李漢卿，王瑾，史江穎，張曉莉，單樹花 ，李卓玉，*

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

0 引言

原發(fā)性肝癌的主要組織學(xué)形式是肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC），是世界上第五大常見的惡性腫瘤，其具有病情進展快、惡性程度高、治療難度大及生存率低的特點，也是腫瘤致死率第二位的癌癥[1]。目前普遍認為原發(fā)性肝癌是多基因、多因素、多步驟的疾病，其中導(dǎo)致肝癌發(fā)生的因素很多，包括慢性乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、吸煙等[2-4]，但是飲食因素如過度飲酒、食用黃曲霉毒素污染的食物等被認為是誘發(fā)肝癌的重要危險因素[5]。目前，對于肝癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、放射療法和化學(xué)療法。手術(shù)治療對患者的創(chuàng)傷較大，易產(chǎn)生一系列手術(shù)并發(fā)癥，降低患者的免疫力。放射療法腫瘤特異靶向性差，會破壞正常細胞組織，產(chǎn)生血液改變、惡心嘔吐等副作用。而化學(xué)療法對正常細胞缺乏選擇性，具有嚴重的毒副作用[6]，且易產(chǎn)生腫瘤耐藥[7]。因此，尋找一種安全、無毒、高效營養(yǎng)干預(yù)肝癌細胞增殖的功能分子，對于肝癌的防治具有重要意義。

谷子（Setaria italica）廣泛種植于全世界，是我國北方地區(qū)種植的主要農(nóng)作物之一，為山西名優(yōu)產(chǎn)品。自古有“五谷為養(yǎng)”的說法，谷物是膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)、植物營養(yǎng)素等多種營養(yǎng)素的良好來源[8]，具有抗癌、抗炎、抗菌及抗氧化等藥理學(xué)特性。谷子在經(jīng)過碾磨脫糠得到小米的精細化加工過程中，雖然谷糠易被忽視，但其中同樣含有多種具有生物活性的營養(yǎng)物質(zhì)。已有研究發(fā)現(xiàn)谷糠中結(jié)合態(tài)多酚對人結(jié)腸癌細胞HCT-116、人宮頸癌細胞HeLa、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MCF-7等腫瘤細胞的增殖均具有顯著的抑制作用[9]；谷糠中的一種過氧化物酶在體外和體內(nèi)均已證實能夠通過抑制CD36和STAT3的表達來減輕動脈粥樣硬化病癥[10]。因此，谷糠具有許多潛在的營養(yǎng)物質(zhì)有待更多研究。越來越多的研究表明，全谷物的攝入與肥胖[11-12]、2型糖尿病[12-15]和非酒精性脂肪肝[16-17]等已知肝癌的誘發(fā)因素的降低相關(guān)。而全谷物中的膳食纖維含量非常豐富，這種谷物纖維除了改善胰島素敏感性、調(diào)節(jié)代謝、減少系統(tǒng)性炎癥，還能夠改變腸道微生物的組成，促使腸道微生物相關(guān)代謝產(chǎn)物丁酸鹽的增加[18-19]，提高腸道完整性[20]，可有效減緩肝癌的發(fā)生與發(fā)展。流行病學(xué)研究表明，膳食纖維的攝入可有效降低和預(yù)防結(jié)腸癌、乳腺癌等多種疾病的發(fā)病幾率[21-22]。但是，谷子源膳食纖維抗肝癌活性鮮見報道，因此，探究谷子源膳食纖維對肝癌細胞的干預(yù)能夠為肝癌的防治提供新的思路。

本研究分別從全谷物、小米和谷糠中運用酶法結(jié)合化學(xué)法獲得三種谷子源可溶性膳食纖維，并對三種膳食纖維的含量和得率進行了分析，進一步評價三種膳食纖維的毒性作用和對人肝癌細胞HepG2的抑制效應(yīng)，為將其進一步研發(fā)成預(yù)防肝癌保健品和藥物中間體提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷糠、全谷物、小米（均為晉谷21號）購于山西農(nóng)科院。

人肝癌細胞HepG2、人正常肝細胞HL-7702均購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

RPMI-1640及DMEM培養(yǎng)基均購于Gibco公司；胎牛血清購于生工生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購于美國Sigma公司；噻唑藍（MTT）、胰蛋白酶、α-淀粉酶（高溫淀粉酶）（40 000 U/g）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）均購于北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶（50 U/mg）購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱（中國，博迅）；真空冷凍干燥儀（中國，興芝）；電熱恒溫水浴鍋（中國，一恒）；臺式高速冷凍離心機（德國，Eppendorf）；電子天平（美國，Ohaus）；pH計（上海，三信）；CO2細胞培養(yǎng)箱（美國，Thermo）；倒置顯微鏡（日本，Nikon）；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 谷子源可溶性膳食纖維的制備

膳食纖維的提取主要包括物理法、化學(xué)法和酶法等3種方法。本實驗參考黃冬云[23]的方法：分別稱取適量小米、全谷物和谷糠，粉碎后過60目篩，料液比1∶12加pH 4.5的水溶液，60℃水浴攪拌2 h以去除植酸→11 000 r/min，離心5 min，棄上清→沉淀按料液比1∶12加蒸餾水，95℃糊化30 min→加高溫淀粉酶（200 U/g），95℃、pH 6.0酶解30 min→加堿性蛋白酶（5 400 U/g），50℃、pH 10酶解 5 h→沸水浴10 min，滅酶活→4 000 r/min離心20 min→收集上清；沉淀烘干，過100目篩，按料液比1∶10加0.05 mol/L，pH 4.8的檸檬酸?檸檬酸鈉緩沖液，加纖維素酶（200 U/g），混勻后，于50℃水浴3 h→沸水浴10 min滅酶活→4 000 r/min離心20 min→收集上清；按 1∶4（V/V）向收集的上清液中加入體積分數(shù)為95%的乙醇，靜置12 h→收集沉淀物，凍干。

1.4 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清（含100 U/mL青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，HL-7702培養(yǎng)于含10%胎牛血清（含100 U/mL青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，5% CO2（體積分數(shù)）、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 細胞毒性和增殖實驗

因人正常肝細胞HL-7702生長速度慢，人肝癌細胞HepG2生長速度快，故收集對數(shù)期人正常肝細胞HL-7702，將細胞密度調(diào)整為10 000～15 000個/100 μL，收集對數(shù)期人肝癌細胞HepG2，將細胞密度調(diào)整為4 000～5 000個/100 μL，接種于96孔板，以確保細胞培養(yǎng)48 h后，二者細胞數(shù)量基本一致。5% CO2、37℃培養(yǎng)12 h貼壁后，加入終濃度分別為1，2，4 mg/mL的全谷物、小米和谷糠的可溶性膳食纖維，各設(shè)置5個復(fù)孔做重復(fù)對照，同時設(shè)置5個空白對照，培養(yǎng)48 h，所有孔 PBS 清洗 2次，換 100 μL新鮮培養(yǎng)基，加 20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄培養(yǎng)基后，加入150 μL DMSO，于微孔板振蕩器振蕩10 min，酶標儀570 nm波長測吸光度。

1.6 細胞克隆形成實驗

收集對數(shù)期人肝癌細胞HepG2調(diào)整細胞密度5 000個/孔，接種于24孔板培養(yǎng)24 h，加入終濃度為1、2、4 mg/mL的谷糠可溶性膳食纖維處理細胞1周，同時設(shè)置空白對照。用免疫固定液覆蓋細胞，室溫固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染液（m∶V）染色15 min，烘干后顯微鏡下觀察拍照。最后，每孔中加入1%SDS（m∶V）充分溶解細胞內(nèi)結(jié)晶，570 nm波長測定其吸光度對細胞克隆實驗的結(jié)果并進行量化分析。

1.7 劃痕實驗

收集對數(shù)期人肝癌細胞HepG2，調(diào)整細胞密度，接種于鋪有滅菌槍頭圈的24孔板中，使得過夜培養(yǎng)后圈內(nèi)形成密度大于90%的單層細胞。細胞貼壁后，用無菌鑷子取出槍頭圈，用20 μL無菌槍頭均勻劃痕后，PBS小心清洗2次，換入500 μL新鮮培養(yǎng)基，加入終濃度為0.1和0.4 mg/mL的谷糠可溶性膳食纖維，同時設(shè)置空白對照，每個樣品設(shè)3組重復(fù)對照，于5% CO2，37℃培養(yǎng)。每24 h用倒置顯微鏡觀察HepG2細胞的增殖情況。愈合率的計算方法為：

1.8 細胞凋亡測定

收集對數(shù)期人肝癌細胞HepG2，調(diào)整細胞密度，接種于60 mm小皿中，貼壁后加谷糠可溶性膳食纖維（1、2、3 mg/mL）處理，用胰酶消化，離心收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入 100 μL Binding Buffer吹散細胞后，加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI Staining Solution，輕輕混勻后，室溫避光孵育10 min，加入400 μL Binding Buffer，用流式細胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)平均做3次獨立實驗，以均數(shù)±標準誤表示；采用單因素方差分析（ANOVA）進行多重比較，不同字母表示差異顯著（P<0.05）；運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，兩組獨立樣本間平均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 全谷物、小米和谷糠中可溶性膳食纖維的含量

利用酶法結(jié)合化學(xué)法，分別從10 g的全谷物、小米和谷糠中提取可溶性膳食纖維。結(jié)果如表1顯示，全谷物可溶性膳食纖維的含量為1.007 g/10 g，小米可溶性膳食纖維的含量為1.586 g/10 g，谷糠可溶性膳食纖維的含量為0.301 g/10 g。全谷物、小米和谷糠可溶性膳食纖維含量依次是：小米可溶性膳食纖維>全谷物可溶性膳食纖維>谷糠可溶性膳食纖維。以上結(jié)果表明，小米可溶性膳食纖維最多，谷糠可溶性膳食纖維最少。

表1 全谷物、小米和谷糠中可溶性膳食纖維的含量（，n=3）Table 1 Contents of soluble dietary fiber in whole grain,millet and foxtail millet bran（，n=3）

表1 全谷物、小米和谷糠中可溶性膳食纖維的含量（，n=3）Table 1 Contents of soluble dietary fiber in whole grain,millet and foxtail millet bran（，n=3）

Species of dietary fiber Contents/g Total volume/mL Millet Whole grain Foxtail millet bran 10 g原材料提取所得上述膳食纖維,兩組之間的顯著性差異用不同字母表示,P<0.05 Concentration/（mg/mL）243.926±0.737 201.371±0.352 66.559±0.812 6.5±0.425 5±0.296 4.5±0.701 1.586±0.085 1.007±0.037 0.300 5±0.044 Composition ratio/%15.86±0.85a 10.07±0.37b 3.005±0.44c

2.2 谷子源可溶性膳食纖維的毒性評價

為了確定谷子不同部位的可溶性膳食纖維的安全性，將全谷物、小米和谷糠可溶性膳食纖維通過MTT法，檢測其在不同濃度（0，1，2，4 mg/mL）對人正常肝細胞HL-7702的活力影響。圖1顯示，全谷物、小米和谷糠的可溶性膳食纖維在濃度分別為1，2，4 mg/mL時，對人正常肝細胞HL-7702的存活率均大于90%，表明全谷物、小米和谷糠可溶性膳食纖維對HL-7702細胞的正常增殖無明顯影響。這說明3種可溶性膳食纖維在此濃度下對正常細胞無明顯毒性作用。

圖1 谷子源可溶性膳食纖維對HL-7702細胞增殖的影響（±s，n=3）Fig.1 Effects of soluble dietary fiber from foxtail millet on HL-7702 cells proliferation（±s，n=3）

2.3 谷子源可溶性膳食纖維對HepG2細胞的抑制作用

由圖2可知，小米可溶性膳食纖維在濃度為2，4 mg/mL時對人肝癌細胞HepG2的增殖有顯著抑制作用（P<0.05），全谷物和谷糠可溶性膳食纖維在濃度為1，2，4 mg/mL時對HepG2均有顯著抑制作用（P<0.05），且具有濃度依賴性。其中，谷糠可溶性膳食纖維在濃度為4 mg/mL時，存活率為51.83%，與其他谷子源膳食纖維相比，谷糠可溶性膳食纖維對HepG2增殖的抑制作用最為顯著（P<0.05）。因此，選擇谷糠可溶性膳食纖維進一步研究其抗肝癌活性。

圖2 谷子源可溶性膳食纖維對HepG2增殖的影響（，n=3）兩欄間用不同字母表示有顯著性差異，P<0.05Fig.2 Effect of soluble dietary fiber of foxtai millet on the proliferation of HepG2（，n=3）Significant differences between the two columns were indicates by different letters,P<0.05

2.4 谷糠可溶性膳食纖維對人肝癌細胞HepG2增殖的影響

為了進一步證明谷糠可溶性膳食纖維的抗肝癌活性，采用細胞克隆形成實驗評價谷糠可溶性膳食纖維對HepG2細胞增殖的影響。圖3（a）顯示，谷糠可溶性膳食纖維對HepG2細胞的克隆形成能力具有明顯的抑制作用，且具有劑量依賴性，其抗增殖的效果與MTT結(jié)果一致。圖3（b）是對圖3（a）細胞克隆形成的實驗結(jié)果，結(jié)果證明谷糠可溶性膳食纖維能夠顯著抑制HepG2細胞的克隆形成。

圖3 谷糠可溶性膳食纖維對HepG2細胞活力的影響（，n=3），組間字母不同的欄目差異有顯著性，P<0.05Fig.3 Effects of soluble dietary fiber from foxtail millet bran on HepG2 cell viability（，n=3）The columns with different letters between groups represented significant differences,P<0.05

2.5 谷糠可溶性膳食纖維對人肝癌細胞HepG2遷移的影響

為了進一步確定谷糠可溶性膳食纖維的抗肝癌效應(yīng)。選擇在對HepG2細胞無抑制作用的濃度（圖4（b））下，采用細胞劃痕實驗檢測谷糠可溶性膳食纖維對HepG2單層細胞的遷移作用。結(jié)果顯示，與空白對照相比，谷糠可溶性膳食纖維濃度為0.4 mg/mL時，在24 h和48 h對細胞劃痕愈合率的抑制分別達到7.72%和9.34%（圖4（a），4（c））。谷糠可溶性膳食纖維不僅顯著抑制了HepG2單層細胞的增殖，并且能夠有效抑制HepG2細胞的遷移，且具有濃度依賴性。

圖4 谷糠可溶性膳食纖維對HepG2細胞增殖的抑制作用（，n=3）組間字母不同的欄目差異有顯著性，P<0.05Fig.4 Antiproliferative effect of soluble dietary fiber from foxtail millet bran on HepG2 cells（，n=3）The columns with different letters between groups represented significant differences,P<0.05

2.6 谷糠可溶性膳食纖維對人肝癌HepG2細胞凋亡的影響

為了探討谷糠可溶性膳食纖維對HepG2細胞凋亡的影響，采用流式細胞儀檢測不同濃度谷糠可溶性膳食纖維（0，1，2，3 mg/mL）對HepG2細胞凋亡的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，1 mg/mL谷糠可溶性膳食纖維處理后與對照相比，細胞凋亡率增加了2.45倍；2 mg/mL處理時，細胞凋亡率增加了3.83倍；3 mg/mL處理時，細胞凋亡率增加了4.95倍，表明膳食纖維能夠通過誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡進而抑制其增殖，且具有劑量依賴性。

圖5 谷糠可溶性膳食纖維對HepG2細胞凋亡的影響（，n=3）組間字母不同的欄目差異有顯著性，P<0.05Fig.5 Effect of soluble dietary fiber from foxtail millet bran on the apoptosis of HepG2 cells（，n=3）The columns with different letters between groups represented significant differences,P<0.05

3 討論

已有研究表明膳食纖維攝入量與肝癌風(fēng)險呈現(xiàn)潛在的負相關(guān)性，但因食物來源不同而有所不同，如部分水果或蔬菜的膳食纖維則與肝癌無相關(guān)性[24]。這可能是因為水果和蔬菜，特別是果汁中，含有較高的果糖和蔗糖，這些能導(dǎo)致有肝損傷或非酒精性脂肪肝的基礎(chǔ)病患者病情加重，從而掩蓋水果和蔬菜纖維的潛在益處[25-26]。王菁等[27-28]分別通過高脂飲食誘導(dǎo)，構(gòu)建胰島素抵抗動物模型和人群流行病學(xué)研究表明，增加不同種類全谷物的攝入量能夠顯著降低血糖水平，改善胰島素抵抗；Xu等[29-30]通過對人群調(diào)查研究顯示，全谷物的攝入與炎癥標志物濃度呈負相關(guān)；增加谷物源膳食纖維的攝入量能夠減輕胰島素抵抗、改善代謝平衡、降低炎癥，從而對肝癌具有一定的預(yù)防和治療作用。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)海藻中提取的可溶性膳食纖維巖藻黃質(zhì)可以通過PI3K/Akt通路誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細胞的凋亡[31]；可溶性玉米纖維可以通過增加ROS表達，誘導(dǎo)Apc缺陷的結(jié)腸癌SW480細胞凋亡，顯著減少小鼠小腸腺瘤的形成和結(jié)腸息肉的數(shù)量[32]。此外，谷物豆組合膳食纖維可對Caco-2細胞葡萄糖吸收作用產(chǎn)生影響，并且可以改善胰島素抵抗HepG2細胞[33]。目前尚未見谷子源膳食纖維抗肝癌活性的相關(guān)報道，本研究為谷子源可溶性膳食纖維發(fā)揮抗肝癌效應(yīng)提供了一定的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)，同時有效提高了谷物及谷糠資源的生物利用率。

本研究從山西特色天然產(chǎn)物資源全谷物、小米和谷糠中制備了三種谷子源可溶性膳食纖維，系統(tǒng)分析其含量和得率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小米的可溶性膳食纖維最多，其次是全谷物可溶性膳食纖維，最后是谷糠可溶性膳食纖維；我們推測其原因是源于相同質(zhì)量的原材料，全谷物中小米所占的比重比小米原材料少，所以全谷物中可溶性膳食纖維的含量比小米中的少。對三種谷子源可溶性膳食纖維進行了安全性評價，結(jié)果揭示三種谷子源可溶性膳食纖維對人正常肝細胞HL-7702增殖無任何抑制作用。進一步本研究采用HepG2細胞，評價三種谷子源可溶性膳食纖維的抗肝癌活性。研究結(jié)果證明，三種谷子源可溶性膳食纖維對人肝癌HepG2細胞均具有顯著的抑制作用，且谷糠可溶性膳食纖維的抗肝癌活性更強，并具有濃度依賴性。此外，采用克隆形成實驗、細胞劃痕實驗和細胞凋亡實驗證明谷糠可溶性膳食纖維可顯著抑制HepG2細胞的克隆形成能力和遷移能力，并且能夠通過誘導(dǎo)凋亡而抑制其增殖。

4 結(jié)論

本研究對山西特色產(chǎn)物全谷物、小米和谷糠中的可溶性膳食纖維進行提取和抗肝癌活性測定。結(jié)果顯示：小米可溶性膳食纖維含量最多，其次是全谷物可溶性膳食纖維，最少的是谷糠可溶性膳食纖維；三種谷子源可溶性膳食纖維均可有效抑制肝癌HepG2細胞增殖，其中谷糠可溶性膳食纖維的抗肝癌活性最顯著，并可以有效抑制克隆形成和細胞遷移、顯著促進細胞凋亡。綜上所述，本研究對谷子源可溶性膳食纖維對于實際生活中預(yù)防和治療肝癌具有很好的指導(dǎo)意義，為肝癌的治療提供了新的思路。未來可針對谷子源膳食纖維組成展開工作，深入探討其發(fā)揮功能活性的單一組分，并研究其對肝癌細胞作用的分子機制及作用靶點，以期提供安全、高效的抗肝癌保健品和新型藥物。