麥琬婷，鐘華帥，蘇曉丹，陸建媚，覃裕翠，黃秋潔，葉 勇, 3*

Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化蛇葡萄素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體處方工藝及體外評(píng)價(jià)

麥琬婷1, 4，鐘華帥1#，蘇曉丹1，陸建媚1，覃裕翠1，黃秋潔2*，葉 勇1, 3*

1. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001 3. 廣西生物活性分子研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021 4. 貴港市人民醫(yī)院，廣西 貴港 537100

目的 優(yōu)化蛇葡萄素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（ampelopsin loaded nanostructured lipid carriers，AMP-NLC）處方并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量表征，研究其對(duì)SMMC-7721細(xì)胞抑制作用和攝取情況。采用有機(jī)溶劑蒸發(fā)法制備AMP-NLC，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化AMP-NLC處方并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量表征。用MTT法測(cè)定SMMC-7721細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration of 50%，IC50），并用羅丹明B染料觀察其攝取情況。最優(yōu)處方為山崳酸甘油酯與中鏈三酰甘油的比例為1∶11.5、藥脂比為1∶10.5、蛋黃卵磷脂用量為21 mg和P188的用量為2%，所制AMP-NLC的平均包封率為（81.71±1.76）%、平均載藥量為（3.86±0.22）%、平均粒徑為（156.50±7.11）nm和平均ζ電位為（?11.00±0.95）mV，體外釋藥過程符合一級(jí)釋放模型＝47.93(1－e?0.625 2 t)，蛇葡萄素和AMP-NLC對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的IC50分別為44.51、41.51 μg/mL，且相對(duì)蛇葡萄素原料藥，SMMC-7721細(xì)胞對(duì)AMP-NLC有較好攝取。Box-Behnken響應(yīng)面法所建立的模型可用于AMP-NLC處方優(yōu)化，AMP-NLC能有效提高蛇葡萄素在SMMC-7721細(xì)胞的相對(duì)攝取。

蛇葡萄素；Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體；質(zhì)量評(píng)價(jià)；細(xì)胞攝?。惑w外靶向性

蛇葡萄素（ampelopsin），又名二氫楊梅素，是一種重要的黃酮類化合物，廣泛存在于葡萄科、楊梅科、杜鵑科、藤黃科、大戟科及柳科等植物中，其中以葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄(Hand. -Mazz.) W. T. Wang中含量最為豐富，高達(dá)37.4%～38.5%[1-2]。在廣西顯齒蛇葡萄又稱甜茶藤，壯藥名為“茶完”，目前收載在《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（第一卷）[3]。作為一種壯族民間保肝的特效藥材，甜茶藤常用于治療黃疸性肝炎和感冒風(fēng)熱等癥。研究表明，蛇葡萄素具有顯著的抗肝癌[4]、抗氧化[5]、抗菌[6]、抗炎[7-8]和骨重塑[9]等作用。但是，由于其水溶性低、黏膜滲透性差和體內(nèi)穩(wěn)定性不佳等原因，導(dǎo)致其體內(nèi)的生物利用度很低[10-11]，從而限制了其臨床應(yīng)用。因此，需借助現(xiàn)代制劑技術(shù)改善蛇葡萄素體內(nèi)吸收及穩(wěn)定性差的問題。文獻(xiàn)報(bào)道的二氫楊梅素長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體包封率只有約54%[12]，且穩(wěn)定性和緩釋性不夠理想。郜娜等[13]制備了二氫楊梅素磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，需先制備磷脂復(fù)合物，工藝較為繁瑣，且制備過程中使用的四氫呋喃、石油醚等具有一定毒性的溶劑，此外所得包封率不高（低于80%）。黃娟等[14]制備了二氫楊梅素固體自微乳，但處方中主要含有無機(jī)材料二氧化硅，其體內(nèi)安全性問題尚需深入研究[15]，因此，其應(yīng)用具有一定局限性。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carrier，NLC）是新一代脂質(zhì)納米粒，通過加入液態(tài)脂質(zhì)，擾亂固體脂質(zhì)規(guī)則的晶格結(jié)構(gòu)，增加晶體的混亂度，為藥物的包載創(chuàng)造了更大空間，可大幅提高藥物的包封率及載藥量[16-17]。此外，NLC還能進(jìn)一步延緩藥物釋放、增加藥物透膜性及提高藥物穩(wěn)定性，是一種理想的納米藥物靶向載體[18]。因此，本課題擬采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)蛇葡萄素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（ampelopsin loaded nanostructured lipid carriers，AMP-NLC）的處方進(jìn)行優(yōu)化，并研究其質(zhì)量表征及體外細(xì)胞的攝取情況，以期為后續(xù)體內(nèi)抗肝癌藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)等研究奠定基礎(chǔ)，也為壯藥甜茶藤中蛇葡萄素的新制劑研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；HH-2型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；SU8100型掃描電子顯微鏡（SEM）、H-7650型透射電子顯微鏡（TEM），日本Htachi公司；SmartLab-9kW型轉(zhuǎn)靶X-射線粉末衍射儀（XRD），日本理學(xué)株式會(huì)社；Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀，英國馬爾文公司；XS205DU型分析天平，梅特勒托利多集團(tuán)；DSC1型差式掃描量熱儀（DSC），瑞士梅特勒托利多公司；Eppendorf5810R型冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；Nicolet is 20型傅里葉紅外光譜儀（FT-IR），賽默飛世爾科技公司；Aynergy H1型酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；德國徠卡DMi8型倒置熒光顯微鏡，德國徠卡公司。

1.2 試藥與試劑

蛇葡萄素對(duì)照品，批號(hào)Q-006-181218，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司；色譜純乙腈，賽默飛世爾科技公司，批號(hào)F21LB8201；伯洛沙姆188（P188），德國BASF有限公司，批號(hào)GNC33221B；山崳酸甘油酯，江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司，批號(hào)20201001；中鏈三酰甘油，Croda Singapore Pte Ltd.，批號(hào)627884；Lipoid E80SN，Lipoid GmbH，批號(hào)512100-2190153；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司，批號(hào)8121372；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），美國Gemini公司，批號(hào)A61H74L；青鏈霉素混合液（批號(hào)20210818）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)20211124）、四甲基偶氮唑鹽［3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT，批號(hào)715F0527］、Hoechst33342（批號(hào)1118IO35），索萊寶生物科技有限公司；DMSO，批號(hào)20200401，天津市大茂化學(xué)試劑廠；羅丹明B（rhodamine B，RhB），批號(hào)C10472170，默克試劑公司。

1.3 細(xì)胞

SMMC-7721細(xì)胞均購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

2 方法與結(jié)果

2.1 AMP-NLC的制備

精密稱取處方量的山崳酸甘油酯、中鏈三酰甘油、卵磷脂、蛇葡萄素和無水乙醇，置于20 mL燒杯中，作為油相；另取處方量的2% P188于20 mL燒杯中，作為水相。待油相完全溶解后，將油相加入到同溫度的水相中，用恒溫磁力攪拌器在65 ℃條件下攪拌60 min，使其充分乳化，過0.22 μm微孔濾膜，即得AMP-NLC，4 ℃保存。

同法制備不含蛇葡萄素的空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（blank loaded nanostructured lipid carriers，B-NLC）和含羅丹明B的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（rhodamine loaded nanostructured lipid carriers，RhB-NLC）。

2.2 蛇葡萄素的測(cè)定

2.2.1 溶液的配制 精密稱取蛇葡萄素對(duì)照品5 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得200 μg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為日本GL Sciences C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸三乙胺溶液（25∶75）；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)291 nm；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，經(jīng)考察輔料對(duì)檢測(cè)無影響，結(jié)果見圖1。

2.2.3 精密度考察

（1）日內(nèi)精密度：取10、50、100 μg/mL蛇葡萄素對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，1 d連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果表明，低、中、高質(zhì)量濃度蛇葡萄素對(duì)照品溶液的RSD分別為1.89%、1.55%、1.08%，表明日內(nèi)精密度較好。

圖1 蛇葡萄素對(duì)照品(A)、B-NLC樣品 (B)和AMP-NLC樣品 (C)的HPLC圖

（2）日間精密度：取10、50、100 μg/mL蛇葡萄素對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 d，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果表明，低、中、高質(zhì)量濃度蛇葡萄素對(duì)照品溶液的RSD分別為3.13%、3.59%、4.33%，表明日間精密度較好。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下200 μg/mL蛇葡萄素對(duì)照品溶液，分別配制成5、10、25、50、100、200 μg/mL的蛇葡萄素對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（），以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得蛇葡萄素線性回歸方程＝48.959－27.274，＝0.999 8，表明蛇葡萄素在5～200 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.2.5 準(zhǔn)確度考察

（1）方法回收率：配制25、65、85 μg/mL的蛇葡萄素甲醇溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算得實(shí)際測(cè)定質(zhì)量濃度，計(jì)算方法回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法回收率分別為108.92%、85.76%、108.86%，RSD為2.48%、2.48%、0.99%，均符合要求。

（2）加樣回收率：按處方量的80%、100%、120%稱取蛇葡萄素原料藥適量，分別加入處方量的各個(gè)輔料，加入甲醇超聲溶解并定容，搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為10、50、100 μg/mL，平行3次，共9份，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加樣回收率分別為99.01%、103.11%、105.63%，RSD為3.32%、1.19%、1.74%，均符合要求。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.4”項(xiàng)方法平行制備6份蛇葡萄素對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算蛇葡萄素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD。結(jié)果表明，RSD為2.77%，表明重復(fù)性好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將蛇葡萄素對(duì)照品溶液稀釋至8、50、100 μg/mL，分別于0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD，觀察12 h內(nèi)穩(wěn)定情況，結(jié)果表明，RSD分別為4.43%、1.08%、1.19%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 AMP-NLC包封率和載藥量的測(cè)定

采用超濾離心法測(cè)定包封率和載藥量，精密量取一定量的AMP-NLC加入6倍量的40%乙醇，置10 000截留相對(duì)分子質(zhì)量的離心超濾管內(nèi)管中，于10 000 r/min離心（離心半徑7.5 cm）30 min，過0.22 μm微孔濾膜，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算游離蛇葡萄素的含量。另取等量的AMP-NLC置于5 mL量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容至刻度，過0.22 μm微孔濾膜，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算總蛇葡萄素的含量，按照公式（1）、（2）計(jì)算包封率和載藥量。

包封率＝(2－1)/2（1）

載藥量＝(2－1)/(2＋3) （2）

1為游離藥物的量，2為系統(tǒng)中藥物的總量，3為系統(tǒng)中輔料的量

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 固態(tài)脂質(zhì)種類的考察 改變固態(tài)脂質(zhì)種類，其他條件不變，固態(tài)脂質(zhì)種類分別為單硬脂酸甘油酯和山崳酸甘油酯，按“2.1”項(xiàng)下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，使用單硬脂酸甘油酯和山崳酸甘油酯的包封率分別為59.77%和84.34%，載藥量分別為2.36%和2.38%，即選擇崳酸甘油酯做固態(tài)脂質(zhì)。

2.4.2 液態(tài)脂質(zhì)種類的考察 改變液態(tài)脂質(zhì)種類，其他條件不變，液態(tài)脂質(zhì)種類分別為中鏈三酰甘油、油酸和大豆油，按“2.1”項(xiàng)下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，使用中鏈三酰甘油，油酸和大豆油的包封率分別為76.90%、50.22%、56.06%，載藥量分別為2.05%、0.19%、1.33%，即選擇中鏈三酰甘油做液態(tài)脂質(zhì)。

2.4.3 固態(tài)脂質(zhì)與液態(tài)脂質(zhì)質(zhì)量比（固液脂質(zhì)比）的考察 改變固液脂質(zhì)比，其他條件不變，固定脂質(zhì)材料總量，固液脂質(zhì)比分別為1∶0.1、1∶2.3、1∶4.6、1∶6.9、1∶9.2、1∶11.5、1∶13.8、1∶16.1，按“2.1”項(xiàng)下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，包封率分別為68.19%、72.39%、70.40%、75.47%、84.45%、94.52%、93.00%、82.76%，載藥量分別為0.94%、1.17%、1.46%、1.07%、1.44%、6.03%、5.83%、6.03%。不同固液脂質(zhì)比1∶0.1～1∶16.1，包封率呈先增大后減小的趨勢(shì)，而載藥量呈逐漸增大的趨勢(shì)，有可能是液態(tài)脂質(zhì)較多時(shí)有利于蛇葡萄素的溶解在輔料中，使得載藥量在6%左右。該因素影響顯著，選擇固液脂質(zhì)比1∶0.1～1∶11.5做后續(xù)研究。

2.4.4 蛇葡萄素和總脂質(zhì)比例（藥脂比）的考察 改變脂藥比，其他條件不變，固定脂質(zhì)材料總量，藥脂比分別為1∶2.5、1∶5.0、1∶7.5、1∶10.0、1∶12.5、1∶15.0，按“2.1”項(xiàng)下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，包封率分別為76.84%、90.12%、84.56%、97.33%、78.04%、73.97%，載藥量分別為5.54%、4.54%、3.69%、3.10%、3.51%。蛇葡萄素投藥量越高載藥量越高，但過高的投藥量，制備NLC后有大量蛇葡萄素析出，影響包封率和載藥量。該因素影響顯著，選擇藥脂比1∶2.5～1∶7.5做后續(xù)研究。

2.4.5 蛋黃卵磷脂用量的考察 改變蛋黃卵磷脂用量，其他條件不變，蛋黃卵磷脂用量分別為18、21、24、27、30 mg，按“2.1”項(xiàng)下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，包封率分別為79.03%、97.40%、89.03%、80.80%、79.60%，載藥量分別為5.54%、4.54%、3.69%、3.10%、3.51%。隨著卵磷脂的用量逐漸增大，包封率呈先增大后減小的趨勢(shì)，載藥呈減小趨勢(shì)，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)磷脂在NLC中只是起到了助乳化劑的作用，因而其用量到達(dá)一定范圍內(nèi)合適即可。該因素影響顯著，優(yōu)先考慮高包封率，選擇卵磷脂的用量21～30 mg做后續(xù)研究。

2.4.6 P188用量的考察 改變P188用量，其他條件不變，P188的用量分別為0.1%、0.6%、1.0%、2.0%，按“2.1”項(xiàng)下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，包封率分別為55.28%、81.41%、95.72%、96.92%，載藥量分別為1.45%、3.45%、2.50%、2.44%。隨著P188用量越多，包封率逐漸增大，但是在用于制備注射劑時(shí)，其用量不能太高，所以選擇P188用量為2%。

2.4.7 有機(jī)相和水相體積比例的考察 改變有機(jī)相和水相比例其他條件不變，有機(jī)相和水相體積比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，按“2.1”項(xiàng)下方法制備AMP-NLC，以包封率和載藥量為指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，包封率分別為79.71%、73.31%、91.50%、86.97%，載藥量分別為1.14%、2.62%、2.70%、2.71%。選擇相體積比為1∶3，其能充分溶解脂質(zhì)相和藥物，有利于NLC的制備。

2.5 基于Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)NLC包封率影響較大的因素作為實(shí)驗(yàn)因素，選擇蛋黃卵磷脂用量（1）、藥脂比（2）和固液脂質(zhì)比（3）做響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)化，3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 1 Design and results of response surface experimental

試驗(yàn)號(hào)X1/mgX2X3Y1/%Y2/%Y3/nmY4/mVOD值 125.5 (0)1∶7.5 (0)1∶5.8 (0)60.851.71344.0?10.070.64 225.5 (0)1∶7.5 (0)1∶5.8 (0)59.981.74332.6?4.840.75 325.5 (0)1∶2.5 (?1)1∶11.5 (+1)65.004.301 679.3?6.770.00 430 (+1)1∶12.5 (+1)1∶5.8 (0)89.201.54259.6?11.970.65 525.5 (0)1∶12.5 (+1)1∶11.5 (+1)57.112.00200.4?9.750.91 621 (?1)1∶12.5 (+1)1∶5.8 (0)59.531.22257.9?16.830.54 730 (+1)1∶2.5 (?1)1∶5.8 (0)50.933.401 355.7?13.230.46 821 (?1)1∶7.5 (0)1∶11.5 (+1)97.553.73286.0?6.930.98 925.5 (0)1∶2.5 (?1)1∶0.1 (?1)48.972.00331.7?7.920.75 1025.5 (0)1∶7.5 (0)1∶5.8 (0)80.992.24365.5?7.580.70 1125.5 (0)1∶7.5 (0)1∶5.8 (0)71.192.07136.1?8.580.83 1230 (+1)1∶7.5 (0)1∶11.5 (+1)64.144.50556.2?6.770.57 1325.5 (0)1∶7.5 (0)1∶5.8 (0)54.552.01169.4?9.680.84 1421 (?1)1∶2.5 (?1)1∶5.8 (0)81.771.00181.0?6.250.95 1530 (+1)1∶7.5 (0)1∶0.1 (?1)74.002.40135.7?7.620.83 1621 (?1)1∶7.5 (0)1∶0.1 (?1)55.481.51184.6?5.790.74 1725.5 (0)1∶12.5 (+1)1∶0.1 (?1)63.960.92107.8?8.590.00

2.5.1 總評(píng)歸一法 若單以包封率（1）、載藥量（2）、粒徑（3）或ζ電位（4）為評(píng)定指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)優(yōu)選的條件可能會(huì)相互矛盾，因此，實(shí)驗(yàn)中常引入歸一化綜合值（outside diameter，OD值），來考察指標(biāo)的綜合效果。根據(jù)Hassan方法[19]對(duì)各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理，對(duì)于欲達(dá)到最大化的指標(biāo)，如包封率、載藥量，計(jì)算方式為公式（3）；對(duì)于欲達(dá)到最小化的指標(biāo)，如粒徑，計(jì)算方式為公式（4），OD值計(jì)算為公式（5）。由于各條件對(duì)PDI影響不顯著，所以未選取其作為響應(yīng)值，得到的數(shù)據(jù)和結(jié)果如表1所示。

dmax＝(Y－min)/(max－min) （3）

dmin＝(max－Y)/(max－min) （4）

OD＝(d)1/n（5）

Y為實(shí)際測(cè)量值，max和min分別為各指標(biāo)可接受的最大值和最小值

對(duì)于公式（3），當(dāng)試驗(yàn)中某指標(biāo)等于或超過max將設(shè)為1，反之小于min則設(shè)為0；對(duì)于公式（4），當(dāng)試驗(yàn)中某指標(biāo)等于或超過max將設(shè)為0，反之小于或等于min則設(shè)為1。

根據(jù)《中國藥典》2020年版要求包封率作為微粒給藥系統(tǒng)的主要指標(biāo)其限度不低于80%，靜脈用乳狀液型注射液中90%的乳滴粒徑應(yīng)在1 μm以下，除另有規(guī)定外，不得有大于5 μm的乳滴，確定納米粒最優(yōu)處方粒徑范圍為250 nm以下，根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果確定載藥量范圍為2%～10%。

2.5.2 2次回歸模型的建立 采用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)1、2、3、4和OD值與1、2和3進(jìn)行多元2項(xiàng)式方程擬合。擬合方程2均大于0.8，表明模型擬合程度較好；方差分析結(jié)果見表2，模型＜0.05，具有顯著性差異，失擬項(xiàng)＞0.05，表明失擬不顯著。擬合方程分別為1＝400.29－26.041－6.292＋1.533＋0.3412－0.05113－0.0123＋0.4612－0.0522，2＝0.814 5，＝0.025 7；2＝2.677 761－0.411 952－0.000 063－0.011 5612－0.000 0113－0.000 0523＋0.013 9912－0.000 0422＋0.000 0232，2＝0.956 2，＝0.000 6；3＝?2 339.45＋118.531＋84.452＋3.113－6.5212＋0.3113＋0.5523＋2.6522＋0.0132，2＝0.893 0，＝0.003 5；4＝?8.15－0.471－1.622－0.0373＋2.9612－0.5013－0.5823－1.2212－2.722＋2.5932，2＝0.850 6，＝0.031 3；OD＝5.924 31－0.364 971－0.057 692－0.000 563＋0.000 3312－0.000 0513＋0.000 0723＋0.000 6312－0.000 2322－0.000 00332，2＝0.959 4，＝0.000 4。以O(shè)D值為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)交互關(guān)系的響應(yīng)面2D和3D效果圖見圖2。

表2 方差分析結(jié)果(OD值)

Table 2 ANOVA results (OD value)

誤差來源自由度離均差平方和F值P值誤差來源自由度離均差平方和F值P值 模型91.2518.370.000 4X1210.079.250.018 8 X110.068.250.023 9X2210.2330.410.000 9 X210.000.070.805 0X3210.056.080.043 0 X310.000.260.623 5殘差70.053 X1X210.0911.830.010 8擬失項(xiàng)30.0220.920.508 3 X1X310.068.450.022 8純誤差40.031 X2X310.6991.65＜0.000 1總誤差161.30

圖2 因素間交互作用的響應(yīng)面2D圖和3D圖(OD值)

2.5.3 最優(yōu)處方的驗(yàn)證 根據(jù)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，最終優(yōu)化后處方為固液脂質(zhì)比（山崳酸甘油酯與中鏈三酰甘油的比例）為1∶11.5，藥脂比為1∶10.5，蛋黃卵磷脂用量為21 mg，P188的用量為2%，計(jì)算軟件預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的相對(duì)偏差計(jì)算為公式（6），結(jié)果如表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除載藥量和OD值外，包封率、粒徑和ζ電位的偏差均在±10%左右，可能是在制備過程中，使用的磁力攪拌器雖然都調(diào)節(jié)到同一位置，但是其攪拌速度還是有一定偏差；此外，水浴鍋70 ℃溫度并不能保持恒定，溫度有一定變化會(huì)影響AMP-NLC制備。

相對(duì)偏差＝|預(yù)測(cè)值－實(shí)測(cè)值|/預(yù)測(cè)值 （6）

2.6 質(zhì)量表征

2.6.1 粒徑和ζ電位的測(cè)定 取AMP-NLC稀釋至20倍，于馬爾文粒度儀測(cè)定其粒徑為（156.50±7.11）nm、ζ電位為（?11.00±0.95）mV，結(jié)果見圖3-A、B。

2.6.2 DSC分析 取蛇葡萄素粉末、AMP-NLC和NLC凍干粉末進(jìn)行DSC測(cè)定，DSC掃描條件為氮?dú)?，掃描溫?0～300 ℃，升溫速率10 ℃/min，氣體體積流量50 mL/min，結(jié)果見圖4。吸熱谷是蛇葡萄素的熔化過程、而放熱峰是蛇葡萄素的晶化過程，從這些熱動(dòng)力學(xué)中計(jì)算熔融焓（Δfusion）和結(jié)晶焓（Δcryst）。DSC熱譜圖中，蛇葡萄素的熔點(diǎn)為248.5 ℃（Δfusion＝91.89 J/g），此外，DSC熱譜圖出現(xiàn)3個(gè)吸熱峰和1個(gè)放熱峰，和文獻(xiàn)報(bào)道[20]比對(duì)，前2個(gè)吸熱峰分別為93.17 ℃（Δfusion＝80.38 J/g）和141.5 ℃（Δfusion＝23.80 J/g），有可能是2次脫水導(dǎo)致。制備成NLC以后，蛇葡萄素的248.5 ℃尖銳峰消失，按照相關(guān)文獻(xiàn)[21]推測(cè)有可能是藥物被完全包裹在基質(zhì)中呈無定型，且表面無藥物粒子存在，表明蛇葡萄素包裹在NLC里。

2.6.3 XRD分析 取蛇葡萄素粉末、AMP-NLC和NLC凍干粉末進(jìn)行XRD測(cè)定，測(cè)定條件：Cu Kα輻射（0.154 056 nm），掃描范圍5°～45°，掃描速率5°/min，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，蛇葡萄素自身有很多衍射峰，而制備成NLC后，只形成了2個(gè)獨(dú)特的衍射峰，分別是23.16°和19.03°，其形成一定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。這與DSC結(jié)果一致，說明蛇葡萄素大多是以無定型狀態(tài)被包裹于制劑中。

表3 最優(yōu)處方的驗(yàn)證

Table 3 Validation of optimal prescription

參數(shù)包封率/%載藥量/%粒徑/nmζ電位/mVOD值 實(shí)測(cè)值81.71±1.763.86±0.22156.50±7.11?11.00±0.950.88±0.03 預(yù)測(cè)值82.733.11174.99?10.511.08 相對(duì)偏差/%1.2324.2210.564.6618.51

圖3 AMP-NLC的粒徑分布(A) 和ζ電位(B)

圖4 AMP-NLC的DSC圖

2.6.4 FT-IR的測(cè)定 取蛇葡萄素粉末、AMP- NLC、NLC凍干粉末、蛇葡萄素粉末與NLC凍干粉末的物理混合物適量分別與100 mg溴化鉀基質(zhì)混合研磨，10 MPa下壓成薄片，置于紅外光譜儀下掃描，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，制備成AMP-NLC后蛇葡萄素的特征峰1640 cm?1（C＝O）消失，表明成功將蛇葡萄素包裹在NLC中，形成AMP-NLC。

2.6.5 TEM和SEM形態(tài)觀察 取新制備的AMP- NLC用水適當(dāng)稀釋，取少許滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸染色，晾干后，用TEM下觀察并拍照，結(jié)果見圖7-A。取一定量?jī)龈葾MP-NLC粉末于真空條件下噴金后置于SEM下觀察，結(jié)果見圖7-B。結(jié)果表明，制備成AMP-NLC成類球形，粒徑在150 nm左右。

圖5 AMP-NLC的XRD圖

圖6 AMP-NLC的FT-IR圖

2.6.6 體外釋藥特性研究 取AMP-NLC 1 mL放入活化的透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量8×106～1×107）中，兩端扎緊，置于10 mL的pH為5.0的PBS釋放介質(zhì)中，于（37.0±0.5）℃恒溫振蕩器中，分別在0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0、48.0、72.0 h取1 mL釋放液，并補(bǔ)充等量等溫的釋放介質(zhì)。取出的釋放液補(bǔ)加0.5 mL甲醇混勻，再過0.22 μm濾膜，按“2.2.2”下方法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)數(shù)累積釋放率，繪制釋放曲線見圖8，并進(jìn)行釋藥數(shù)學(xué)模型擬合，擬合結(jié)果見表4。結(jié)果表明，經(jīng)制備成NLC，0.5 h內(nèi)不存在突釋，且在12 h內(nèi)成緩釋作用，12 h釋放率達(dá)45%。此外，蛇葡萄素和AMP-NLC在一級(jí)和Riger-Peppas釋放模型中擬合度均很高，2均達(dá)到0.80以上，經(jīng)過制備成NLC，未改變其釋放模式，但在體外釋放呈緩慢釋放，表明經(jīng)制備成AMP-NLC，能起到緩釋作用。板，2000個(gè)/孔，每孔100 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2待貼壁。貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入用無血清培養(yǎng)基配制的質(zhì)量濃度為10、20、40、80、100 μg/mL蛇葡萄素和AMP-NLC，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h后，棄去藥液，加入MTT工作液（5 mg/mL）100 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，后加入100 μL DMSO，于490 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration of 50%，IC50）。結(jié)果表明，蛇葡萄素和AMP-NLC的IC50分別為44.51、41.51 μg/mL。

圖7 AMP-NLC的TEM (A) 和SEM (B) 圖

2.6.7 MTT試驗(yàn) 將SMMC-7721細(xì)胞接種于96孔

圖8 蛇葡萄素和AMP-NLC體外釋放曲線(, n = 3)

表4 蛇葡萄素和AMP-NLC的釋藥模型擬合方程

Table 4 Drug release model fitting equations of AMP and AMP-NLC

藥物方程擬合方程 蛇葡萄素零級(jí)方程Q＝1.582 3 t，R2＝0.322 3 一級(jí)方程Q＝70.51(1－e?2.59 t)，R2＝0.988 0 Riger-Peppas方程Q＝64.00 t0.035 4，R2＝0.959 8 AMP-NLC零級(jí)方程Q＝1.10 t，R2＝0.455 3 一級(jí)方程Q＝47.93 (1－e?0.625 2 t)，R2＝0.948 2 Riger-Peppas方程Q＝29.43 t0.157 3，R2＝0.903 0

2.6.8 攝取情況考察 將SMMC-7721細(xì)胞接種于12孔板，10 000個(gè)/孔，每孔500 μL，以RhB作為對(duì)照，給藥組為RhB-NLC置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育12、24 h后，棄去藥液，用預(yù)冷PBS洗2次，加入Hoechst33342染料染色30 min，再用預(yù)冷PBS洗2次，于倒置熒光顯微鏡下觀察攝取情況（圖9）。結(jié)果表明，RhB-NLC在SMMC-7721細(xì)胞中熒光強(qiáng)度高于RhB組，表明NLC對(duì)SMMC-7721細(xì)胞有一定被動(dòng)攝取作用。

3 討論

蛇葡萄素作為一種具有生物活性的重要天然黃酮類成分，近年來受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。然而，較低的水溶性和膜滲透性使其成藥性不佳，很大程度上限制了蛇葡萄素口服制劑的研發(fā)。注射給藥也因藥物穩(wěn)定性差而具有一定局限性。在本研究中，設(shè)計(jì)了一種新型納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體來研究其在提高藥物成藥性能以及對(duì)體外細(xì)胞攝取的影響。

NLC能使難溶性藥物的溶解度增加，且提高藥物的包封率和載藥量[22-23]。在初步試驗(yàn)中，選擇了幾種常用的液態(tài)脂質(zhì)進(jìn)行溶解度篩選。研究結(jié)果表明蛇葡萄素在中鏈三酰甘油中的溶解度最高，且制備的NLC包封率最高，而油酸對(duì)于屬于酸性藥物的蛇葡萄素來說，并不適合用其制備成NLC，文獻(xiàn)報(bào)道堿性藥物吳茱萸堿[24]使用油酸制備NLC的效果更為理想。因此，最終選擇中鏈三酰甘油用于制備AMP-NLC。山崳酸甘油酯比高熔點(diǎn)脂類單硬脂酸甘油酯具有更適合的親水親油平衡值（hydrophile lipophilic balance，HLB），使它更容易負(fù)載水微溶性的蛇葡萄素。山崳酸甘油酯制備的AMP-NLC比其他固態(tài)脂質(zhì)制備的NLC包封率更高且更穩(wěn)定。NLC中液體脂質(zhì)和固體脂質(zhì)的組合比例至關(guān)重要，蛋黃卵磷脂可作為一種助溶劑，隨著其用量越大，包封率逐漸降低，故選擇最大為30 mg蛋黃卵磷脂進(jìn)行優(yōu)化。P188作為一種表面活性劑，用量越大，包封率和載藥量也不斷增加，但是用于iv時(shí)，其用量是有一定要求，故選擇最大為2%進(jìn)行優(yōu)化。蛇葡萄素微溶于水，具有中等的油水分配系數(shù)，這些特性使得蛇葡萄素與常用液體油相的兼容性較差。在選擇輔料的基礎(chǔ)上，制備的AMP-NLC在一定程度上提高了蛇葡萄素的包封率和載藥量。

圖9 SMMC-7721對(duì)RhB-NLC的攝取情況

NLC結(jié)構(gòu)可分為3種：缺陷型、無定型和多層結(jié)構(gòu)型。較高濃度的液態(tài)脂質(zhì)會(huì)產(chǎn)生無定型結(jié)構(gòu)，在這種結(jié)構(gòu)中，α-型到β-型的結(jié)晶過程不會(huì)發(fā)生，從而防止藥物在儲(chǔ)存期間釋放[25]，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，所制備的AMP-NLC應(yīng)屬于無定型。目前，尚未有蛇葡萄直接制備成NLC，但有郜娜等[13]研究先將其制備成磷脂復(fù)合物再制備成NLC，相對(duì)其制備步驟，本工藝更為簡(jiǎn)捷，且優(yōu)化的AMP-NLC粒徑更小，包封率更高（達(dá)到80%以上），因此推測(cè)該制劑可能更有利于iv給藥。XRD表征表明，經(jīng)過制備成AMP-NLC，蛇葡萄素自身的衍射信號(hào)消失，在19°和23°產(chǎn)生新的衍射峰，表明AMP-NLC經(jīng)過凍干后形成了新的晶型。在TEM下可觀察到AMP-NLC呈球形或類球形分布，粒徑約為100 nm，且外層有一層脂質(zhì)層包裹，有可能是中鏈三酰甘油、蛋黃卵磷脂和山崳酸甘油酯形成一層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)在外層。此外，AMP-NLC的Riger-Peppas釋藥模型擬合度較高，參考同為Riger-Peppas釋放模型的溫敏型納米凝膠[26]，蛇葡萄素可能被脂質(zhì)包裹，藥物可能經(jīng)過這層脂質(zhì)中釋放，再經(jīng)過外層中擴(kuò)散滲透，則釋放變得緩慢。

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方工藝，成功地制備了AMP-NLC，對(duì)其進(jìn)行包封率及載藥量、粒徑及Zeta電位、電鏡形態(tài)、DSC、XRD、IR及體外釋放度等質(zhì)量表征，用MTT法研究了其對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用，與原料藥相比，AMP-NLC對(duì)SMMC-7721細(xì)胞具有更高的抑制活性，并評(píng)估了SMMC-7721細(xì)胞攝取的能力。相對(duì)來說，本研究所設(shè)計(jì)制備的AMP-NLC具有顯著的緩釋效應(yīng)和較高的穩(wěn)定性，AMP-NLC制備工藝更為簡(jiǎn)單，包封率及載藥量更高、粒徑更小，從而利于體內(nèi)注射給藥。AMP-NLC顯著改善了SMMC-7721細(xì)胞對(duì)蛇葡萄素的體外攝取，從而增強(qiáng)了對(duì)SMMC-7721的抑制作用。上述研究結(jié)果表明納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體是一種適合蛇葡萄素注射給藥的理想納米遞藥載體，為AMP-NLC后續(xù)的體內(nèi)藥效學(xué)、靶向性及藥動(dòng)學(xué)等研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為壯藥甜茶藤中蛇葡萄素的新制劑研發(fā)提供了有益的探索。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Formulation optimization of ampelopsin nanostructured lipid carriers by Box-Behnken response surface method andevaluation

MAI Wan-ting1, 4, ZHONG Hua-shuai1, SU Xiao-dan1, LU Jian-mei1, QIN Yu-cui1, HUANG Qiu-jie2, YE Yong1, 3

1.Pharmaceutical College, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China 2. Pharmaceutical College, Guangxi University of Chinese medicine, Nanning 530001, China 3. Guangxi Key Laboratory of Bioactive Molecules Research and Evaluation, Nanning 530021, China 4. Guigang City People’s Hospital, Guigang 537100, China

To optimize the formulation of ampelopsin nanostructured lipid carriers (AMP-NLC) and to characterize its quality, and to study its inhibitory effect on SMMC-7721 cells and its uptake.AMP-NLC was prepared by organic solvent evaporation, and based on the single factor test combined with Box-Behnken response surface, the AMP-NLC prescription was optimized and its quality was characterized. The IC50of SMMC-7721 was measured by MTT method, and the uptake of SMMC-7721 cells was observed by rhodamine B dye.The optimal formula was that the ratio of glyceryl behenate to medium chain triglyceride was 1:11.5, the ratio of drug to lipid was 1:10.5, the dosage of egg yolk lecithin was 21 mg and the dosage of P188 was 2%, respectively. The average encapsulation efficiency of AMP-NLC was (81.71 ± 1.76)%, the average drug loading was (3.86 ± 0.22)%, the average particle size was (156.50 ± 7.11) nm and the zeta potential was (?11.00 ± 0.95) mV. Thedrug release process conformed to the primary release model= 47.93(1－e?0.625 2 t). The IC50of ampelopsin and AMP-NLC for SMMC-7721 cells were 44.51 and 41.51 μg/mL, and compared with ampelopsin, SMMC-7721 cells had a better uptake to AMP-NLC.The model established by Box-Behnken design-response surface could be employed to optimize the formulation of AMP-NLC, and AMP-NLC could effectively improve the relative uptake of ampelopsin in SMMC-7721 cells.

ampelopsin; Box-Behnken response surface optimization; nanostructured lipid carriers; quality evaluation; cellular uptake;targeting

R283.6

A

0253 - 2670(2022)16 - 4982 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.007

2022-02-16

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81960756）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2022GXNSFDA035063）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2018GXNSFAA050078）；廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升基金資助項(xiàng)目（2019KY0148）；廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升基金資助項(xiàng)目（2019KY0315）

麥琬婷（1995—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)。E-mail: 347800540@qq.com

黃秋潔（1979—），女，副教授，主要從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。E-mail: hqj8@163.com

葉 勇（1979—），男，博士，副教授，主要從事民族藥藥效物質(zhì)及其新制劑研究。E-mail: yong-ye@163.com

#共同第一作者：鐘華帥（1997—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)。E-mail: 2143327747@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]