李玲 單鐵英 劉聿謹(jǐn) 宋玉杰 李偉 王芳 楊慶 賈慧

宮腔粘連是子宮內(nèi)膜組織由于多種致病因素造成的宮腔局部甚至全部出現(xiàn)粘連?；即瞬≌呓?jīng)量稀少、經(jīng)期腹痛、閉經(jīng)、易流產(chǎn)以及不孕等癥狀[1,2]。嚴(yán)重影響有生育要求的女性患者的生殖能力。子宮內(nèi)膜組織呈現(xiàn)纖維化改變?yōu)閷m腔粘連的主要病理學(xué)特點(diǎn)，也是眾多醫(yī)學(xué)界的研究者們研究和治療此病的關(guān)鍵入手點(diǎn)。已有實(shí)驗(yàn)研究顯示，體外培養(yǎng)的人經(jīng)血干細(xì)胞(human menstrual stem cells,MenSCs)在適當(dāng)條件和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下可以向子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化[3,4]。但筆者查閱文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)將其接種到宮腔粘連的組織表面后，能否起到修復(fù)作用尚不清楚。因此，我們將MenSCs均勻接種到發(fā)生粘連的宮腔內(nèi)表面，觀察子宮內(nèi)膜組織的結(jié)構(gòu)改變及內(nèi)膜組織中的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及鈣粘蛋白E含量的變化，探索MenSCs接種改善宮腔黏連的機(jī)制，為宮腔粘連的治療提供一種新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 獲取經(jīng)血：收納來(lái)自邯鄲市中心醫(yī)院體檢中心檢查的健康女性，平均年齡(34.1±1.9)歲，詳細(xì)告知情況后，自愿簽署知情同意書，均采用無(wú)菌方法處理后的杯子收集經(jīng)血標(biāo)本，迅速送到在實(shí)驗(yàn)室的超凈臺(tái)中，無(wú)菌分離出MenSCs。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠購(gòu)自河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK(冀)2020-6-316，合格證編號(hào)：614273，雌性，月齡(12.0±1.7)月，體重(327.3±11.7)g。

1.1.3 主要試劑：蘇木素-伊紅染液、Masson 染液、α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E抗體和免疫組化試劑盒均購(gòu)自R&D System。

1.2 方法

1.2.1 MenSCs的純化、鑒定及培養(yǎng)：向收集的經(jīng)血中加入等容積的緩沖液，放入12 cm直徑離心機(jī)中，1 200 r/min持續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)10 min，吸出離心管上端的懸液，滴入單核細(xì)胞分離液，再離心0.5 h，在離心管中出現(xiàn)一薄層的白膜，仔細(xì)用吸管吸出薄層含有細(xì)胞的白膜，加入緩沖液清洗細(xì)胞后，留取少許細(xì)胞用于形態(tài)觀察、流式細(xì)胞術(shù)用于檢測(cè)細(xì)胞種類鑒定。其余細(xì)胞放入中等培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 大鼠造模及分組：采用麻醉液麻醉處于非動(dòng)情期的大鼠18只，沿大鼠的腹中線剪開腹部皮膚，充分顯露出子宮的左右側(cè)支，搔刮子宮右側(cè)支的宮壁，搔刮時(shí)當(dāng)手感到有粗糙感時(shí)即可停止，縫合腹部后放回籠中飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組和MenSCs組，每組6只。對(duì)照組：正常健康的大鼠；模型組：搔刮子宮右側(cè)支宮壁的大鼠；MenSCs組：模型組大鼠飼養(yǎng)1周后向粘連宮腔接種濃度為2×106個(gè)/ml的MenSCs 200 μl。3組分籠飼養(yǎng)28 d后，均取子宮的右側(cè)支放入固定液中固定，以備進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 子宮內(nèi)膜組織切片的制作、染色及形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察：固定好的3組小塊子宮內(nèi)膜組織，從70%的乙醇開始到100%的乙醇結(jié)束，依次浸沒于百分含量逐漸升高的乙醇中脫去組織中的水分，然后浸沒于融化的液態(tài)石蠟中，冷卻變硬固化后，固定在切片機(jī)里切割為標(biāo)準(zhǔn)厚度的組織薄片，從100%的乙醇開始到70%的乙醇結(jié)束，依次浸沒于百分含量逐漸降低的乙醇中脫去組織中的石蠟，最后浸沒于水中。遵循試劑的操作說(shuō)明對(duì)組織切片行蘇木素-伊紅染色和Masson 染色。觀察子宮內(nèi)膜組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，并統(tǒng)計(jì)比較3組子宮內(nèi)膜組織中的腺體個(gè)數(shù)以及纖維化面積。

1.2.4 蛋白印跡技術(shù)分析組織中α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E的相對(duì)值：將3組相同質(zhì)量的塊狀子宮內(nèi)膜組織分別加入適量的緩沖液放入勻漿機(jī)中，快速打碎并研磨為均勻的漿液，在漿液中加入適當(dāng)配比的預(yù)冷的裂解液靜置20 min，離心機(jī)離心后得到的上清液即為組織里的總量蛋白，取少許的蛋白樣品，確定其中的蛋白含量。將蛋白熱變性后，使用移液器定量吸取40 μg注入提前制備好的濃縮凝膠上端得小孔底端，將膠置于含有電泳液的電泳槽中，設(shè)置恒定電壓和恒定電流后啟動(dòng)電泳，持續(xù)2 h。截取經(jīng)電泳分離的膠塊里的目的蛋白條帶，與薄膜貼緊后放入轉(zhuǎn)膜儀中，將目的蛋白條帶轉(zhuǎn)到薄膜里，常溫下逐次投到脫脂奶粉液、第一抗體溶液(α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E)、洗膜液、第二抗體溶液、洗膜液。進(jìn)入暗室中將蛋白條帶顯色和顯影于X線片中。掃描X線片中的蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參分析并統(tǒng)計(jì)比較各組X線片里的平均灰度相對(duì)值。

2 結(jié)果

2.1 MenSCs的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及類型鑒定結(jié)果 剛分離出來(lái)并且經(jīng)過(guò)純化的MenSCs呈單個(gè)、散在、體積較小的圓形，經(jīng)1周常規(guī)培養(yǎng)后，貼培養(yǎng)瓶的瓶底壁生長(zhǎng)，體積增大呈長(zhǎng)梭狀。采用流式細(xì)胞技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面的分子類型以及它們各自的表達(dá)率分別為OCT-4(96.12±0.13)%、CD-45(1.32±0.11)%、Strol-1(95.45±0.19)%，這些分子類型和它們的表達(dá)率充分證明獲取的細(xì)胞為MenSCs。見圖1。

2.2 3組子宮內(nèi)膜組織的結(jié)構(gòu)比較 3組子宮內(nèi)膜組織經(jīng)蘇木素-伊紅染色后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組內(nèi)膜組織從外到內(nèi)依次為上皮層和固有層，固有層中有腺體。模型組內(nèi)膜組織無(wú)上皮層，只顯示固有層并且其厚度增加，固有層中的基細(xì)胞數(shù)量較少而基質(zhì)含量增多，其中沒有發(fā)現(xiàn)腺管的結(jié)構(gòu)。MenSCs組的內(nèi)膜組織顯示出新生長(zhǎng)出來(lái)的上皮層，固有層基細(xì)胞數(shù)量較多而基質(zhì)含量減少，其中可見數(shù)個(gè)腺管結(jié)構(gòu)。見圖2，表1。

圖2 3組內(nèi)膜組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)(蘇木素-伊紅染色×200)；A 正常組；B 模型組；C MenSCs組

2.3 3組內(nèi)膜組織纖維化程度的比較 3組子宮內(nèi)膜組織經(jīng)過(guò)Masson 染色后顯示，組織中的藍(lán)色面積表示為纖維化面積，3組內(nèi)膜組織呈現(xiàn)出不同程度的藍(lán)色面積。對(duì)照組內(nèi)膜組織固有層中藍(lán)色面積含量較少，纖維化面積占總組織面積的比例較少。模型組固有層藍(lán)色面積所占比例較對(duì)照組顯著增多(P<0.05)。MenSCs組藍(lán)色面積所占比例較模型組減少(P<0.05)。見圖3，表1。

圖3 3組內(nèi)膜組織的纖維化面積(Masson 染色×200)；A 正常組；B 模型組；C MenSCs組

表1 3組腺體數(shù)量、纖維化面積比例比較

2.4 3組內(nèi)膜組織中α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E含量的比較 模型組內(nèi)膜組織中的α-SMA和TGF-β1含量較對(duì)照組增加，而鈣粘蛋白E含量降低 (P<0.05)；MenSCs組內(nèi)膜組織中的α-SMA和TGF-β1含量較模型組降低，而鈣粘蛋白E含量較模型組升高 (P<0.05)。見表2，圖4。

圖4 免疫印跡顯示各組內(nèi)膜組織中α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E的蛋白條帶灰度

表2 3組內(nèi)膜組織中α-SMA、TGF-β1及鈣粘蛋白E含量比較

3 討論

正常的子宮內(nèi)膜組織有表面的上皮組織和其下面的固有層組成，固有層中含有豐富的毛細(xì)血管，因此，宮腔鏡下顯示為粉紅色。而宮腔粘連的子宮內(nèi)膜組織正常的上皮組織消失，其下面的固有層結(jié)締組織增厚并且發(fā)生纖維化的病理改變?yōu)閷m腔粘連的病理特點(diǎn)，宮腔鏡下可以顯示，黏連的子宮腔的體積窄小，纖維化的病變部位內(nèi)膜組織呈白色的斑狀或呈條索狀，質(zhì)地較硬。導(dǎo)致宮腔發(fā)生黏連的致病因素較多，宮腔粘連的患者經(jīng)常以多次流產(chǎn)或不易懷孕而來(lái)醫(yī)院就診，黏連程度嚴(yán)重的患者經(jīng)常規(guī)治療后比較容易復(fù)發(fā)。因此，探索宮腔粘連的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的有效的治療此病的作用靶點(diǎn)尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)TGF-β為導(dǎo)致機(jī)體多種器官組織發(fā)生纖維化改變的起關(guān)鍵作用的生物學(xué)細(xì)胞因子，其中TGF-β1為生物學(xué)活性最強(qiáng)的成員[5,6]。如果組織中TGF-β1含量異常增高，那么其發(fā)生纖維化的進(jìn)程就會(huì)越快。其具體作用機(jī)制為：(1)它可以增強(qiáng)結(jié)締組織中的成纖維細(xì)胞的活性并使其分泌大量的基質(zhì)成分，刺激抑制基質(zhì)成分降解的生物學(xué)因子合成增加，而基質(zhì)成分降解的酶蛋白合成降低，從而導(dǎo)致過(guò)量的基質(zhì)成分沉積在細(xì)胞間隙中，最終導(dǎo)致組織發(fā)生纖維化病變[7,8]；如果減弱或消除組織中TGF-β1的活性能明顯改善多種器官組織的纖維化病變進(jìn)程[9]。(2)TGF-β1在組織中的含量異常增高，將會(huì)阻止上皮細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和生物學(xué)活性，并能使之向間質(zhì)細(xì)胞的表型和特性轉(zhuǎn)分化[10-13]，上皮細(xì)胞表面的起粘附作用的分子-鈣粘蛋白E表達(dá)缺失，而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞特有的標(biāo)志性分子α-SMA，并能合成和分泌大量的基質(zhì)成分到細(xì)胞間隙中[14,15]。已有文獻(xiàn)證實(shí)宮腔粘連的內(nèi)膜組織中TGF-β1的含量高于正常的子宮內(nèi)膜組織，這說(shuō)明TGF-β1參與了宮腔粘連的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[16,17]。

我們的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：宮腔粘連的內(nèi)膜組織中無(wú)上皮組織覆蓋，只顯示固有層并且其厚度增加，固有層中的基細(xì)胞數(shù)量較少而基質(zhì)含量增多，其中沒有發(fā)現(xiàn)腺管的結(jié)構(gòu)。組織中所含的纖維化面積增多，α-SMA和TGF-β1的含量升高、而鈣粘蛋白E的含量降低。

近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究表明，在體外適當(dāng)細(xì)胞因子的培養(yǎng)下，有許多種類從機(jī)體來(lái)源的干細(xì)胞，例如從胎兒羊膜、成人的骨髓及脂肪組織獲取的干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)均能分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞；并且將其接種到粘連的內(nèi)膜組織表面后，均能改善宮腔黏連的程度并能起到修復(fù)的作用[18-20]。但它們的獲取途徑經(jīng)常會(huì)對(duì)機(jī)體造成不同程度的創(chuàng)傷，且存在較多的風(fēng)險(xiǎn)和倫理學(xué)爭(zhēng)議。MenSCs存在于子宮內(nèi)膜組織里，可隨月經(jīng)產(chǎn)生的血液排出體外，其有干細(xì)胞的特性，并且具有免疫排斥反應(yīng)弱、獲取途徑容易、無(wú)風(fēng)險(xiǎn)和倫理爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)[21,22]。

我們的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：將MenSCs接種到粘連組織表面后，內(nèi)膜組織會(huì)顯示出新生長(zhǎng)出來(lái)的上皮層，固有層基細(xì)胞數(shù)量較多而基質(zhì)含量減少，其中可見數(shù)個(gè)腺管結(jié)構(gòu)，組織中的纖維化面積減少，α-SMA和TGF-β1降低，鈣粘蛋白E升高。均說(shuō)明MenSCs接種到宮腔黏連組織表面后，能分化為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，修復(fù)內(nèi)膜組織的纖維化損傷和改善宮腔黏連，為探索宮腔粘連的治療方案提供了新的思考方向。