劉 月，李 鑫，龐文倩，楊 哲，陳麗莉, 2，張秋華，李曉龍，畢秀麗*

黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑或喜樹(shù)堿通過(guò)Akt信號(hào)通路協(xié)同增強(qiáng)結(jié)直腸癌化療藥物的治療效果及作用機(jī)制研究

劉 月1，李 鑫1，龐文倩1，楊 哲1，陳麗莉1, 2，張秋華3，李曉龍4，畢秀麗1*

1. 遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036 2. 遼寧大學(xué)數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036 3. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)藥理教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110847 4. 深圳福山生物科技有限公司，廣東 深圳 518000

探究黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑或喜樹(shù)堿在結(jié)直腸癌細(xì)胞和氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌模型小鼠中的協(xié)同作用。結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480和Caco-2給予黑樹(shù)莓花青素、奧沙利鉑或喜樹(shù)堿進(jìn)行干預(yù)，AOM誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌模型小鼠給予黑樹(shù)莓花青素或奧沙利鉑進(jìn)行干預(yù)。采用MTT法檢測(cè)黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑或喜樹(shù)堿對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響；采用Western blotting法檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞和小鼠腸上皮細(xì)胞中蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)；采用蘇木素-伊紅（HE）染色檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織病理變化。黑樹(shù)莓花青素與奧沙利鉑或喜樹(shù)堿聯(lián)合使用可顯著抑制SW480和Caco-2細(xì)胞的增殖（＜0.05、0.01、0.001）；黑樹(shù)莓花青素與奧沙利鉑聯(lián)合使用顯著改善結(jié)直腸癌模型小鼠的狀態(tài)，增加小鼠體質(zhì)量，減少腸道腫瘤數(shù)量（＜0.01）；黑樹(shù)莓花青素可能通過(guò)下調(diào)Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)化療藥物的治療效果（＜0.01、0.001）。黑樹(shù)莓花青素可以協(xié)同增加奧沙利鉑或喜樹(shù)堿的抗腫瘤作用。

黑樹(shù)莓花青素；結(jié)直腸癌；化療藥物；協(xié)同作用；Akt信號(hào)通路

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界第3大惡性腫瘤，2020年全球范圍內(nèi)約有190萬(wàn)CRC病例，其中90萬(wàn)人死亡[1]。奧沙利鉑和喜樹(shù)堿等藥物化療是臨床治療CRC的主要方法之一，大量臨床數(shù)據(jù)表明，在初始治療期間，化療藥物治療效果顯著，然而，長(zhǎng)期使用不僅會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，也會(huì)使腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性降低，從而產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。因此如何增強(qiáng)CRC的化療敏感性、改善耐藥性是CRC治療的關(guān)鍵。

化療藥物聯(lián)合天然產(chǎn)物能夠提高化療藥物的治療效果。如白藜蘆醇與5-氟尿嘧啶、依托泊苷、絲裂霉素、奧沙利鉑等化療藥物具有協(xié)同作用[3]，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制內(nèi)源性抗氧化能力使CRC細(xì)胞對(duì)化療藥物引起的細(xì)胞毒性氧化應(yīng)激敏感，或協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4-5]。表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）與5-氟尿嘧啶聯(lián)用的結(jié)果顯示，EGCG對(duì)DLD1、SW480和COLO201等CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)具有協(xié)同增強(qiáng)的抑制作用[6]。以上研究提示，傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合天然產(chǎn)物的治療方式可能為增強(qiáng)CRC的化療敏感性提供了一個(gè)新的視角和方法。

黑樹(shù)莓H. Lévl.為薔薇科勾懸子屬漿果，因其獨(dú)特的抗氧化、抗炎、抗血管生成、抗癌等活性而受到廣泛關(guān)注[7]。研究表明黑樹(shù)莓中富含酚酸類、黃酮類、原花青素、鞣質(zhì)、苯乙烯、木脂素、三萜和甾醇等大量多酚類活性物質(zhì)[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黑樹(shù)莓花青素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群和分泌型卷曲相關(guān)蛋白2（secreted frizzled-related protein 2，SFRP2）去甲基化[9]，還能夠通過(guò)調(diào)控、/Dickkopf相關(guān)蛋白3（Dickkopf-related protein 3，DKK3）相關(guān)信號(hào)通路，從而預(yù)防CRC[10-11]。然而，黑樹(shù)莓花青素的聯(lián)合使用能否增強(qiáng)化療藥物的治療效果仍不清楚，因此本研究旨在探究黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑或喜樹(shù)堿在CRC化療中的協(xié)同作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480和Caco-2購(gòu)自名勁生物。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，5周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（遼）-2017-0001。小鼠飼養(yǎng)于12 h/12 h的明暗循環(huán)中，并給予正常的水與飼料。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)21000092017048）。

1.3 黑樹(shù)莓花青素飼料

黑樹(shù)莓花青素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%）由天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司提供。根據(jù)本課題組前期研究中10%黑樹(shù)莓凍干粉的小鼠喂食劑量[9,12]，并結(jié)合黑樹(shù)莓花青素的提取率[13]，將黑樹(shù)莓花青素混合進(jìn)正常飼料中做成日糧，具體成分配比見(jiàn)表1。飼料由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司制作。

表1 飼料配方

Table 1 Formula and nutrition of diet

原料名稱單位正常飼料黑樹(shù)莓花青素飼料 大豆g·kg?15656 玉米淀粉g·kg?1300300 面粉g·kg?1250250 糠麩g·kg?18080 魚粉g·kg?1258258 纖維素g·kg?14040 鈣g·kg?11010 磷g·kg?166 黑樹(shù)莓花青素μmol·g?1—7.0 蛋白質(zhì)%2020 脂肪%1010 碳水化合物%7070 能量MJ·kg?118.818.8

1.4 藥品與試劑

胎牛血清（批號(hào)SA210623）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；喜樹(shù)堿（批號(hào)IC0950，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；奧沙利鉑（批號(hào)hzm2212，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%）購(gòu)自上海藍(lán)木化工生物科技有限公司；氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM，批號(hào)0218397125）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RIPA裂解液（批號(hào)C500005）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)C503021）、MTT試劑盒（批號(hào)E606334-0250）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）抗體（批號(hào)14179S）、β-actin抗體（批號(hào)AB10024）購(gòu)自上海生工生物有限公司；ZESTE同源物增強(qiáng)子2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）抗體（批號(hào)5246S）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號(hào)9272）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）抗體（批號(hào)13038P）、人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）抗體（批號(hào)9188S）、組蛋白H3（histone H3，H3）抗體（批號(hào)4499S）購(gòu)自美國(guó)CST公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)59120300）購(gòu)自Biosharp公司。

1.5 儀器

iMark酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Agilent公司）；JY-SCZ2型垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；?80 ℃超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；超凈工作臺(tái)（德國(guó)SPETEC公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

SW480和Caco-2細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

將SW480細(xì)胞或Caco-2細(xì)胞以1×103個(gè)/孔接種至96孔板中，或以2×105個(gè)/孔接種至6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度為60%時(shí)，用含或不含黑樹(shù)莓花青素的奧沙利鉑或喜樹(shù)堿處理。

SW480細(xì)胞分組：對(duì)照組、黑樹(shù)莓花青素（50 μg/mL）組、奧沙利鉑（2、4 μmol/L）組、喜樹(shù)堿（1.25、2.5 μmol/L）組、奧沙利鉑（2、4 μmol/L）＋黑樹(shù)莓花青素（50 μg/mL）組和喜樹(shù)堿（1.25、2.5 μmol/L）＋黑樹(shù)莓花青素（50 μg/mL）組。

Caco-2細(xì)胞分組：對(duì)照組、黑樹(shù)莓花青素（50 μg/mL）組、奧沙利鉑（4、6 μmol/L）組、喜樹(shù)堿（3、4 μmol/L）組、黑樹(shù)莓花青素（50 μg/mL）＋奧沙利鉑（4、6 μmol/L）組和黑樹(shù)莓花青素（50 μg/mL）＋喜樹(shù)堿（3、4 μmol/L）組。

2.2 黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑或喜樹(shù)堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

按“2.1”項(xiàng)下方法處理24 h或48 h后，加入MTT試劑（0.5 mg/mL），37 ℃孵育4 h，加入100 μL二甲基亞砜，測(cè)定490 nm處的吸光度（）值。

2.3 結(jié)直腸癌小鼠模型的建立及分組

C57BL/6雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、黑樹(shù)莓花青素組、奧沙利鉑組以及黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑組，每組10只。除對(duì)照組外，其余各組小鼠ip AOM溶液（10 mg/kg），每周1次，持續(xù)6周，對(duì)照組ip等體積無(wú)菌生理鹽水。本課題組前期研究顯示[14]，模型小鼠在相同條件下第14周的成瘤率為100%，因此第14周后，奧沙利鉑組以及黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑組小鼠ip奧沙利鉑（5 mg/kg），每周2次；同時(shí)黑樹(shù)莓花青素組和黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑組小鼠開(kāi)始飼喂黑樹(shù)莓花青素飼料，持續(xù)6周，每組小鼠每天給予同樣質(zhì)量的飼料，保證進(jìn)食量一致。第20周處死小鼠（最終每組納入統(tǒng)計(jì)的動(dòng)物數(shù)量≥8），解剖觀察腸道內(nèi)部，統(tǒng)計(jì)腫瘤數(shù)目，并收集腸上皮細(xì)胞和其他組織器官。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，記錄各組小鼠的體質(zhì)量和生活狀況。

2.4 小鼠腸上皮細(xì)胞的收集

取各組小鼠腸組織，用手術(shù)刀縱向切開(kāi)回腸和結(jié)腸，將腸組織切成段，置于冷PBS緩沖液中沖洗后，加入15 mmol/L乙二胺四乙酸緩沖液，37 ℃孵育30 min，使用振蕩器渦旋振蕩，直到腸組織變白或液體中出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)。在去除腸肌肉組織后，離心收集上皮細(xì)胞沉淀，置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 小鼠腸組織的蘇木素-伊紅（HE）染色

小鼠腸道組織去除內(nèi)容物后，置于10%的甲醛溶液中固定過(guò)夜，后續(xù)的石蠟包埋、切片和染色等步驟由武漢塞維爾生物科技有限公司完成。取出組織依次通過(guò)不同濃度的乙醇，通過(guò)2次二甲苯，將組織取出浸于石蠟中3次，烘干后用石蠟包埋組織，待石蠟?zāi)毯笕〕隽栏蛇M(jìn)行切片；脫蠟處理后用蘇木素染色10 min，用自來(lái)水沖洗使切片顏色變藍(lán)；將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色進(jìn)行分化和漂洗；將切片依次放入不同濃度乙醇中各3～5 min，用伊紅染液染色1～3 min；將切片放入95%乙醇-無(wú)水乙醇中3～5 min，最后放入二甲苯中脫水透明后，用中性樹(shù)膠封片保存拍照。

2.6 黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑或喜樹(shù)堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系或小鼠腸上皮細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

按“2.1”項(xiàng)下方法處理24 h或48 h后，收集細(xì)胞；收集“2.4”項(xiàng)下小鼠腸上皮細(xì)胞。分別加入100 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，加入20 μL 5×Loading Buffer混勻后，95 ℃金屬浴5 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%牛血清白蛋白溶液，室溫封閉1 h，分別加入EZH2、H3、H3K27me、Akt、p-Akt、HIF-1α和β-actin抗體，室溫孵育3 h；TBST洗滌3次，10 min/次，加入HRP標(biāo)記的二抗，孵育2.5 h，加入ECL發(fā)光液顯影。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用Graphpad Prism 6.0軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用檢驗(yàn)及方差分析。

3 結(jié)果

3.1 奧沙利鉑或喜樹(shù)堿聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素可增強(qiáng)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用

奧沙利鉑和喜樹(shù)堿是臨床常用的化療藥物，為了探究奧沙利鉑或喜樹(shù)堿聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素對(duì)CRC細(xì)胞增殖的影響，將不同濃度的奧沙利鉑或喜樹(shù)堿聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素分別添加到Caco-2或SW480細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，利用MTT檢測(cè)CRC細(xì)胞的增殖情況。如圖1-A、B所示，在Caco-2或SW480細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，奧沙利鉑或奧沙利鉑聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素可顯著抑制細(xì)胞存活率（＜0.01、0.001），奧沙利鉑聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用明顯高于單獨(dú)使用奧沙利鉑（＜0.05、0.01、0.001）。同時(shí)，在喜樹(shù)堿組或喜樹(shù)堿聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素組中也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果（圖1-C、D）。以上結(jié)果表明，黑樹(shù)莓花青素可增強(qiáng)奧沙利鉑或喜樹(shù)堿對(duì)CRC細(xì)胞的抗增殖作用。

3.2 奧沙利鉑或喜樹(shù)堿聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素對(duì)CRC細(xì)胞Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Akt信號(hào)通路與細(xì)胞生存密切相關(guān)，其在腫瘤細(xì)胞中異常激活通常會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移并抑制凋亡，研究表明，Akt信號(hào)通路異?；罨c腫瘤耐藥密切相關(guān)[15]。HIF-1α是在缺氧狀態(tài)下廣泛存在于腫瘤細(xì)胞中的一種核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中化療藥物耐藥性的重要因子，可以被Akt等信號(hào)通路調(diào)節(jié)[16-17]。因此進(jìn)一步探討了Akt信號(hào)通路相關(guān)因子是否參與黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑或喜樹(shù)堿的協(xié)同增效作用。如圖2-A、B所示，與單獨(dú)使用奧沙利鉑相比，奧沙利鉑聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素處理后，SW480和Caco-2細(xì)胞中p-Akt和HIF-1α的蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01、0.001）。同時(shí)，在喜樹(shù)堿組或喜樹(shù)堿聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素組中也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果（圖2-C、D）。以上結(jié)果提示，Akt信號(hào)通路可能參與了黑樹(shù)莓花青素協(xié)同增強(qiáng)奧沙利鉑或喜樹(shù)堿的抗腫瘤作用。

BRA-黑樹(shù)莓花青素 L-OHP-奧沙利鉑 CPT-喜樹(shù)堿 與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與奧沙利鉑或喜樹(shù)堿組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下圖同

圖2 奧沙利鉑或喜樹(shù)堿聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素對(duì)CRC細(xì)胞Akt信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響(, n = 3)

3.3 奧沙利鉑聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素對(duì)AOM誘導(dǎo)的CRC小鼠模型腫瘤進(jìn)展的影響

在體外研究的基礎(chǔ)上，選擇了效果較好的奧沙利鉑進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)研究。如圖3-A所示，與模型組比較，各給藥組小鼠腸道內(nèi)腫瘤數(shù)目顯著減少（＜0.01），黑樹(shù)莓花青素＋奧沙利鉑組小鼠腫瘤數(shù)目顯著低于單獨(dú)使用奧沙利鉑組（＜0.01）。如圖3-B所示，在藥物治療期間，與模型組相比，各給藥組小鼠體質(zhì)量得到明顯改善，尤其黑樹(shù)莓花青素＋奧沙利鉑組小鼠體質(zhì)量增加趨勢(shì)更明顯。通過(guò)HE染色評(píng)估各組小鼠結(jié)直腸的病理變化，如圖3-C所示，與模型組相比，奧沙利鉑組和黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑組小鼠腸道結(jié)構(gòu)完整性更高，組織結(jié)構(gòu)的破壞和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)程度都有所降低，并且黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑比單獨(dú)使用奧沙利鉑效果更好。以上結(jié)果表明，黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑能顯著增強(qiáng)奧沙利鉑的治療效果，抑制小鼠CRC的進(jìn)展。

A-各組小鼠腸道內(nèi)腫瘤數(shù)量 B-各組小鼠體質(zhì)量變化 C-各組小鼠腸道組織病理變化 與模型組比較：**P＜0.01；與奧沙利鉑組比較：##P＜0.01

3.4 奧沙利鉑聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素治療CRC小鼠對(duì)Akt信號(hào)通路相關(guān)因子的影響

EZH2是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，主要作用于組蛋白H3對(duì)Lys27（H3K27me）的甲基化，導(dǎo)致其靶基因沉默，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等多種生物活性[18]。EZH2通過(guò)調(diào)控靶向Akt信號(hào)通路的腫瘤抑制因子影響下游信號(hào)通路的表達(dá)[19]。PTEN作為一種腫瘤抑制因子，通過(guò)靶向Akt的3’-UTR來(lái)抑制Akt的磷酸化[19-20]。因此進(jìn)一步探討黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑處理對(duì)CRC小鼠Akt信號(hào)通路相關(guān)因子的影響，如圖4所示，與模型組相比，各給藥組小鼠腸上皮細(xì)胞中p-Akt、EZH2和H3K27me蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001）；奧沙利鉑組和黑樹(shù)莓花青素組HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01、0.001）；奧沙利鉑聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素組HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.001）。提示奧沙利鉑聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素可調(diào)控Akt信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)水平，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。推測(cè)奧沙利鉑聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素可能通過(guò)調(diào)節(jié)Akt通路相關(guān)因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)HIF-1α等耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)化療藥物的治療效果緩解CRC的進(jìn)展。

4 討論

癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低是化療失敗的主要原因之一。已有研究表明，影響化療藥物敏感性的因素包括藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)增加、藥動(dòng)學(xué)的改變等[21]。本研究結(jié)果表明，黑樹(shù)莓花青素可能通過(guò)調(diào)控Akt信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)降低化療耐藥性，增強(qiáng)化療藥物奧沙利鉑或喜樹(shù)堿的治療效果。

黑樹(shù)莓花青素具有獨(dú)特的多酚、花青素和鞣質(zhì)等成分，具有較強(qiáng)的抗氧化能力。已有臨床研究表明，黑樹(shù)莓花青素可影響參與致癌物代謝活化和解毒的酶的活性，預(yù)防和抑制CRC的進(jìn)展[22]。本課題組前期研究提示，黑樹(shù)莓花青素作為一種有效的CRC化學(xué)預(yù)防劑，能夠抑制Apc1638+/?和Muc2?/?CRC小鼠模型中結(jié)直腸腫瘤的形成、腫瘤數(shù)量和細(xì)胞增殖[23]。受到天然產(chǎn)物與化療藥物聯(lián)合研究的啟發(fā)[24]，推測(cè)黑樹(shù)莓花青素是否可以作為化療藥物的增效劑，協(xié)同降低CRC細(xì)胞的增殖能力，抑制CRC的進(jìn)程。本研究結(jié)果表明，黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑或喜樹(shù)堿對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。

與對(duì)照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與奧沙利鉑組比較：+++P＜0.001

Akt信號(hào)通路異?；罨c腫瘤耐藥密切相關(guān)，抑制該通路后，可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，從而恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[15]。因此，Akt信號(hào)通路相關(guān)因子是影響癌細(xì)胞化療耐藥的重要因子。HIF-1α是廣泛存在于腫瘤細(xì)胞中的一種核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中化療藥物耐藥性，被Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)[16-17]。據(jù)報(bào)道，化療藥物在組織、血液缺氧時(shí)不能有效轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，使藥物不能發(fā)揮自身的療效，即使在有氧恢復(fù)的情況下，也是不可逆的[25]。在本研究中，與單獨(dú)使用奧沙利鉑或喜樹(shù)堿組相比，黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合組p-Akt和HIF-1α蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)。以往的研究表明，EZH2的過(guò)表達(dá)可增加非小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)化療藥物的耐藥性[26-27]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素處理后，EZH2和H3K27me蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，而PTEN蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。與奧沙利鉑組相比，奧沙利鉑聯(lián)合黑樹(shù)莓花青素組腫瘤數(shù)量減少更明顯。提示黑樹(shù)莓花青素可能通過(guò)調(diào)控Akt信號(hào)通路相關(guān)因子協(xié)同增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤效果。

綜上所述，黑樹(shù)莓花青素聯(lián)合奧沙利鉑或喜樹(shù)堿增強(qiáng)了CRC細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，為黑樹(shù)莓花青素作為化療藥物的增效劑提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用前景。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Black raspberry anthocyanins combined with oxaliplatin or camptothecin synergistically enhance therapeutic effect of colorectal cancer chemotherapy drugs and mechanism through Akt signaling pathway

LIU Yue1, LI Xin1, PANG Wen-qian1, YANG Zhe1, CHEN Li-li1, 2, ZHANG Qiu-hua3, LI Xiao-long4, BI Xiu-li1

1. College of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China 2. College of Mathematics and Statistics, Liaoning University, Shenyang 110036, China 3. Department of Basic Pharmacology, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China 4. Shenzhen Fushan Biotech Co., Ltd., Shenzhen 518000, China

To explore the synergistic effect of black raspberry anthocyanins combined with oxaliplatin or camptothecin on colorectal cancer cells and azoxymethane (AOM)-induced colorectal cancer mouse model.Colorectal cancer cell lines SW480 and Caco-2 were treated with black raspberry anthocyanins, oxaliplatin or camptothecin, and AOM-induced colorectal cancer model mice were treated with black raspberry anthocyanins or oxaliplatin. MTT assay was used to detect the effect of black raspberry anthocyanins combined with oxaliplatin or camptothecin on proliferation of colorectal cancer cells; Western blotting was used to detect protein kinase B (Akt) signaling pathway-related protein expression in colorectal cancer cells and mouse intestinal epithelial cells; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to detect the pathological changes of colon tissue in mice.The combined use of black raspberry anthocyanins and oxaliplatin or camptothecin could significantly inhibit the proliferation of SW480 and Caco-2 cells (< 0.05, 0.01, 0.001); The combined use of black raspberry anthocyanins and oxaliplatin significantly improved the state of colorectal cancer mouse model, increased the body weight of mice, and reduced the number of intestinal tumors (< 0.01); Black raspberry anthocyanins enhanced the therapeutic effect of chemotherapy drugs by down-regulating the expression of Akt signaling pathway-related proteins (< 0.01, 0.001).Black raspberry anthocyanins can synergistically increase the antitumor effect of oxaliplatin or camptothecin.

black raspberry anthocyanins; colorectal cancer; chemotherapy drugs; synergistic effect; Akt signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)16 - 5044 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.014

2022-04-27

遼寧省教育廳基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（LETU#LZD201904）；遼寧大學(xué)數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)院學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（MSKY202210）

劉 月（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槟c道腫瘤的預(yù)防和治療。E-mail: 690966813@qq.com

畢秀麗（1977—），女，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)槟c道腫瘤的預(yù)防和治療。E-mail: xiulibi@gmail.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]