李 碩，白金釗，劉閏平

·藥理與臨床?

18β-甘草次酸增強固有免疫細胞中I型干擾素響應進而協(xié)同抑制肝癌生長的機制研究

李 碩，白金釗#，劉閏平*

北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029

在固有免疫細胞中明確18β-甘草次酸對I型干擾素通路的激動活性，并評價其在肝癌模型小鼠中的協(xié)同抑瘤作用。CCK-8法檢測18β-甘草次酸對RAW264.7巨噬細胞增殖的影響；qRT-PCR法檢測18β-甘草次酸對免疫細胞[RAW264.7細胞、小鼠骨髓來源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM）、小鼠骨髓來源樹突狀細胞（bone marrow-dendritic cells，BMDC）]中干擾素β1（interferon beta 1，）、干擾素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，）和干擾素誘導蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，）mRNA表達的影響；qRT-PCR法檢測18β-甘草次酸與干擾素α2（interferon alpha 2，IFNα2）聯(lián)用對免疫細胞中和mRNA表達的影響；Western blotting法檢測18β-甘草次酸對IFNα2誘導的RAW264.7細胞Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）、酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，TYK2）、信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）和STAT2磷酸化水平的影響。C57BL/6小鼠通過原位移植瘤手術(shù)建立肝癌模型，隨機分為模型組、奧沙利鉑組和奧沙利鉑＋18β-甘草次酸組，給予奧沙利鉑和18β-甘草次酸治療，評價小鼠體質(zhì)量變化、腫瘤質(zhì)量、脾質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)。18β-甘草次酸顯著升高了、和的mRNA表達水平（＜0.05、0.01、0.001），協(xié)同增強了IFNα2誘導的和的mRNA表達（＜0.05、0.01、0.001）；18β-甘草次酸促I型干擾素的活性可能依賴于其對IFNα2誘導的下游信號轉(zhuǎn)導關(guān)鍵蛋白JAK1、TYK2、STAT1、STAT2磷酸化的增強作用（＜0.05、0.01、0.001）。18β-甘草次酸與奧沙利鉑聯(lián)用顯著抑制了小鼠肝細胞癌原位移植瘤的惡性生長（＜0.01），并改善了奧沙利鉑毒性相關(guān)的體質(zhì)量下降。18β-甘草次酸能夠激活JAK-STAT信號并誘導I型干擾素下游ISGs的表達，同時能與奧沙利鉑協(xié)同抑制肝癌生長，從而發(fā)揮激活腫瘤免疫的作用。

18β-甘草次酸；I型干擾素；巨噬細胞；樹突狀細胞；肝癌；免疫調(diào)控

中醫(yī)藥的發(fā)展源遠流長，歷久彌新。中醫(yī)藥已在非典型性肺炎、新型冠狀病毒肺炎、肺癌、乳腺癌、慢性炎癥等免疫相關(guān)疾病的治療中展現(xiàn)了其特色治療優(yōu)勢[1-2]。中醫(yī)對免疫的理解主要體現(xiàn)在“正氣存內(nèi)，邪不可干；邪之所湊，其氣必虛”，所謂扶正，即為提高機體免疫能力[3]?，F(xiàn)代研究顯示，中藥及其活性成分在免疫相關(guān)疾病的治療中具有多層次、多靶點、穩(wěn)定免疫系統(tǒng)、增強細胞免疫同時抑制炎癥因子等特點[2]。如人參具有“大補元氣”的功效，其活性成分人參皂苷Rg3通過下調(diào)細胞程序性死亡-配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）恢復T細胞對癌細胞的細胞毒性[4]；黃芪具有“補氣升陽”之效，黃芪中的黃芪多糖是中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準使用的免疫增強劑，能夠調(diào)節(jié)固有免疫和適應性免疫系統(tǒng)[5]；甘草具有“補脾益氣、清熱解毒”的功效，多篇研究報道了甘草及其活性成分能夠通過調(diào)控核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路緩解潰瘍性結(jié)腸炎、肝缺血再灌注損傷、急性腎損傷等疾病[6-8]。

固有免疫是宿主抵御病原微生物的第一道防線，也是人類炎癥性疾病的重要調(diào)節(jié)劑[9]。I型干擾素（type I interferons，IFN-I）通過促進抗原呈遞和自然殺傷細胞功能，同時抑制炎癥信號和細胞因子的產(chǎn)生，在維持固有免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。IFN-I家族由IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ和IFN-ω 7種成員構(gòu)成[10]。IFN-I可以由大多數(shù)細胞感知病原體后分泌，以巨噬細胞和樹突狀細胞為代表的固有免疫細胞是其主要來源[11]。IFN-I以自分泌或旁分泌方式結(jié)合在由干擾素-α/β二聚體受體1（interferon alpha/beta receptor 1，IFNAR1）和IFNAR2亞基構(gòu)成的異質(zhì)二聚體跨膜受體上，隨后激活Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）和酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，TYK2），并參與信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）聚集、酪氨酸磷酸化和二聚物形成的過程。磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚物并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與干擾素調(diào)節(jié)因子9（interferon regulatory factors，IRF9）結(jié)合形成干擾素刺激基因因子3（interferon-stimulated gene factor 3，ISGF3），隨后激活干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的轉(zhuǎn)錄[12]。ISGs可以通過正負向調(diào)控的方式平衡IFN-I介導的病原體識別與非特異性免疫應答，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的ISGs分子有300多種，包括Isg15、干擾素誘導蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，Ifit1）、寡腺苷酸合成酶（oligoadenylate synthase，OAS）等[13]。因其特殊活性，近年來以IFN-α、IFN-β為代表的IFN-I作為一種細胞因子在臨床中被廣泛研究和使用。多項研究表明，IFN-I在多種實體腫瘤與血液系統(tǒng)惡性腫瘤中能夠抑制腫瘤生長，延長患者生存期。對其抗腫瘤活性機制的研究主要涉及激活免疫系統(tǒng)、抑制基因組甲基化、IFN-I通路靶點激活以及IFN-I產(chǎn)物ISGs作用等方面[14-16]。有研究者證明樹突狀細胞、巨噬細胞通過非特異性免疫系統(tǒng)環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-干擾素基因刺激蛋白（stimulator of interferon gene，STING）途徑產(chǎn)生IFN-I[17]，IFN-I能夠直接或間接激活特定的免疫細胞，發(fā)揮強烈的T細胞反應，發(fā)揮對腫瘤的識別與消殺作用[18]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘草水提物具有顯著的IFN-I激活作用，并初步提示發(fā)揮該作用的單體成分可能是18β-甘草次酸。因此，本研究首先在體外系統(tǒng)探究了18β-甘草次酸對IFN-I活性的調(diào)控作用及其具體作用靶點，隨后利用小鼠原位肝癌模型闡明其藥理作用，為中藥單體成分在IFN-I相關(guān)疾病的治療提供實驗證據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 細胞

小鼠巨噬細胞RAW264.7和小鼠肝癌細胞Hep1-6購自美國ATCC。

1.2 動物

SPF級C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量20～25 g，8周齡，由斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于符合SPF標準的12 h光暗交替環(huán)境中，自由進食飲水。所有動物實驗和研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號BUCM-4-2020083001-3011），并嚴格按照章程執(zhí)行。

1.3 藥品與試劑

18β-甘草次酸（批號471-53-4，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自成都普思生物科技股份有限公司；鼠源重組蛋白IFNα2、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）購自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自以色列BI公司；青霉素-鏈霉素（批號10378016）購自美國Invitrogen公司；橄欖油（批號8001-25-0）購自Baker Dream公司；奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA，批號61825-94-3）購自上海源葉生物科技有限公司；CCK-8檢測試劑盒購自新賽美公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Western blotting高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒購自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體（批號66009-1-lg）、t-JAK1抗體（批號66466-1-lg）、p-JAK1抗體（批號AP0530）、t-TYK2抗體（批號67411-1-lg）、p-TYK2抗體（批號AP0543）、t-STAT1抗體（批號A12075）、p-STAT1抗體（批號AP0453）、t-STAT2（批號A3588）、p-STAT2抗體（批號AP0284）購自美國Proteintech公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體、HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體購自上海愛必信生物科技有限公司。

1.4 儀器

HERA cellvios 160i型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CKX53型倒置光學顯微鏡（日本Olympus公司）；Spectramax i3x型酶標儀（美國Molecular Devices公司）；5424R型冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Quant StudioTM6 Flex型qRT-PCR儀（美國ABI公司）；ChemiDocTM MP Imaging System（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

RAW264.7細胞和Hep1-6細胞用含1%青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀態(tài)，2～3 d進行換液。當細胞密度達到80%～85%時，按1∶3進行傳代培養(yǎng)。

2.2 小鼠骨髓來源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM）和小鼠骨髓來源樹突狀細胞（bone marrow-dendritic cells，BMDC）的提取與培養(yǎng)

選用8～10周齡雄性C57BL/6小鼠，脫頸處死后，剔除腿部肌肉及骨盆和股骨的剩余軟組織，剪開腿骨兩端，12 000×離心2 min，收集小鼠骨髓細胞。將收集的細胞培養(yǎng)于含10 %胎牛血清、10% L929細胞上清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，第3、5天換液。培養(yǎng)7 d后，用刮板收集成熟的BMDM。

將小鼠骨髓細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、20 ng/mL GM-CSF、10 ng/mL IL-4的RPMI 1640培養(yǎng)基中，第2、4天半量換液。第6天，收集懸浮及巰松貼壁生長的細胞，重新鋪板后培養(yǎng)1～2 d，收集懸浮細胞即為成熟的BMDC。

2.3 CCK-8法檢測RAW264.7細胞增殖

取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以1×104個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，細胞貼壁后，分別加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基100 μL，使得18β-甘草次酸的最終濃度為1.25、5、20、40、60、80、120、160 μmol/L，每個濃度均設(shè)置3個復孔，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育1 h，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(給藥－對照)/對照

2.4 qRT-PCR檢測RAW264.7細胞、BMDM、BMDC中Ifnb1、Isg15和Ifit1 mRNA表達

RAW264.7細胞、BMDM和BMDC分別以1×105個/孔接種于6孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜后，更換新鮮培養(yǎng)基孵育1 h，加入不同濃度的藥物，使得18β-甘草次酸的最終濃度為20、40、60 μmol/L；培養(yǎng)1 h后，相應的孔中加入IFNα2（50 ng/mL）。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1，將次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，）為內(nèi)參。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 (5’-3’) Hprt1F: CAGACTTTGTTGGATTTGAAA R: GCTCATCTTAGGCTTTGTAT Ifnb1F: CAGCTCCAAGAAAGGACGAAC R: GGCAGTGTAACTCTTCTGCAT Isg15F: GGTGTCCGTGACTAACTCCAT R: TGGAAAGGGTAAGACCGTCCT Ifit1F: CTGAGATGTCACTTCACATGGAA R: GTGCATCCCCAATGGGTTCT

2.5 Western blotting檢測RAW264.7細胞中t-JAK1、p-JAK1、t-TYK2、p-TYK2、t-STAT1、p-STAT1、t-STAT2和p-STAT2蛋白表達

RAW264.7細胞以1×105個/孔接種于6孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜后，更換新鮮培養(yǎng)基孵育1 h，加入50 ng/mL的IFNα2培養(yǎng)，分別于0.5、1、2、4、6 h棄去培養(yǎng)基，使用RIPA裂解緩沖液裂解細胞，提取總蛋白。

RAW264.7細胞以1×105個/孔接種于6孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜后，更換新鮮培養(yǎng)基孵育1 h，加入不同濃度的藥物使得18β-甘草次酸的最終濃度為20、40、60 μmol/L；培養(yǎng)1 h后，相應的孔中加入50 ng/mL的IFNα2。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，棄去培養(yǎng)基，使用RIPA裂解緩沖液裂解細胞，提取總蛋白。

蛋白與Loading Buffer預混并加熱變性，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于脫脂牛奶中封閉，分別加入相應抗體，4 ℃孵育過夜；TBST漂洗后，加入相應二抗孵育1 h。使用ChemiDocTM MP Imaging System軟件進行成像，使用Quantity One軟件進行圖像分析。

2.6 動物分組、造模及給藥

18只8周齡雄性C57BL/6小鼠通過手術(shù)建立肝癌模型。麻醉機麻醉小鼠并剃去腹部毛發(fā)，用酒精及碘伏棉球為剃毛部位消毒，沿劍突下方約0.5 cm處剪開長度約1.5 cm，用PBS潤濕棉簽將肝大葉擠出，使用微量注射器吸取50 μL Hep1-6細胞懸液（約4×106個），沿肝臟邊緣注射。將肝大葉擠回原位后，逐層縫合傷口。再次對傷口消毒以防感染，將手術(shù)后小鼠放入干凈鼠籠中，觀察小鼠狀態(tài)。

手術(shù)后隨機分為模型組、奧沙利鉑（7.5 mg/kg）組和奧沙利鉑（7.5 mg/kg）＋18β-甘草次酸（100 mg/kg）組，每組6只。手術(shù)5 d后，奧沙利鉑組和奧沙利鉑＋18β-甘草次酸組ip奧利沙鉑，模型組ip葡萄糖生理鹽水，每2天1次，持續(xù)2周。奧沙利鉑＋18β-甘草次酸組于第1次ip奧利沙鉑后1 d開始，ig用含5%二甲基亞砜的橄欖油配制的18β-甘草次酸溶液，其他組ig含5%二甲基亞砜的橄欖油，每2天1次，持續(xù)2周（造模及給藥流程見圖1），并記錄小鼠體質(zhì)量變化。末次給藥24 h后，小鼠麻醉處死，取肝脾臟，稱定腫瘤、肝臟、脾臟質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)。

圖1 造模及給藥流程

2.7 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0軟件進行分析，結(jié)果以表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析。

3 結(jié)果

3.1 18β-甘草次酸對RAW264.7細胞增殖的影響

RAW264.7細胞是藥物體外評價的常用細胞系。如圖1所示，18β-甘草次酸濃度在75.33 μmol/L時RAW264.7細胞存活率下降至50%。因此，選擇無明顯細胞毒性的20、40和60 μmol/L分別作為低、中、高劑量進行后續(xù)研究。

圖1 18β-甘草次酸對RAW264.7細胞增殖的影響

3.2 18β-甘草次酸促進IFN-I響應

首先在RAW264.7細胞中評價了單獨給予高、中、低3個劑量的18β-甘草次酸對IFN-I響應的作用。如圖2-A所示，在RAW264.7細胞中，與對照組相比，18β-甘草次酸中、高劑量組、和mRNA表達水平均顯著升高（＜0.01、0.001），其中高劑量組更為明顯，呈劑量相關(guān)性。巨噬細胞和樹突狀細胞均為IFN-I的主要來源，而RAW264.7細胞并無明顯的分化傾向，無法針對性評價18β-甘草次酸調(diào)節(jié)IFN-I響應的主要靶細胞。因此，從小鼠腿骨中提取并培養(yǎng)原代BMDM與BMDC，考查18β-甘草次酸對2種免疫細胞中IFN-I的特異性作用。如圖2-B所示，在BMDM中，18β-甘草次酸各劑量組和mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），18β-甘草次酸低、中劑量組mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），其中低劑量組效果最佳，以上作用并沒有顯著的劑量相關(guān)性，可能與高劑量下BMDM對18β-甘草次酸耐受較差，存在一定細胞毒性相關(guān)。如圖2-C所示，在BMDC中，18β-甘草次酸低、高劑量組mRNA表達水平顯著升高（＜0.01、0.001），而和mRNA表達水平均無明顯變化。表明與樹突狀細胞相比，18β-甘草次酸在巨噬細胞中具有更強的IFN-I激活作用。

C-對照組 18β-Ga-18β-甘草次酸，下同 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

3.3 18β-甘草次酸促進IFNα2誘導的下游信號轉(zhuǎn)導和ISGs表達

IFN-α是IFN-I的多效性細胞因子，目前已用于肝炎病毒、流感病毒等多種病毒感染性疾病及淋巴癌、黑色素瘤等多種癌癥的臨床治療[19]。然而，治療所需劑量大導致了明顯的不良反應，嚴重限制了其在臨床的廣泛應用[20]。與低毒性、可以增敏IFN-I活性的天然產(chǎn)物的聯(lián)用將有望降低IFN-α的使用劑量，從而提高其臨床順應性。因此，接下來探究了18β-甘草次酸與IFNα2合用對3種免疫細胞的影響。如圖3-A所示，在RAW264.7細胞中，IFNα2增強了IFN-I誘導基因和的mRNA表達，與不同劑量的18β-甘草次酸合用后總體呈劑量相關(guān)性的增強：與對照組相比，高劑量的18β-甘草次酸與IFNα2合用后mRNA表達水平顯著升高（＜0.001），中、高劑量的18β-甘草次酸與IFNα2合用后mRNA表達水平顯著升高（＜0.01）。如圖3-B所示，在BMDM中，IFNα2誘導了IFN-I下游和的mRNA表達水平（＜0.01、0.001）；當與不同劑量的18β-甘草次酸合用后，與對照組相比，mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；中、高劑量的18β-甘草次酸與IFNα2合用后mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01）。如圖3-C所示，在BMDC中，IFNα2顯著增加了和的mRNA表達（＜0.01、0.001）；與對照組相比，各劑量的18β-甘草次酸與IFNα2合用后mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；低、中劑量的18β-甘草次酸與IFNα2合用后的mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01）。18β-甘草次酸與IFNα2協(xié)同作用在BMDM和BMDC中均無顯著的劑量相關(guān)性。上述結(jié)果表明，18β-甘草次酸與IFNα2合用能夠增強其激活下游IFN-I誘導基因的作用。由于在RAW264.7細胞中18β-甘草次酸與IFNα2合用作用最強，且呈良好的劑量相關(guān)性，后續(xù)實驗將選擇RAW264.7細胞作為細胞模型探究其作用機制。

圖3 18β-甘草次酸與IFNα2合用對RAW264.7細胞、BMDM和BMDC中Isg15和Ifit1 mRNA表達的影響

3.4 18β-甘草次酸促進JAK1、TYK2與STATs依賴的信號轉(zhuǎn)導

為了確定18β-甘草次酸與IFNα2協(xié)同作用的具體分子靶點，首先探究了IFNα2在RAW264.7細胞中激活下游事件的最佳時間，分別考察了在給予IFNα2后0.5、1、2、4、6 h時，IFN-I下游信號轉(zhuǎn)導關(guān)鍵蛋白JAK1、TYK2與STATs的磷酸化水平。如圖4-A所示，t-JAK1在給予IFNα2后降低，而p-JAK1隨時間持續(xù)增加。與對照組相比，JAK1磷酸化水平隨作用時間而升高，在1 h時具有顯著性差異（＜0.01），并在6 h達到最高點（＜0.001）。IFNα2對t-TYK2無明顯影響，但顯著升高了p-TYK2的水平，在1 h時作用最強（＜0.001）。t-STAT1、p-STAT1、t-STAT2、p-STAT2均在1 h時達到峰值，隨后降低。IFNα2刺激細胞1 h后，與對照組相比，STAT1和STAT2的磷酸化水平均顯著升高（＜0.001）。綜合考慮上述結(jié)果，選擇1 h作為IFNα2的誘導時間。

接下來考察了IFNα2聯(lián)合不同劑量18β-甘草次酸對JAK1、TYK2與STATs磷酸化的影響。如圖4-B所示，IFNα2刺激1 h后，IFNα2增加了JAK1、TYK2、STAT1、STAT2的磷酸化水平（＜0.05、0.001）。與IFNα2相比，低劑量的18β-甘草次酸降低了t-JAK1的水平，低、中劑量的18β-甘草次酸顯著增強了JAK1磷酸化水平（＜0.05、0.001）。不同劑量的18β-甘草次酸均增加了t-TYK2水平，中、高劑量的18β-甘草次酸顯著增強了TYK2的磷酸化水平（＜0.05、0.001）。低劑量18β-甘草次酸增加了t-STAT1、t-STAT2的水平，而中、高劑量18β-甘草次酸降低了t-STAT1、t-STAT2的水平，中、高劑量的18β-甘草次酸顯著升高了STAT1和STAT2的磷酸化水平（＜0.01、0.001）。提示18β-甘草次酸增強了IFNα2誘導的JAK1、TYK2與STATs的激活，促進了IFN-I下游信號轉(zhuǎn)導，是18β-甘草次酸協(xié)同增強IFN-I響應的內(nèi)在機制。

A-IFNα2刺激RAW264.7細胞0.5～6 h，t-JAK1、p-JAK1、t-TYK2、p-TYK2、STATs和p-STATs蛋白表達；B-18β-甘草次酸與IFNα2合用后，t-JAK1、p-JAK1、TYK2、p-TYK2、STATs和p-STATs蛋白表達

3.5 18β-甘草次酸對小鼠肝細胞癌原位移植瘤生長的影響

如圖5-A、B所示，與模型組相比，單用奧沙利鉑改善了肝癌模型小鼠的體質(zhì)量下降，減小了腫瘤體積；如圖5-C所示，單用奧沙利鉑組腫瘤質(zhì)量降低為模型組的1/3（＜0.05），在一定程度上增加了脾臟質(zhì)量，并降低了肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)（＜0.05）。18β-甘草次酸與奧沙利鉑合用后進一步改善了小鼠的體質(zhì)量下降；且腫瘤質(zhì)量僅為奧沙利鉑組的一半（＜0.01），肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)結(jié)果也明顯優(yōu)于奧沙利鉑組（＜0.05、0.01）。此外，協(xié)同給藥后脾質(zhì)量有明顯升高（＜0.05），提示18β-甘草次酸可能增強了機體的免疫反應。因此，18β-甘草次酸可能通過增強腫瘤免疫反應，協(xié)同奧沙利鉑的抗腫瘤活性，抑制小鼠原位肝細胞癌的生長。

O-奧沙利鉑組 與模型組比較：#P＜0.05；與奧沙利鉑組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

4 討論

甘草是我國傳統(tǒng)中藥，有“國老”之稱[21]，其主要活性成分18β-甘草次酸已被證明具有抗感染、消炎[22-23]、保肝[24]、抗腫瘤[25]等多種功效。目前對18β-甘草次酸的藥理作用機制的研究主要集中于Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、mTOR/STAT3等經(jīng)典炎癥通路[26]。IFN-I被認為是慢性炎癥性疾病的樞紐，然而，目前18β-甘草次酸對IFN-I的作用尚不明確。本研究中，18β-甘草次酸單獨使用或與IFNα2合用均能夠增強固有免疫細胞中IFN-I誘導基因的表達，且在合用時作用更強。這一發(fā)現(xiàn)不僅確定了18β-甘草次酸是一種潛在的IFN-I天然激動劑，而且為18β-甘草次酸治療免疫低下相關(guān)疾病的作用機制提供了新的思路。

當前研究認為，18β-甘草次酸通過加重細胞DNA損傷、激活p53促凋亡通路、增加活性氧的形成等途徑誘導肝癌細胞凋亡[27-28]。已有研究證明，固有免疫系統(tǒng)識別腫瘤細胞并激活適應性免疫系統(tǒng)發(fā)揮消殺作用依賴于IFN-I信號的激活[29]。鑒于體外實驗中18β-甘草次酸對IFN-I的免疫調(diào)節(jié)作用及IFN-I的腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用，推測增強IFN-I響應、逆轉(zhuǎn)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境可能是其抗腫瘤的新機制。因此，基于18β-甘草次酸在IFN-I介導的免疫應答中的作用，構(gòu)建小鼠肝癌模型來評價其潛在腫瘤免疫藥理作用?；瘜W誘導肝癌模型和移植肝癌模型是目前最為常用的小鼠肝癌模型，然而，化學誘導法的誘癌時間較長，一般為24～48周[30]；人源腫瘤異種移植操作較為復雜且成本高，且因為缺乏完整的免疫功能而不適用于腫瘤免疫療法研究[31]。因此，本研究通過將鼠源肝癌細胞系Hep1-6細胞的細胞懸液直接注射到小鼠肝大葉建立同種原位移植瘤模型，該模型具有成本相對較低、成活率高、成瘤速度快、具有完整的免疫微環(huán)境和肝微循環(huán)環(huán)境等優(yōu)點。通過與一線化療藥物奧沙利鉑合用，18β-甘草次酸顯著抑制了原位肝癌的惡性生長，并改善了奧沙利鉑毒性相關(guān)的體質(zhì)量下降。一方面，18β-甘草次酸與奧沙利鉑聯(lián)用后可能通過增強IFN-I介導的抗腫瘤免疫提高化療藥物對癌細胞的化學敏感性；另一方面，奧沙利鉑是一類免疫治療藥物，通過誘導腫瘤細胞發(fā)生免疫原性細胞死亡，在細胞表面產(chǎn)生一種“吃我”的信號分子，使得腫瘤細胞更容易被固有免疫細胞識別并吞噬[32-33]，18β-甘草次酸增強IFN-I介導的固有免疫的作用有助于奧沙利鉑誘導抗腫瘤免疫應答。盡管奧沙利鉑已廣泛用于直腸癌、肺癌、肝癌等惡性腫瘤的治療，但是還存在一些不良反應，單獨給藥存在著患者響應率低、可能引起細胞因子風暴等隱患，與其他小分子化療藥的聯(lián)用也產(chǎn)生了患者依從性差、失敗率高等問題[29]。本研究提示，與18β-甘草次酸的聯(lián)合用藥有望改善奧沙利鉑的不良反應，還為IFN-I的天然小分子激動劑與化療藥物聯(lián)用在抗腫瘤中的作用機制提供了新的思路。

綜上所述，本研究證明了18β-甘草次酸能夠顯著激活JAK-STAT信號并誘導IFN-I下游ISGs的表達，同時闡明了18β-甘草次酸與奧沙利鉑協(xié)同激活腫瘤免疫從而抑制肝癌生長的作用。這些發(fā)現(xiàn)不僅為全面理解18β-甘草次酸的免疫調(diào)節(jié)作用提供了新的見解，并且為18β-甘草次酸與具有腫瘤細胞免疫原性的化療藥物聯(lián)用的抗腫瘤新策略研究提供了實驗證據(jù)和新的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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18β-Glycyrrhetinic acid enhances response of type I interferon in innate immune cells and inhibits hepatocellular carcinoma growth

LI Shuo, BAI Jin-zhao, LIU Run-ping

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To identify the regulative effects of 18β-glycyrrhetinic acid (18β-Ga) on type I interferon (IFN-I) responses in innate immune cells, and evaluate its antitumor effects in hepatocellular carcinoma (HCC) model mice.CCK-8 assay was performed to detect the effect of 18β-Ga on proliferation of RAW264.7 cells. qRT-PCR was used to detect the effect of 18β-glycyrrhetinic acid on interferon beta 1 (), interferon stimulated gene 15 () and interferon-induced protein 1 () mRNA expressions in immune cells [RAW264.7 cells, mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM), mouse bone marrow-derived dendritic cells (BMDC)]. qRT-PCR analysis was used to detect the mRNA levels ofandupon 18β-Ga and IFNα2 administration in immune cells. The phosphorylation levels of Janus kinase 1 (JAK1), tyrosine kinase 2 (TYK2), signal transducers and activators of transcription 1 (STAT1) and STAT2 were detected by western blotting. Hepatocellular carcinoma model was established by orthotopic tumor transplantation, and model mice were randomly divided into model group, oxaliplatin group, oxaliplatin + 18β-Ga group. Mice were treated with oxaliplatin and 18β-Ga after modeling. Body weight, tumor weight, spleen weight, liver weight and liver coefficient were evaluated.18β-Ga significantly increased the mRNA levels of,andexpression (< 0.05, 0.01, 0.001) and facilidated IFNα2-inducedandexpressions (< 0.05, 0.01, 0.001). IFN-I-promoting activity of 18β-Ga may depend on the enhancement of JAK1, TYK, STAT1, and STAT2 phosphorylation (< 0.05, 0.01, 0.001). The combination of 18β-Ga and oxaliplatin significantly inhibited the tumor growth of hepatocellular carcinoma orthotopic xenograft tumors in mice (< 0.01), and improved the weight loss associated with oxaliplatin toxicity.18β-Ga has significant stimulatory effects on immune response by enhancing JAK-STAT signaling and inducing the ISGs expression in response to IFN-I. Meanwhile, 18β-Ga can synergistically inhibit the growth of liver cancer with oxaliplatin, thereby activating tumor immunity.

18β-glycyrrhetinic acid; type I interferon; macrophage; dendritic cell; hepatocellular carcinoma; immunoregulation

R285.5

A

0253 - 2670(2022)16 - 5034 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.013

2022-05-25

國家自然科學基金資助項目（82004029）；北京市科技新星項目（Z201100006820025，Z211100002121167）；中華中醫(yī)藥學會青年人才托舉工程（CACM-2020-QNRC2-04）

李 碩，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物的免疫活性。E-mail: ls18845611672@163.com

劉閏平，教授，博士生導師，研究方向為消化系統(tǒng)疾病機制和潛在治療靶點的轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究。E-mail: liurunping@bucm.edu.cn

#共同第一作者：白金釗，碩士研究生，研究方向為中藥消化藥理。E-mail:baijz@foxmail.com

[責任編輯 李亞楠]