石 婭，劉 文, 3*，劉興德，宋信莉，李 鑫，舒萬芬，張甘純，秦 琴，王洪鑫

基于PI3K/Akt信號通路探究當歸補血湯干預大鼠實驗性腦缺血再灌注損傷的作用機制

石 婭1, 2，劉 文1, 2, 3*，劉興德1，宋信莉1, 2，李 鑫1, 2，舒萬芬1, 2，張甘純1, 2，秦 琴1, 2，王洪鑫1, 2

1. 貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025 2. 貴州中醫(yī)藥大學藥學院，國家苗藥工程技術研究中心，貴州中藥炮制與制劑工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025 3. 貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550025

基于網(wǎng)絡藥理學結合體內實驗探討當歸補血湯對腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）大鼠的干預作用及相關作用機制。通過數(shù)據(jù)庫收集當歸補血湯中的活性成分及其治療CIRI的靶點，構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡，并進行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；通過Auto Dock軟件對關鍵作用靶點與主要活性成分進行分子對接驗證。SD大鼠給予尼莫地平或當歸補血湯2周后，采用改良Longa線栓法復制大腦中動脈栓塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型，對神經(jīng)行為學進行評分，并測定腦組織梗死面積；采用TUNEL染色法測定腦組織細胞凋亡情況；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法考察腦組織病理變化；采用ELISA測定血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β水平；采用qRT-PCR檢測腦組織、和mRNA表達；采用Western blotting檢測腦組織蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）蛋白表達。篩選出當歸補血湯30種活性成分，得到當歸補血湯治療CIRI的靶點467個，核心靶點55個。KEGG通路富集分析表明磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt信號通路是當歸補血湯抗CIRI的關鍵機制之一。分子對接顯示，當歸補血湯中主要活性成分與核心作用靶點中的Akt1、信號傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、轉錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、細胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、TNF和IL-6等具有較為穩(wěn)定的結合活性。動物實驗結果表明，當歸補血湯能夠改善CIRI大鼠神經(jīng)功能損傷（＜0.05）；減少腦組織梗死面積（＜0.05、0.01）；減輕腦組織病理損傷；降低腦組織細胞凋亡指數(shù)（＜0.05、0.01、0.001）；降低血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平（＜0.05、0.01）；降低腦組織中、和mRNA表達（＜0.01、0.001）；增加腦組織中Akt的磷酸化水平（＜0.01、0.001）而激活PI3K/Akt信號通路，進一步上調Bcl-2蛋白表達（＜0.05、0.01、0.001），下調Bax蛋白表達（＜0.05、0.001）。當歸補血湯可能通過作用多靶點及多通路治療CIRI，其機制與影響Akt1、TNF、IL-6、IL-1β等蛋白的表達進而調控PI3K/Akt信號通路抑制炎癥和細胞凋亡有關。

當歸補血湯；腦缺血再灌注損傷；網(wǎng)絡藥理學；磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路；炎癥；細胞凋亡；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；毛蕊異黃酮；阿魏酸；芒柄花素；藁本內酯；黃芪甲苷

缺血性腦卒中是常見的中風類型，臨床治療常以藥物介導的靜脈溶栓和動脈內血栓切除術為主[1-2]，旨在通過再灌注恢復缺血腦組織的血液供應。然而，在腦缺血再灌注后，雖可以減少缺血引起的腦梗死面積和組織功能障礙，但快速的再灌注會對功能恢復造成更嚴重的影響，加重組織損傷[3]，稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI），是導致患者嚴重殘疾和死亡的首要因素之一[4]。此外，CIRI的病理機制復雜，包括炎癥反應、氧化應激、凋亡、血腦屏障功能障礙、白細胞浸潤等[5-10]，致使目前的治療策略難以達到預期效果。

在中醫(yī)藥理論指導下，傳統(tǒng)中醫(yī)藥尤其是復方中藥制劑在臨床上治療腦卒中及其并發(fā)癥已有數(shù)千年的歷史[11-13]。中醫(yī)認為“氣虛血瘀”是缺血性腦卒中和CIRI的主要病機特點之一，而“益氣活血”是治療關鍵環(huán)節(jié)之一[14-15]。現(xiàn)代藥理學研究顯示，益氣活血類中藥及中藥復方具有抗炎、清除氧自由基、保護血腦屏障（blood brain barrier，BBB）完整性、抑制細胞凋亡等作用，在防治缺血性腦卒中及CIRI方面具有良好的優(yōu)勢與前景[16-17]。當歸補血湯出自《內外傷辨惑論》，是益氣補血的代表方劑，由黃芪和當歸（5∶1）組成，具有明顯的益氣營血、扶正固本的功效[18]?，F(xiàn)有研究表明，當歸補血湯可通過改善BBB通透性，影響海馬區(qū)一氧化氮合酶和腦源性促紅細胞生成素的表達等保護CIRI的神經(jīng)組織[19-21]。但目前對于其抗CIRI的主要生物活性成分和分子機制尚未被全面闡明，既不能充分認識其在臨床療效的科學內涵，亦不能對中醫(yī)的傳統(tǒng)理論做出科學的詮釋，從而制約了其在醫(yī)學上的運用和藥物的進一步研制。

網(wǎng)絡藥理學結合系統(tǒng)生物學和交叉藥理學的概念，從多維角度探討中醫(yī)藥與疾病的關系，強調整體性和系統(tǒng)性，從而闡釋藥物、靶點與疾病間的多重相互作用，符合中醫(yī)學從整體觀念和辨證論治的角度診治疾病的原則[22-24]。因此，本研究擬采用網(wǎng)絡藥理研究，分析當歸補血湯的有效成分，篩選當歸補血湯抗CIRI的作用靶點并挖掘其潛在通路，并進一步通過體內實驗驗證預測的主要通路，為藥物研發(fā)提供新思路。

1 材料

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp. php）、SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www. swisstargetprediction.ch/）、TCMID數(shù)據(jù)庫（http:// www.megabionet.org/tcmid/）、UniProt數(shù)據(jù)庫（https:// www.uniprot.org/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（http://www. genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www. omim.org/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http://disgenet.org/）、Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ index.html）、String Version 11.0數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）、Cytoscape 3.6.0軟件、DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）、KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫（http:// kobas.cbi.pku.edu.cn/ kobas3/genelist/）、ZINC數(shù)據(jù)庫（https://zinc.docking. org/substances/home/）、PubChem數(shù)據(jù)庫（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、PDB數(shù)據(jù)庫（http:// www.rcsb.org/）、PyMOL軟件、Openbabel軟件、GraphPad Prism 9軟件。

1.2 藥材

黃芪（批號200801，產地甘肅）、當歸（批號200721，產地甘肅）購自北京同仁堂貴陽藥店，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學孫慶文教授鑒定分別為豆科黃芪屬植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao干燥根、傘形科植物當歸(Oliv.) Diels的干燥根。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，6～7周齡，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物質量合格證編號SCXK（遼）2020-0001。飼養(yǎng)于通風良好，室溫18～25 ℃，相對濕度50%～70%的動物房，確保動物自由進食與飲水。動物實驗經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準（倫理批準號20210052）。

1.4 藥品與試劑

尼莫地平片（批號20200709，國藥準字H20003010）購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC，批號0719A21）購自北京雷根生物技術有限公司；大鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒、大鼠IL-1β ELISA試劑盒（批號分別為E-EL-R0015c、E-EL-R2856c、E-EL-R0012c）購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號AB-P-R 001）購自杭州賢至生物有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0010）購自上海碧云天生物技術有限公司；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）多克隆兔抗（批號AF0016）購自Affinity公司；B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）兔抗（批號A19693）購自Abclonal公司；Akt兔抗（批號60203-2-Ig、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）兔抗（批號50599-2-Ig）購自武漢三鷹生物技術有限公司；HRP標記的山羊抗兔二抗（批號BA1054）購自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol（批號15596-026）購自Ambion公司；HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、SYBR Green Master Mix（批號分別為R233-01、Q111-02）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒（批號E-CK-A322）購自Elabscience公司。

1.5 儀器

FlexStation 3型多功能酶標儀（德國Molecular Devices公司）；H1650R型冷凍高速離心機（湖南湘儀離心機有限公司）；ICV-450型電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本ASONE公司）；Pannoramic 250型數(shù)字切片掃描儀（匈牙利3DHIESTECH公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）；QuantStudio 6型實時熒光定量PCR儀、Multiskan MK3型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡藥理學

2.1.1 當歸補血湯活性成分與靶點預測 以“黃芪”“當歸”或其拉丁文為關鍵詞，在TCMSP數(shù)據(jù)庫、TCMID數(shù)據(jù)庫中進行檢索，收集篩選有效成分。此外，將《中國藥典》2020年版中2味中藥的質量控制成分以及中國知網(wǎng)（CNKI）中已有報道的生物活性物質納入分析。在TCMSP數(shù)據(jù)庫、TCMID數(shù)據(jù)庫、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中收集活性成分靶點，將3者整合，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白名進行標準化處理，去重。

2.1.2 潛在靶點預測 通過GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫收集與“cerebral ischemia-reperfusion injury”“cerebral thrombosis”“ischemic stroke”和“cerebral embolism”病名相關的靶點，整合去除重復靶點，篩選得到CIRI相關靶點。當歸補血湯活性成分靶點和CIRI靶點的韋恩圖通過Venny 2.1在線工具繪制，將交集靶點作為當歸補血湯治療CIRI的潛在靶點。

2.1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡（protein-protein interaction，PPI）的構建和分析通過String Version 11.0數(shù)據(jù)庫對潛在靶點進行PPI分析，限定Homo sapiens、minimum required interaction score≥0.9，并隱藏游離蛋白。將結果以“TSV”格式導入Cytoscape 3.6.0軟件中，拓撲分析由CytoNCA插件[25]完成，其中，介數(shù)中心線（betweenness centrality，BC）、緊密中心（closeness centrality，CC）和度值均是評價網(wǎng)絡中節(jié)點貢獻程度的重要參數(shù)，其數(shù)值越高，該靶點對網(wǎng)絡參與度和貢獻率越大[26]。通過參數(shù)分析，探索當歸補血湯治療CIRI可能的相關核心作用靶點。

2.1.4 “活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的構建與分析 基于交集靶點，反向篩選得到對應活性成分，制作網(wǎng)絡關系表及屬性文件，依次導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建“活性成分-靶點-疾病”圖，通過Network Analyzer插件計算度值，分析篩選主要藥效成分。

2.1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 分別通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫、KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫進行GO功能和KEGG通路富集分析。下載分析結果，將其分別按值和“Count”（每條通路中含有的潛在基因靶點的數(shù)量）值的大小進行排序。

2.1.6 分子對接驗證 通過ZINC數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫下載成分結構的sdf格式文件，通過PyMOL將其轉換為pdb格式；從PDB數(shù)據(jù)庫篩選下載靶點蛋白結構。運用Auto Dock軟件對蛋白結構去水、加全氫、導出為pdbqt（設置為配體）；對小分子加全氫、設置為配體（自動分布電荷）、檢測扭轉鍵、選擇扭轉鍵、導出為pdbqt；設置對接Box、導出為gpf、運行Autogrid 4、設置對接參數(shù)及運算方法、導出為dpf、運行Autodock 4、查看結果；導出結果為pdbqt，運用Openbabel軟件將其轉換為pdb，后采用PyMOL進行可視化處理。

2.2 實驗驗證

2.2.1 當歸補血湯的制備 按處方比例黃芪-當歸（5∶1）準確稱取適量藥材，混勻，加8倍量純水浸泡30 min，煎煮提取2次，每次1 h，濾過，合并濾液，煎煮濃縮至適當濃度，備用。通過HPLC法對制備的濃縮液進行分析，通過直接與對照品的保留時間相比較，定性了毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、阿魏酸、芒柄花素、藁本內酯和黃芪甲苷6個成分，質量分數(shù)（以生藥計）分別為0.546、0.154、0.296、0.109、0.302、0.751 mg/g。

2.2.2 動物分組與給藥 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平（32.4 mg/kg，相當于臨床劑量的6倍）組和當歸補血湯低、中、高劑量（5.84、11.67、23.34 g/kg，分別相當于臨床劑量的3、6、12倍）組，每組18只，分別稱定質量、標記。各給藥組ig相應藥物（10 mL/kg），假手術組和模型組ig等體積生理鹽水，每隔24 h給藥1次，連續(xù)14 d。

2.2.3 造模與取材 給藥14 d后，采用改良的Longa線栓法[27-29]復制大鼠大腦中動脈栓塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型。缺血2 h后，小心勻速抽出線栓以恢復再灌注過程，涂抹適當?shù)夥M行消毒以防感染。假手術組除未插入線栓外，其他操作相同；再灌注22 h后，深度麻醉大鼠，從腹主動脈采集約5 mL血液，室溫放置1 h，3000 r/min離心15 min，吸取上清液，轉移至?80 ℃冰箱中保存，備用。采血后，迅速斷頭取腦，以冰的生理鹽水清洗，濾紙拭干，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，于?80 ℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 神經(jīng)行為學評分 再灌注22 h后，分別隨機挑選12只大鼠參照國際通用的Longa法[29]進行神經(jīng)行為學評分，選取評分≥1的大鼠進行后續(xù)實驗。

2.2.5 腦梗死面積測定 再灌注22 h后，剔除小腦與嗅球的腦組織放入?20 ℃預凍30 min后，進行冠狀切片，將腦切片用2% TTC避光染色15 min，正常部位為紅色，梗死區(qū)為白色時，切片置于4%多聚甲醛中，24 h后取出切片進行拍照記錄。將記錄的TTC染色圖像導入Image J圖像處理軟件，根據(jù)腦梗死嚴重程度自定義圈選梗死區(qū)域（白色）和全腦區(qū)域，通過“Analyze-Measure”模塊分別計算面積，并計算梗死率。

梗死率＝腦梗死總面積/腦切片總面積

2.2.6 病理形態(tài)學觀察 將固定的腦組織脫水并經(jīng)石蠟包埋及切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.7 細胞凋亡指數(shù)測定 取各組大鼠腦組織切片，按細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，于顯微鏡下觀察腦組織中的凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

細胞凋亡率＝凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)

2.2.8 大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的測定 按ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.2.9 qRT-PCR檢測大鼠腦組織中、和mRNA表達 取各組大鼠腦組織，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 (5’-3’)產物大小/bp GAPDHF: ACAGCAACAGGGTGGTGGAC253 R: TTTGAGGGTGCAGCGAACTT IL-6F: GTTGCCTTCTTGGGACTGATG102 R: TACTGGTCTGTTGTGGGTGGT TNF-αF: CCGATTTGCCATTTCATACCAG232 R: TCACAGAGCAATGACTCCAAAG IL-1βF: CCTGTGTGATGAAAGACGGC218 R: TATGTCCCGACCATTGCTGT

2.2.10 Western blotting測定腦組織中Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達 將低溫冷凍保存的各組大鼠腦組織剪碎，加入細胞裂解液提取總蛋白。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h后，分別加入兔抗Akt（1∶5000）、兔抗p-Akt（1∶1000）、兔抗Bax（1∶5000）、兔抗Bcl-2（1∶1000）和兔抗GAPDH（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育2 h。使用ECL工作液顯色曝光，掃描膠片，用Bandscan分析膠片灰度值（以GAPDH為內參蛋白）。

2.2.11 統(tǒng)計分析方法 數(shù)據(jù)使用軟件SPSS 26.0進行統(tǒng)計處理，用表示，采用單因素方差分析比較各組間差異的顯著性。采用Mann-Whitney檢驗，對神經(jīng)行為學評分進行非參數(shù)統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)作圖均由GraphPad Prism 9軟件生成。

3 結果

3.1 活性成分及潛在靶點的收集

TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到212個活性成分。通過口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18篩選，得到黃芪的20個活性成分，當歸的2個活性成分。查閱《中國藥典》2020年版和文獻，將部分成分納入后續(xù)研究，共計30個活性成分，見表2。通過各數(shù)據(jù)庫收集整理，得到695個活性成分靶點，5336個CIRI相關靶點。通過韋恩圖分析，得到467個藥物-疾病共同靶點作為當歸補血湯治療CIRI的潛在靶點。

3.2 PPI分析

為了獲得潛在靶點交互作用的信息，將467個潛在靶點PPI網(wǎng)絡的TSV文件導入Cytoscape 3.6.0進行分析，分析內容包括：（1）大于度值的2倍中位數(shù)；（2）同時大于CC、BC、度值的1倍。篩選得出靶點蛋白55個，即為當歸補血湯治療CIRI的關鍵靶點蛋白，見圖1。根據(jù)度值進行排序，將排名前20的靶點作為核心靶點，用于分子對接，見表3。提示這些靶點在PPI網(wǎng)絡中起著較為關鍵的作用，在治療CIRI中可能占據(jù)重要地位。

3.3 “活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡

“活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡見圖2。該網(wǎng)絡中共有497個節(jié)點，1926條邊，更加直觀地展示多成分、多靶點的相互關系。經(jīng)度值對當歸補血湯活性成分進行排序，排名前10的活性成分見表4，將其作為當歸補血湯治療CIRI的關鍵活性成分，用于分子對接。

3.4 GO功能富集分析

GO功能富集分析結果顯示，經(jīng)＜0.01篩選后，得到1087條GO結果，其中生物過程（biological process，BP）795條、分子功能（molecular function，MF）192條、細胞組成（cellular component，CC）100條，分別選取前10條進行可視化處理，見圖3。BP主要涉及G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、RNA聚合酶II啟動子轉錄的調控、凋亡過程的調控、細胞因子介導的信號通路、炎癥反應等；CC主要涉及質膜、細胞溶質、細胞質等；MF主要涉及蛋白質結合、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等。體現(xiàn)當歸補血湯對CIRI的治療是多重作用的結果。

表2 活性成分信息

Table 2 Information of active ingredients

編號分子編碼化合物OB/%DLPubChem CID DBT1MOL000211mairin55.380.7864971 DBT2MOL000239jaranol50.830.295318869 DBT3MOL000296常春藤皂苷元36.910.7573299 DBT4MOL000033(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R,5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol36.230.7815976101 DBT5MOL000354異鼠李素49.600.315281654 DBT6MOL0003713,9-di-O-methylnissolin53.740.4815689655 DBT7MOL0003745′-hydroxyiso-muronulatol-2′,5′-di-O-glucoside41.720.69/ DBT8MOL0003787-O-methylisomucronulatol74.690.3015689652 DBT9MOL0003799,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside36.740.9274977390 DBT10MOL000380(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol64.260.4214077830 DBT11MOL000387聯(lián)苯雙酯31.100.67108213 DBT12MOL000392芒柄花素69.670.215280378 DBT13MOL000398異黃烷酮109.990.30160767 DBT14MOL000401黃芪甲苷I46.790.1151346122 DBT15MOL000403黃芪甲苷II46.060.1313996693 DBT16MOL000405黃芪甲苷III31.830.10441905 DBT17MOL000407黃芪甲苷IV22.50 0.1513943297 DBT18MOL000414咖啡酸酯54.970.051549111 DBT19MOL000417毛蕊異黃酮47.750.245280448 DBT20MOL000422山柰酚41.880.245280863 DBT21MOL000433FA68.960.716037 DBT22MOL000438(3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol67.670.2610380176 DBT23MOL000439isomucronulatol-7,2′-di-O-glucosiole49.280.6215689653 DBT24MOL0004421,7-dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene39.050.485316760 DBT25MOL000098槲皮素46.430.285280343 DBT26MOL009290毛蕊異黃酮葡萄糖苷5.490.815318267 DBT27MOL000358β-谷甾醇36.910.75222284 DBT28MOL000449豆甾醇43.830.765280794 DBT29MOL000360阿魏酸39.560.06445858 DBT30MOL002201藁本內酯51.300.075877292

圖1 關鍵靶點蛋白PPI網(wǎng)絡篩選圖

表3 核心靶點蛋白拓撲參數(shù)信息

Table 3 Topological parameter information of core target proteins

序號蛋白BCCC度值序號蛋白BCCC度值 1STAT30.038 205 130.947 368 425111TNF0.013 254 280.729 729 7334 2Akt10.026 395 360.857 142 864512IL-60.012 844 070.729 729 7334 3JUN0.026 197 200.830 769 234313HSP90AA10.015 546 760.729 729 7334 4EGFR0.020 950 660.805 970 154114ESR10.009 983 050.7233 5TP530.012 616 800.760 563 383715STAT10.013 734 340.7233 6CTNNB10.016 963 080.760 563 383716EGF0.009 975 970.7233 7RELA0.016 293 610.753617HRAS0.009 565 440.7233 8VEGFA0.016 670 830.753618ERBB20.010 972 390.701 298 7031 9MYC0.011 939 460.739 726 033519PIK3R10.011 611 460.701 298 7031 10SRC0.010 534 450.739 726 033520MAPK10.009 144 180.692 307 6930

圖2 “活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡

表4 關鍵活性成分信息

Table 4 Information of key active components

編號活性成分度值 DBT25槲皮素159 DBT19毛蕊異黃酮115 DBT12芒柄花素111 DBT29阿魏酸92 DBT26毛蕊異黃酮葡萄糖苷91 DBT63,9-di-O-methylnissolin89 DBT17黃芪甲苷86 DBT10(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol81 DBT30藁本內酯78 DBT20山柰酚71

3.5 KEGG通路分析

KEGG通路分析結果，經(jīng)＜0.01篩選后，共得到229條通路結果，前20名見圖4。包括代謝通路、PI3K/Akt信號通路、有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、Ras信號通路等。其中，抗CIRI最相關的通路為PI3K/Akt信號通路，且多數(shù)核心靶點主要富集于此條通路上。因此以其作為后續(xù)動物實驗驗證通路。

3.6 分子對接驗證

分子對接中，對接分數(shù)表示活性物質與蛋白質的親和力和構象的穩(wěn)定性，如圖5所示，各成分與蛋白對接的結合能均小于?21.42 kJ/mol，說明各成分與蛋白均能較好地結合[30]。此外，使用PyMoL軟件對部分結果進行結構匹配分析見圖6，成分與靶點之間通過形成氫鍵等相互作用使結構趨于穩(wěn)定。

圖3 GO功能富集分析

圖4 KEGG通路富集分析(前20)

圖5 分子對接結果圖

3.7 當歸補血湯對CIRI大鼠神經(jīng)功能損傷的影響

如表5所示，與假手術組比較，模型組大鼠神經(jīng)行為學評分顯著升高（＜0.001），神經(jīng)功能損傷嚴重。與模型組比較，尼莫地平組和當歸補血湯中、高劑量組大鼠神經(jīng)行為學評分明顯降低（＜0.05），表明當歸補血湯可以改善CIRI誘導的大鼠神經(jīng)功能損傷。

圖6 部分分子對接結果可視化處理

表5 當歸補血湯對CIRI大鼠神經(jīng)功能損傷的影響(, n = 12)

Table 5 Effect of Danggui Buxue Decoction on neurological damage in CIRI rats (, n = 12)

組別劑量/(g·kg?1)神經(jīng)行為學評分 假手術—0.00±0.00 模型—3.15±0.94*** 尼莫地平0.032 42.30±0.49# 當歸補血湯5.842.85±0.72 11.672.31±0.78# 23.342.42±0.90#

與對照組比較：***＜0.001；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001，下表同

***< 0.001control group;#< 0.05##< 0.01###< 0.001model group, same as below tables

3.8 當歸補血湯對CIRI大鼠腦梗死面積的影響

如圖7所示，假手術組大鼠腦組織并未觀察到腦梗死情況，而模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的腦梗死，腦梗死率高達（43.76±4.56）%。與模型組比較，尼莫地平能夠明顯降低大鼠腦梗死率（＜0.05）；當歸補血湯中、高劑量組腦梗死率明顯降低（＜0.05、0.01）。

3.9 當歸補血湯對CIRI大鼠腦組織病理形態(tài)的影響

如圖8所示，假手術組大鼠腦組織軟腦膜結構完整，炎性滲出不明顯，血管豐富；皮質區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)正常，無細胞變性壞死、炎性細胞浸潤或膠質細胞增生。而模型組腦組織皮質區(qū)可見壞死灶，壞死灶與周圍正常組織分界較明顯，壞死中央見神經(jīng)元壞死，細胞崩解，胞質滲出，細胞核碎裂或溶解消失，壞死灶中央亦見核小呈圓形的膠質細胞增生，壞死灶周圍神經(jīng)元變性壞死，亦見膠質細胞增生。與模型組相比，各給藥組腦組織病理形態(tài)學異常均得到改善，具體表現(xiàn)為皮質區(qū)壞死灶有所好轉，少量神經(jīng)元變性壞死，見少量膠質細胞增生。

與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

A-神經(jīng)元壞死 B-膠質細胞

3.10 當歸補血湯對CIRI大鼠腦組織細胞凋亡的影響

TUNEL染色后，在熒光顯微鏡下，紅色熒光為凋亡的細胞，藍色熒光為細胞核。如圖9所示，模型組可見細胞核收縮、染色質濃縮等典型的凋亡形態(tài)學特征；各給藥組凋亡細胞數(shù)量均明顯減少。定量分析結果見表6，與假手術組相比，模型組細胞凋亡率顯著升高（＜0.001）；與模型組相比，各給藥組細胞凋亡率顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。

圖9 當歸補血湯對CIRI大鼠腦組織細胞凋亡的影響(×400)

表6 各組大鼠腦組織細胞凋亡率(, n = 3)

Table 6 Cell apoptosis ratio in brain of rats in each group (, n = 3)

組別劑量/(g·kg?1)凋亡率/% 假手術—4.66±0.63 模型—28.21±2.68*** 尼莫地平0.032 49.71±1.12### 當歸補血湯5.8425.13±0.95# 11.6721.07±0.54## 23.3417.40±1.18###

3.11 當歸補血湯對CIRI大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響

如表7所示，與假手術組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高（＜0.001）；與模型組相比，各給藥組大鼠血清中TNF-α水平顯著降低（＜0.05、0.01），尼莫地平組和當歸補血湯中、高劑量組大鼠血清中IL-6和IL-1β水平顯著降低（＜0.05）。

表7 當歸補血湯對CIRI大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響(, n = 6)

Table 7 Effect of Danggui Buxue Decoction on levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β in serum of CIRI rats (, n = 6)

組別劑量/(g·kg?1)TNF-α/(pg·mL?1)IL-6/(pg·mL?1)IL-1β/(pg·mL?1) 假手術—116.454±21.95944.155±5.23220.289±2.615 模型—156.976±14.899***58.239±3.565***31.521±2.573*** 尼莫地平0.032 4134.146±16.259#51.385±5.503#27.187±3.055# 當歸補血湯5.84138.390±12.427#53.230±4.58529.015±2.949 11.67134.040±8.321#52.452±3.650#27.555±2.827# 23.34131.693±10.102##52.306±3.480#27.598±3.207#

3.12 當歸補血湯對CIRI大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達的影響

如表8所示，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織、和mRNA表達水平均顯著升高（＜0.001）；與模型組相比，各給藥組大鼠腦組織中、和mRNA表達水平均明顯降低（＜0.01、0.001）。

3.13 當歸補血湯對CIRI大鼠腦組織中Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

如圖10和表9所示，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織中p-Akt和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（＜0.001），Bax蛋白表達水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織p-Akt和Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），Bax蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.001）。

表8 當歸補血湯對CIRI大鼠腦組織IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA表達的影響(, n = 3)

Table 8 Effect of Danggui Buxue Decoction on TNF-α, IL-6 and IL-1β mRNA expressions in brain of CIRI rats (, n = 3)

組別劑量/(g·kg?1)mRNA相對表達量 IL-6TNF-αIL-1β 假手術—0.996±0.0121.081±0.0710.899±0.088 模型—7.543±0.319***7.798±0.659***6.110±0.086*** 尼莫地平0.032 44.669±0.962###4.284±0.234###3.236±0.268### 當歸補血湯5.845.365±0.323##5.812±0.091###4.040±0.327### 11.673.966±0.079###4.623±0.142###2.742±0.244### 23.342.540±0.345###2.458±0.175###2.361±0.204###

圖10 各組大鼠腦組織Akt、p-Akt、Bax和Bcl-2蛋白表達的WB圖

表9 當歸補血湯對CIRI大鼠腦組織Akt、p-Akt、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響(, n = 3)

Table 9 Effect of Danggui Buxue Decoction on Akt, p-Akt, Bax and Bcl-2 protein expressions in brain of CIRI rats (, n = 3)

組別劑量/(g·kg?1)蛋白相對表達量 Akt/GAPDHp-Akt/GAPDHBax/GAPDHBcl-2/GAPDH 假手術—0.680±0.0580.535±0.0360.244±0.0760.753±0.031 模型—0.763±0.067*0.119±0.036***0.857±0.049***0.169±0.025*** 尼莫地平0.032 40.717±0.0420.493±0.019###0.438±0.065###0.600±0.047### 當歸補血湯5.840.731±0.0290.248±0.041##0.725±0.053#0.311±0.093# 11.670.722±0.0320.325±0.021###0.565±0.065###0.432±0.044## 23.340.679±0.046#0.445±0.022###0.450±0.061###0.597±0.029###

4 討論

缺血性腦卒中常伴有神經(jīng)功能障礙、腦梗死和病理學可觀察到的組織損傷。以上各項指標可作為臨床評價腦卒中病情的重要指標，亦可用于實驗中藥物治療效果的評價。臨床常通過再灌注治療缺血性腦卒中，但隨著腦組織恢復血液供應，將引起更嚴重的CIRI。目前，中和炎癥反應、增加抗氧化能力被認為是治療缺血性疾病的有益療法[31]。TNF-α、IL-1β、IL-6是與CIRI的發(fā)生和發(fā)展密切相關的代表性促炎細胞因子，是影響炎癥反應的關鍵因素。多項研究表明，TNF-α、IL-1β和IL-6可能成為防治CIRI的重要靶點[32-34]。分子對接結果表明，當歸補血湯可能主要通過Akt1、轉錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、細胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、TNF和IL-6等核心靶點治療CIRI。同時，體內實驗結果顯示，當歸補血湯組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低，腦組織中、和mRNA表達水平顯著降低。結合以上指標表明，當歸補血湯能夠通過減輕神經(jīng)功能缺損、減少腦梗死面積、改善腦組織形態(tài)學異常、抑制炎癥反應等方面發(fā)揮抗CIRI的作用。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學，構建并分析當歸補血湯抗CIRI的“活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，通過數(shù)據(jù)庫搜索和篩選，獲得當歸補血湯的30種主要活性成分，分子對接研究顯示其主要的活性成分與核心靶點均具有較好的結合活性，結合文獻表明槲皮素[35]、芒柄花素[36]、毛蕊異黃酮[37]和阿魏酸[38]等可能是當歸補血湯抗CIRI的主要藥效物質基礎。

KEGG通路富集分析表明，當歸補血湯可能通過調控PI3K/Akt、MAPK等信號通路發(fā)揮抗CIRI的作用。其中，Akt1、JUN、EGFR、TP53、TNF和IL-6等62個核心靶點均富集于PI3K/Akt信號通路，作為一條關鍵的抗凋亡信號通路，激活PI3K/Akt，可使細胞凋亡受到抑制，線粒體功能得以改善，從而改善腦缺血再灌注所致的神經(jīng)元損傷[39]。越來越多的證據(jù)表明，PI3K/Akt信號通路在CIRI中發(fā)揮重要作用[40-44]。Akt是一類抗凋亡調節(jié)因子，作為PI3K/Akt信號通路的核心效應器，當Akt磷酸化后可作用于Bcl-2蛋白家族，其中抗凋亡蛋白Bcl-2充當線粒體守門人，抑制細胞凋亡[45]。Bax蛋白位于細胞質中，是Bcl-2家族中的一員，當細胞發(fā)生調亡時，Bax可以遷移到線粒體膜中，使細胞色素C得到釋放，加速細胞凋亡。此外，凋亡是否發(fā)生取決于Bcl-2/Bax表達，據(jù)報道，Bcl-2/Bax值的降低與凋亡的增加有關[46]。本研究表明，在模型大鼠腦組織中，細胞凋亡指數(shù)顯著升高，p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax顯著降低，而當歸補血湯可顯著降低細胞凋亡指數(shù)，上調p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax，表明當歸補血湯可能通過激活PI3K/Akt信號通路，進一步調節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達，發(fā)揮抗凋亡作用而保護CIRI，初步驗證了網(wǎng)絡藥理學的預測結果。

秦秀德等[47]總結張伯禮院士治療腦卒中的方法，發(fā)現(xiàn)其更注重補氣養(yǎng)陰、化痰、清熱活血。當歸補血湯作為益氣補血的代表方，方中重用黃芪以大補脾肺、益氣生血，再加少許當歸滋補血營、陽生陰久、氣旺血生[48]，目前已有相關研究對其進行初步證實，研究表明當歸補血湯可保護CIRI的神經(jīng)組織[19-21]。本研究結合網(wǎng)絡藥理學、分子對接和動物實驗，首次對當歸補血湯治療CIRI的機制進行研究，明確了當歸補血湯多成分、多靶點的協(xié)同作用機制。同時，借助改良Longa線栓法復制的CIRI大鼠模型，證實當歸補血湯可以通過調節(jié)PI3K/Akt信號通路抑制炎癥來減少腦組織中細胞的凋亡，從而保護大鼠腦組織。本研究為當歸補血湯抗CIRI的更深層次研究提供理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Danggui Buxue Decoction in intervention of experimental cerebral ischemia reperfusion injury in rats based on PI3K/Akt signaling pathway

SHI Ya1, 2, LIU Wen1, 2, 3, LIU Xing-de1, SONG Xin-li1, 2, LI Xin1, 2, SHU Wan-fen1, 2, ZHANG Gan-chun1, 2, QIN Qin1, 2, WANG Hong-xin1, 2

1. Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China 2. Guizhou Traditional Chinese Medicine Processing and Preparation Engineering Technology Research Center, National Miao Medicine Engineering Technology Research Center, School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China 3. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China

To explore the interventional effect and related mechanism of Danggui Buxue Decoction (當歸補血湯) on rats with cerebral ischemia reperfusion injury (CIRI) based on network pharmacology combined withexperiments.Active ingredients in Danggui Buxue Decoction and targets for the treatment of CIRI were collected from databases, protein-protein interaction (PPI) network was constructed, gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were performed; Key targets and main active ingredients were selected for molecular docking by AutoDock software. After SD rats were given nimodipine or Danggui Buxue Decoction for 2 weeks, middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model was established by modified Longa suture method, neurobehavioral scores were evaluated And brain tissue infarct size was determined; TUNEL staining was used to determine the apoptosis of brain tissue; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to investigate the pathological changes of brain tissue; Levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and IL-1β in serum were determined by ELISA; qRT-PCR was used to detect the mRNA expressions of,andin brain tissue; Western blotting was used to detect protein expressions of protein kinase B (Akt), phosphorylated Akt (p-Akt), B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) and Bcl-2 associated X protein (Bax) in brain tissue.Thirty active ingredients of Danggui Buxue Decoction were screened out, 467 targets and 55 core targets of Danggui Buxue Decoction in the treatment of CIRI were obtained. KEGG pathway enrichment analysis showed that phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathway was one of key mechanisms of Danggui Buxue Decoction against CIRI. Molecular docking showed that main active components in Danggui Buxue Decoction had relatively stable binding activities with core targets such as Akt1, signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), and transcription factor AP-1 (JUN), epidermal growth factor receptor (EGFR), cellular tumor antigen p53 (TP53), TNF and IL-6. The results of animal experiments showed that Danggui Buxue Decoction improved the neurological function damage in CIRI rats (< 0.05), reduced the infarct size of brain tissue (< 0.05, 0.01), alleviated the pathological damage of brain tissue, reduced the apoptosis index of brain tissue (< 0.05, 0.01, 0.001), decreased TNF-α, IL-6 and IL-1β levels in serum (< 0.05, 0.01), decreased,andmRNA expressions in brain tissue (< 0.01, 0.001), activated PI3K/Akt signaling pathway by increasing the phosphorylation level of Akt in brain tissue (< 0.01, 0.001), further up-regulated Bcl-2 protein expression (< 0.05, 0.01, 0.001), and down-regulated Bax protein expression (< 0.05, 0.001).Danggui Buxue Decoction may treat CIRI by acting on multiple targets and multiple pathways, and its mechanism is related to affecting the expression of Akt1, TNF, IL-6, IL-1β and other proteins, thereby regulating PI3K/Akt signaling pathway to inhibit inflammation and apoptosis.

Danggui Buxue Decoction; cerebral ischemia reperfusion injury; network pharmacology; PI3K/Akt signaling pathway; inflammatory response; cell apoptosis; calycosin-7--glucoside; calycosin; ferulic acid; formononetin; ligustolide; astragaloside IV

R285.5

A

0253 - 2670(2022)16 - 5052 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.015

2022-05-17

國家自然科學基金資助項目（82060704）；貴州省特色功能食品與中藥制劑開發(fā)攻關平臺項目（黔教合KY字[2020]006）；貴州中醫(yī)藥大學藥用高分子材料研究中心項目（貴中醫(yī)黨辦發(fā)[2019]70）

石 婭（1993—），女，碩士研究生，研究方向為中藥新技術與新制劑研究。Tel: 18285148380 E-mail: 328697640@qq.com

劉 文（1969—），男，博士生導師，教授，研究方向為中藥新技術與新制劑研究。E-mail: 642771631@qq.com

[責任編輯 李亞楠]