劉 麗，李柏宏，鄭麗嬌，王 輝，于舒怡，關天舒，劉長遠

（1.植物保護研究所，遼寧省農(nóng)業(yè)科學院，沈陽 110161；2.新民市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，沈陽 110300）

脫落酸（Abscisic acid，ABA）作為一類重要的植物激素，是植物生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，同時也在植物應對生物和非生物脅迫反應中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。ABA 是調(diào)控植物對病原菌脅迫響應的重要分子。ABA 能夠通過調(diào)控纖維素合成、氣孔關閉等來阻止病原菌的入侵；除了調(diào)節(jié)其他激素系統(tǒng)和觸發(fā)防御反應，ABA 還促進植物細胞中胼胝質(zhì)的積累，限制病原菌的傳播。ABA 對植物調(diào)控作用是通過ABA 受體與信號傳導途徑過程中關鍵組分的相互作用實現(xiàn)的。MA等通過遺傳篩選和酵母雙雜交的方法，在擬南芥中證實了PYR/PYL/RCAR 蛋白是ABA 的受體，并闡述了其在ABA 信號轉導通路中的重要作用和調(diào)控機制。擬南芥研究表明PYR/PYL/RCAR 家族共有14 個成員，分別命名為PYR1 和PYL1-13（RCAR1-RCAR14），現(xiàn)已在葡萄（

Vitis vinifera

）中鑒定到 8 個 PYL 基因。不同的 PYR/PYL/RCAR 蛋白與 ABA 的結合能力不同。PYR/PYL/RCAR受體發(fā)揮識別傳遞ABA信號的關鍵功能，其能夠感知ABA信號，激活下游基因的表達，提高植物抵抗不良環(huán)境的能力。大量研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥、水稻、大豆、青蒿、草莓、香蕉和番茄等作物中PYR/PYL/RCAR家族基因成員過表達，可提高轉基因作物對ABA的敏感性、抗旱性及促進果實成熟等。葡萄霜霉病是由專性寄生菌

Plasmopara viticola

引起的真菌性病害，是葡萄生產(chǎn)上危害最為嚴重的病害。該病菌屬于專性寄生菌，通過葉背面的氣孔入侵而導致發(fā)病。該病主要危害葡萄葉片和果實，每年造成的產(chǎn)量損失20%～30%，嚴重時80%以上，甚至是絕產(chǎn)，對葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展造成嚴重危害與經(jīng)濟損失。目前防治霜霉病主要采用化學農(nóng)藥，由于頻繁過量用藥，易造成抗藥性產(chǎn)生和果實及環(huán)境污染，嚴重威脅了果品安全。因此開展葡萄霜霉病抗病基因挖掘和抗性機制研究對葡萄抗病基因改良和培育新品種具有重要意義。PYR/PYL/RCAR 位于ABA 信號通路上游，是信號調(diào)節(jié)因子，具有識別ABA 信號和啟動信號轉導原初過程功能。煙草

Nt-PYL4

在毛狀根中的過表達引起生物堿積累的下降。擬南芥

PYL4

的過量表達能夠提高植物的抗旱性。

PbPYL4

基因在杜梨響應鹽脅迫過程中起了重要作用。

PhPYL4

在矮牽牛對鹽、干旱及ABA 等非生物脅迫的響應中具有重要作用。番茄植株中

SlPYL4

基因參與了干旱脅迫下ROS 積累及SOD、POD 和CAT 活性的調(diào)控。馬宗桓等克隆得到6 個葡萄

PYL

基因，發(fā)現(xiàn)其高度保守，能夠響應PEG、ABA 和NaCl 等不同非生物脅迫。ZHAO等鑒定了8個葡萄PYL基因，發(fā)現(xiàn)

VvPYL4

啟動子含有低溫和干旱脅迫誘導元件；從葡萄座果期到成熟期，果肉中

VvPYL1

、

VvPYL4

、

VvPYL7

和

VvPYL8

的表達水平顯著增加，表明PYL 家族基因在果實成熟和發(fā)育過程中起著重要作用。PYR/PYL/RCAR 在ABA 介導的非生物脅迫響應中發(fā)揮重要作用，但其如何調(diào)控植物抗病鮮有報道。本研究室前期對霜霉病菌脅迫下抗感葡萄品種的轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)

VvPYL4

基因在霜霉病菌侵染下顯著上調(diào)表達，外源激素ABA 和MeJA 處理可顯著誘導

VvPYL4

的表達，

VvPYL4

基因沉默可降低葡萄對霜霉病菌的抗性。雖然已證實

VvPYL4

在葡萄抗霜霉病中的作用，但對VvPYL4 蛋白和基因表達特性尚不清楚。因此，本研究擬通過生物信息學方法對葡萄

VvPYL4

基因結構和表達進行分析，明確其在不同葡萄組織、不同葡萄品種以及霜霉病菌脅迫不同抗性品種下的表達特征，為深入研究

VvPYL4

基因功能和作用模式奠定了基礎，并為定向改良葡萄抗病新品種提供基因儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

供試葡萄（

Vitis vinifera

）品種貝達（高抗）、香悅（抗?。?、87-1（感病）和無核白雞心（高感），來自于遼寧省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所試驗基地；供試葡萄霜霉病菌由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所園藝病害研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 霜霉病菌接種處理 取葡萄品種貝達、香悅、87-1和無核白雞心枝條頂端新鮮葉片，噴霧霜霉病菌孢子囊懸浮液，濃度為1×10個·mL。密封保濕，22℃下光暗交替培養(yǎng)。每個處理重復3 次，每重復10 片葉。在接種后6，24，48，72，96h 時剪取4 個葡萄品種處理組葉片，無菌水噴霧葉片0h 作為對照組，取完樣品后用錫紙包好，立即放于液氮中迅速冷凍0.5h，然后將樣品保存于超低溫（-80℃）冰箱。

1.2.2 總RNA的提取 選擇接種霜霉病菌后6h 的貝達葡萄葉片，參照天根生物公司RNAprep Pure 植物總RNA提取試劑盒（離心柱型DP432）提取總RNA。

1.2.3 序列擴增 根據(jù)轉錄組所得數(shù)據(jù)進行NCBI BLAST 比對，設計一對引物由起始密碼子到終止密碼子進行擴增。PYL4 F：5’-3’ATGCCCTCAAACCCTCCAA ；PYL4 R：5’-3’TCATGACGATGACCTCTTGCAG。PCR 反應體系包括cDNA 模板1.0μL，LA TAQ(5U·μL)0.2μL，2×LA TAQ BUFFER 2μL，dNTP(2.5mmol·L)4μL，上下游引物各1μL，補足ddHO 至20μL。反應程序為：94℃，預變性5min；94℃，變性30s，55℃，退火30s，72℃，延伸1min，擴增進行35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

1.2.4 目的片段的純化與回收 選擇瓊脂糖凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）進行目的片段的回收與純化。利用1.0%瓊脂糖凝膠將回收純化產(chǎn)物進行電泳，并在紫外燈下觀察回收效果。

1.2.5

VvPYL4

表達載體構建及測序 采用T4 DNA 連接酶將回收純化產(chǎn)物連接到pGEM-T 克隆載體上，并轉化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，在含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基平板上涂板，挑取飽滿透明的單菌落在培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌液送Invitrigen公司進行測序鑒定。

1.2.6 VvPYL4生物信息學分析 利用DNAman6.0 軟件進行多序列比對，MEGA7.0 進行系統(tǒng)進化樹分析。運用生物信息學軟件，對VvPYL4 的蛋白序列進行分析。利用在線網(wǎng)站ProtParam、ProtScale 分析和預測VvPYL4蛋白的基本理化性質(zhì)；TMHMMServer2.0和SignalP4.1在線預測VvPYL4蛋白的跨膜結構和信號肽；利用SPOMA和Plant-mPLoc預測VvPYL4蛋白的二級結構及亞細胞定位；利用KEGG預測VvPYL4蛋白的代謝通路。

1.2.7 利用qRT-PCR分析

VvPYL4

基因的表達模式 分別取貝達葡萄的根、莖、葉提取RNA，采集貝達、香悅、87-1、無核白雞心葉片提取RNA，將提取的RNA 反轉錄合成cDNA；利用軟件Primer premier 6.0 設計葡萄

VvPYL4

基因熒光定量引物，上游引物為5’-CCGTCGTCCAGCAAATCG-3’，下游引物為5’-ACATCTCCATCGCCAACAAC-3’。以葡萄EF1a 蛋白基因為內(nèi)參基因，上游引物為5’-GAACTGGGTGCTTGATAGGC-3’，下游引物為5’-ACCAAAATATCCGGAGTAAAAGA-3’。以反轉錄合成的cDNA 為模板，通過qRT-PCR 檢測

VvPYL4

基因的表達情況。SYBR Green 法體系包括2×SYBR Green Mix 5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA 模板2μL，補足ddHO 至 10μL。反應程序為：預變性95℃，5min；變性95℃，10s，退火延伸60℃，30s，擴增 40 個循環(huán)；熔解曲線采集95℃，15s，60℃，60s，95℃，30s，95℃，15s。試驗每個處理取10株苗，并設置3個生物學重復，利用2法計算基因的相對表達量，并用SPSS 11.0和Excel 2007進行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 葡萄VvPYL4基因的克隆及序列分析

提取貝達葡萄葉片的總RNA，反轉錄成cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，獲得一條大約700bp 的擴增片段（圖1）。將

VvPYL4

基因經(jīng)T 載體連接，陽性克隆篩選后，測序得到了大小約為700bp 的目的基因片段（圖2 和圖3）。葡萄

VvPYL4

基因的CDS 全長為684bp，具有1 個外顯子，無內(nèi)含子，具有351bp 5’-非編碼區(qū)（UTR）和287bp 3’-UTR。

圖1 VvPYL4擴增PCR產(chǎn)物電泳結果Figure 1 The electrophoresis result of PCR product in VvPYL4

圖2 VvPYL4單克隆菌落PCR產(chǎn)物電泳結果Figure 2 The electrophoresis result of PCR product in monoclonal colony of VvPYL4

圖3 VvPYL4基因全長測序比對結果Figure 3 The sequencing comparison result of whole-length VvPYL4 gene

2.2 葡萄VvPYL4基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析 運用ProtParam、ProtScale 數(shù)據(jù)庫對VvPYL4 進行了理化性質(zhì)分析，結果顯示VvPYL4蛋白由228 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為24.28kDa，不帶負電荷的殘基大致在17，帶正電荷的殘基20，等電點（pI）為8.59；VvPYL4 疏水指數(shù)平均數(shù)為-0.241，屬于親水蛋白（圖4），蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為51.73，其活性穩(wěn)定性較差；VvPYL4 脂肪族氨基酸指數(shù)為85.15，屬于含脂類較高的蛋白。

圖4 VvPYL4編碼蛋白的疏水性分析結果Figure 4 The hydrophobicity profile of the induced protein of VvPYL4

2.2.2 二級結構分析 運用SOPMA 數(shù)據(jù)庫對VvPYL4的二級結構進行預測，預測結果VvPYL4

α

螺旋（HH）為67（29.52%），延伸鏈（EE）為44（19.38%），

β

轉角（TT）為19（8.37%），不規(guī)則卷曲（cc）為97（42.73%）（圖5）。

圖5 VvPYL4二級結構預測Figure 5 Secondary structure prediction of VvPYL4

2.2.3 亞細胞定位、信號肽和跨膜結構分析 利用Plant-mP 軟件對VvPYL4 亞細胞定位預測，結果顯示VvPYL4 定位在細胞質(zhì)中。利用LocSignalP 4.1 在線軟件對VvPYL4 肽信號的有無進行預測，結果顯示VvPYL4無信號肽（圖6）。運用TMHMM數(shù)據(jù)庫對VvPYL4進行了跨膜結構預測，結果顯示無跨膜結構（圖7）。

圖6 VvPYL4蛋白的信號肽預測結果Figure 6 Signal peptide prediction in the protein of VvPYL4

圖7 VvPYL4蛋白的跨膜區(qū)預測Figure 7 Prediction of transmembrance regions of VvPYL4

2.2.4 結構域分析 運用Smart 數(shù)據(jù)庫對VvPYL4 進行了功能結構域分析，結果顯示VvPYL4 含有結構域Polyketide_cyc2，擁有該結構域的家族屬于聚酮化合物環(huán)化酶/脫水酶家族，是參與聚酮化合物合成的酶，并含有START超家族的其他蛋白質(zhì)。

2.2.5 蛋白通路分析 運用KEGG 數(shù)據(jù)庫對VvPYL4 蛋白通路進行分析，結果顯示VvPYL4 蛋白參與植物MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway-plant vvi04016）和植物激素信號轉導通路（Plant hormone signal transduction vvi04075）。

2.3 系統(tǒng)進化樹構建及分析

為研究VvPYL4 蛋白與其他物種中PYL4 的親緣關系，利用MEGA 7.0 軟件，將葡萄VvPYL4 與已公布的擬南芥、煙草、黃瓜、番茄、大豆、胡楊、木薯等20 個物種的PYL4 序列進行聚類分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結果表明：VvPYL4與其他物種中的PYL4起源相同，但在進化的不同時期逐漸與其他物種分離開來。VvPYL4和擬南芥AtPYL4聚為一枝，親緣關系最近，而與大豆GmPYL4和山核桃CiPYL4親緣關系較遠（圖8）。

圖8 VvPYL4系統(tǒng)進化樹分析Figure 8 Phylogenetic tree of VvPYL4

2.4 VvPYL4基因在葡萄不同組織中的表達分析

利用熒光定量PCR技術，對

VvPYL4

在葡萄不同組織中的表達水平進行檢測。由圖9可知，

VvPYL4

在葡萄的莖、根、葉中均有表達。

VvPYL4

的表達水平從高到低依次為：根＞葉＞莖。根中的表達量約為莖中的15倍，而葉中的表達量約為莖中的7倍。說明

VvPYL4

的表達具有明顯的組織特異性。

圖9 葡萄不同組織VvPYL4的相對表達量Figure 9 Relative expression of VvPYL4 in different tissues of grapevine

2.5 VvPYL4基因在葡萄不同品種中的表達分析

利用熒光定量PCR 技術，對

VvPYL4

在葡萄不同品種中的表達水平進行檢測。由圖10 可知，以

VvPYL4

在無核白雞心中表達量為基準1.00，

VvPYL4

在貝達中表達量最高，在香悅中表達量最低，

VvPYL4

基因在葡萄不同品種中的表達量有所差異。

圖10 葡萄不同品種VvPYL4的相對表達量Figure 10 Relative expression of VvPYL4 in different varieties of grapevine

2.6 VvPYL4基因在葡萄霜霉病菌脅迫下的表達分析

由圖11 可知，

VvPYL4

的表達受到了葡萄霜霉病菌的誘導，在霜霉病菌侵染后6h，

VvPYL4

基因在4 個葡萄品種中的相對表達量顯著升高，在高抗品種貝達中的表達量上調(diào)最高，在高感品種無核白雞心中的表達量上調(diào)最低。在霜霉病菌侵染后48h，

VvPYL4

基因在抗病品種香悅中的表達量上調(diào)最高。隨著侵染時間的延長，到霜霉病菌侵染后96h，

VvPYL4

基因在高抗品種貝達中的表達量上調(diào)最高，在感病品種87-1中的表達量下調(diào)到最低?？梢姡?p>VvPYL4

基因參與了葡萄對霜霉病菌侵染的防御反應，但在不同抗性葡萄品種中的表達有顯著差異。

圖11 VvPYL4基因在不同葡萄品種接種霜霉病菌后的相對表達量Figure 11 Relative expression of VvPYL4 in different varieties of grapevine inoculated with P.viticola

3 討論與結論

ABA 受體蛋白PYR/PYL/RCAR 是一類重要的植物逆境應答因子，主要功能是識別ABA 信號和啟動信號的傳遞，在ABA 信號轉導途徑中起重要作用。SANTIAGO等以蛋白磷酸酶HAB1為誘餌篩選到相互作用的蛋白PYL5、PYL6和PYL8，并重點闡明了PYL5作為受體蛋白介導ABA信號應答的分子機制。根據(jù)前期轉錄組測序研究表明脫落酸受體基因PYL4參與了葡萄對霜霉病菌脅迫的響應過程，為了探明其生物學功能，本研究通過PCR 手段從葡萄葉片中克隆獲得了

VvPYL4

基因全長，并且對其進行了生物信息學分析。經(jīng)測序表明，

VvPYL4

基因全長684bp，具有1 個外顯子，無內(nèi)含子，具有351bp 5’-非編碼區(qū)（UTR）和287bp 3’-UTR。蛋白序列分析表明，VvPYL4蛋白由228個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量24.28kDa，是親水蛋白和含脂類較高的蛋白。預測VvPYL4定位在細胞質(zhì)中，無信號肽，無跨膜結構，含有結構域Polyketide_cyc2，參與植物MAPK 信號通路和植物激素信號轉導。進化樹結果顯示，VvPYL4 蛋白與擬南芥AtPYL4 親緣關系最近。通過qRT-PCR 技術分析

VvPYL4

基因的表達模式，發(fā)現(xiàn)

VvPYL4

在葡萄不同組織中具有表達特異性，在不同葡萄品種中表達量有顯著差異，在不同抗霜霉病葡萄品種中的表達量有顯著差異。本研究為后續(xù)揭示

VvPYL4

功能奠定了理論基礎。PYR/PYL/RCAR 蛋白家族成員含有START結構域，屬于脂質(zhì)轉運相關蛋白家族，廣泛地分布于細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)，在細胞內(nèi)或細胞質(zhì)膜附近感知ABA。LI等研究表明葡萄VvPYL1亞細胞定位于細胞質(zhì)和細胞核中；馬宗桓等研究表明PYL 家族成員主要定位于細胞質(zhì)中，并且有多個保守位點；而ZHAO 等亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)葡萄VvPYL2，VvPYL4 和VvPYL8 蛋白只定位在細胞核。本研究中預測VvPYL4 含有START 超家族的蛋白質(zhì)，定位在細胞質(zhì)中。PYR/PYL/RCAR 受體是ABA 信號傳導路徑中的一個核心組分，其基因表達強弱直接影響到ABA 的作用。PYLs 在植物體內(nèi)的表達量和組織特異性不同，因此不同的PYR/PYL/RCAR 蛋白與ABA的結合能力不同，在功能上也具有一定的差異。油棕

EgPYLs

基因在根、莖尖、葉、花和果肉中均有表達，但表達量差異較明顯。矮牽牛

PhPYL4

的表達水平從高到低依次為：葉＞莖＞根，具有明顯的組織特異性。LI等發(fā)現(xiàn)

VvPYL

在葉、莖和根中的表達量都比較高；ZHAO 等發(fā)現(xiàn)

VvPYL1

、

VvPYL2

、

VvPYL4

、

VvPYL7

和

VvPYL8

在根中表達較高。在本研究中葡萄

VvPYL4

的表達水平從高到低依次為：根＞葉＞莖，在葡萄不同組織中表達具有特異性。系統(tǒng)進化樹顯示VvPYL4 蛋白與擬南芥AtPYL4 親緣關系最近，表明葡萄VvPYL4 蛋白可能具有與擬南芥AtPYL4 蛋白相似的功能。在霜霉病菌脅迫下，

VvPYL4

基因在高抗病品種貝達中的表達量總體趨勢均高于其在高感品種無核白雞心中的表達量。表明

VvPYL4

參與葡萄抗霜霉病的響應。本研究已經(jīng)對葡萄

VvPYL4

的理化性質(zhì)及部分功能進行了解析，由于基因功能的復雜性和不同物種生長發(fā)育的特異性，還應進一步對葡萄

VvPYL4

的調(diào)節(jié)途徑和作用機理進行探討和分析。