姚 唱，王伊喬，陳 潔

北京市糧油食品檢驗所 (北京 100144)

黃曲霉(AFT)是毒性極強的劇毒物質(zhì)，世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構(gòu)1993年將黃曲霉劃定為一類天然存在的致癌物，其衍生物有約20種，其中以黃曲霉毒素B1的毒性最大，致癌性最強[1-2]。黃曲霉主要污染原糧、油脂及其制品[3]，如玉米、大米、花生、花生油等。國內(nèi)食品檢測中以黃曲霉毒素B1作為污染指標，可通過薄層層析法和高效液相色譜法檢測[4]。目前，真菌毒素在社會上受到了廣泛關(guān)注，真菌毒素的檢測(例如黃曲霉、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素等)已成為糧食作物常檢的項目之一。

測量不確定度是對于誤差分析中的最新理解和闡述，是評定實驗檢測結(jié)果質(zhì)量的指標，同時也是該結(jié)果可信賴程度的重要評價指標。CNAL發(fā)布專項文件，指出實驗室應(yīng)為不確定度的測量構(gòu)建配套的評定程序，而且對于測定獲得數(shù)據(jù)開展評定[5]。在本文實驗中，依據(jù)JJF 1059.1—2012的要求，運用高效液相色譜法進行測定的過程中，確認不確定度的核心影響因素，并對此展開分析，盡可能保障檢測數(shù)據(jù)的精準與真實。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

乙腈，色譜純，美國賽默飛公司；甲醇，色譜純，美國賽默飛公司；黃曲霉毒素B1標準品，108.3 ng/mL，1 mL/支，德國默克公司；超純水等。

分析天平(分度值0.01 g)，奧豪斯儀器公司；N-EVAP 111型氮吹儀，美國Orgnamation公司；MS 3型渦旋振蕩器，德國艾卡公司；高效液相色譜儀，日本島津公司生產(chǎn)，檢測器型號為RF-20A。

1.2 方法

1.2.1樣品前處理

參照GB 5009.22—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》第三法高效液相色譜-柱后衍生法中規(guī)定的前處理方法。

1.2.2色譜條件

色譜柱，ODS-SP C18(柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5 μm)；流速1.0 mL/min；進樣量50 μL；柱溫40 ℃；光化學(xué)柱后衍生器；檢測器波長，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm；流動相，乙腈、甲醇、水的體積比為16∶16∶68。

1.2.3數(shù)學(xué)模型

式中：X為樣品中黃曲霉毒素B1含量的數(shù)值，μg/kg；A為進樣溶液中黃曲霉毒素B1含量的濃度，ng/mL；V為定容體積，mL；M為樣品質(zhì)量的數(shù)值，g；f為稀釋倍數(shù)。

在此次研究過程中，綜合JJF 1059.1—2012所介紹的具體操作思路，總結(jié)此次分析的不確定度，主要有標準溶液、稱量等多個來源，本試驗對不同來源進行評定與分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不確定度分量的評定

2.1.1標準溶液引入的不確定度

2.1.1.1 標準物質(zhì)引入的不確定度

在此次實驗過程中，實際采購的標準溶液偏差數(shù)據(jù)是±1.51 ng/mL，濃度數(shù)據(jù)是108.3 ng/mL，包含因子k=3，結(jié)合前述數(shù)據(jù)可得出其相對不確定度為：

2.1.1.2 玻璃量具引入的不確定度

由玻璃量具引入的不確定度有兩類：一類是量具的生產(chǎn)校準過程中所引入的；另一類是由于量具的使用溫度與標準溫度不一致，導(dǎo)致液體膨脹而引入的。

表1 玻璃量具的不確定度

由玻璃量具引入的相對不確定度為：

2.1.1.3 標準曲線校正引入的不確定度

將配制好的黃曲霉毒素B1標準曲線上機測定，測定結(jié)果見表2。

表2 標準曲線測定結(jié)果

根據(jù)表2擬合得出黃曲霉毒素B1的標準工作曲線為：y=99 950.859 6x+2 696.983 4，線性相關(guān)系數(shù)r為0.999 7，式中：y表示峰面積；x表示濃度，ng/mL。對標準曲線數(shù)據(jù)進行分析，分析結(jié)果見表3。

表3 標準曲線數(shù)據(jù)分析結(jié)果

由此計算得出：

2.1.1.4 標準溶液引入不確定度的合成

結(jié)合前文所介紹的三類不確定分量，可計算出由標準溶液引入的不確定度為：

2.1.2樣品稱量引入的不確定度

在進行稱量的場景中，產(chǎn)生的相對標準不確定度(操作中具體的樣品量為5.00 g)為：

2.1.3體積引入的不確定度

由體積引入的不確定度主要包括稀釋因子和最終定容體積。稀釋因子產(chǎn)生的不確定度是由實驗過程中所涉及的一系列稀釋過程所產(chǎn)生的，而過程中所有的稀釋步驟都需搖勻，所以液體分配不均產(chǎn)生的不確定度可以忽略不計。因為在進行稀釋操作的過程中，要求運用多類規(guī)格的量具，故稀釋產(chǎn)生的不確定度主要是由玻璃量具引入的；最后定容體積所產(chǎn)生的影響，即多種批次定容標線的劃定與制作工藝的區(qū)別所產(chǎn)生的影響。按照對玻璃量具引入的不確定度進行評定，見表4。

由玻璃量具引入的相對不確定度為：

2.1.4樣品提取過程引入的不確定度

在進行樣品提取的過程中，主要有相關(guān)樣品的稱量、均質(zhì)等多個程序，其各個操作流程都會帶來影響，對于該類不確定度，可依靠測試整個實驗場景的具體回收率參數(shù)開展針對性的評定工作，最終所獲得的結(jié)果詳見下表5所述。

表4 玻璃量具的不確定度

表5 實驗回收率測定結(jié)果

由表5中數(shù)據(jù)計算得出不確定度為：

相對標準不確定度為：

2.1.5測量的重復(fù)性引入的不確定度

對同一樣品進行6次平行測定，結(jié)果見表6。

表6 樣品的測定結(jié)果

結(jié)合表6所述的信息，來源于測量重復(fù)性的不確定度數(shù)據(jù)為：

相對標準不確定度為：

2.2 相對標準不確定度的合成及擴展

2.2.1標準不確定度的合成

結(jié)合所獲得不確定度分量的數(shù)據(jù)，進行相關(guān)數(shù)據(jù)的匯總，最終所獲得的數(shù)據(jù)詳見表7所述。

表7 相對標準不確定度分量

根據(jù)表7中數(shù)據(jù)，合成標準不確定度為：

2.2.2擴展不確定度的評定

按照慣例，測量結(jié)果的擴展不確定度包含因子k=2，計算可得相對擴展不確定度U=urel(c)×k=0.028 23×2=0.056 46。

樣品中黃曲霉毒素B1的最佳估計值為1.064 287 μg/kg，因此其擴展不確定度為U=1.064 287 μg/kg×0.056 46≈0.060 1 μg/kg。

3 結(jié)論

本試驗不確定度的主要影響因素是測量的重復(fù)性，其次是標準曲線校正以及樣品處理過程引起的，而由標準物質(zhì)和樣品稱量等引起的不確定度很小，可忽略不計。 為減小不確定度，樣品提取過程要更規(guī)范，以減少黃曲霉毒素B1在前處理過程中的損失。 樣品每次稱量前都要充分混合均勻，提取液現(xiàn)用現(xiàn)配，樣液經(jīng)免疫親和柱凈化時要嚴格控制洗脫流速，其次要注意對標準溶液進行低溫密封保存，同時配制、定容過程要選用更高精度的量具，并增加平行實驗次數(shù)，通過這些操作可以進一步減小不確定度。