抑制水解酶活性[20]，導(dǎo)致藥物的重吸收相對減弱，結(jié)果提示在使用抗生素的情況下，若同時服用酚酸類藥物，往往需要考慮菌群介導(dǎo)的單獨(dú)用藥或聯(lián)合用藥產(chǎn)生藥物相互作用對藥物在體內(nèi)吸收的影響。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of intestinal flora disorder on pharmacokinetics of emodin in Xiexin Decoction

LIU Ying1, JIA Lan2, ZHANG Xiao-yu2, HU Hui-ling3, GUO Xin-yue4, WANG Zhan-guo1, 4, 5

1. School of Pharmacy, Chengdu University, Chengdu 610106, China 2. College of Life Sciences, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, China 3. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610730, China 4. School of Food and Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China 5. Holistic Integrative Medicine Industry Collaborative Innovation Research Center, Qiang Medicine Standard Research Promotion Base and Collaborative Innovation Research Center, School of Preclinical Medicine, Chengdu University, Chengdu 610106, China

To reveal the effect of intestinal flora on pharmacokinetics of emodin, active ingredient (berberine hydrochloride, baicalin) in Xiexin Decoction (瀉心湯) by comparing the pharmacokinetic differences between emodin and active ingredients of Xiexin Decoction in normal and antibiotic-induced flora disorder rats.Rats model of bacterial flora disorder was established by ig mixed antibiotic, and model was evaluated by high-throughput 16S rDNA sequencing technology. Blood samples were treated by β-glucuronidase hydrolysis method, andpharmacokinetic characteristics of emodin were characterized by concentration of total emodin in blood. Effect of intestinal flora on pharmacokinetics of emodin of Xiexin Decoction was evaluated through comparing the pharmacokinetic characteristics of emodin and its compatibility with berberine hydrochloride and baicalin in normal rats and flora disorder rats that modeled by antibiotics.Compared with normal rats, rats with disordered flora basically which ig emodin alone had no absorb emodin within 0—12 h, that was the bioavailability decreased significantly within 0—12 h; After berberine and baicalin were added, bioavailability of emodin was still significantly reduced in 0—12 h in rats with dysbacteriosis. Compared with ig emodin alone, emodin combined with berberine hydrochloride and baicalin significantly increasedbioavailability of emodin within 0—12 h in rats model of dysbiosis; However, bioavailability of emodinin normal rats was significantly decreased within 0—12 h.Pharmacokinetics of emodin in rats model of dysbacteriosis are significantly changed after administration of emodin alone or in combination with active ingredients of Xiexin Decoction, indicating that intestinal flora significantly affects the pharmacokinetic characteristics of emodin, active ingredient in Xiexin Decoction.

Xiexin Decoction; emodin; berberine hydrochloride; baicalin; antibiotic; intestinal flora; pharmacokinetics

R285.61

A

0253 - 2670(2022)16 - 5066 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.016

2022-04-28

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81403178）；四川省科技廳項(xiàng)目（2019ZYD052）；阿壩州科技局項(xiàng)目（R22YYJSYJ0022）

劉 瑩（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镄轮苿┘捌渖锼巹W(xué)基礎(chǔ)研究。E-mail: 1963095440@qq.com

王戰(zhàn)國（1981—），男，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事酚酸類中藥生物藥劑學(xué)基礎(chǔ)及藥動學(xué)研究、重大慢性疾病診斷及藥物篩選研究以及中、羌醫(yī)脾胃病藥物開發(fā)及質(zhì)量研究。E-mail: wangzhanguo@cdu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]