陳治高天翔

(1.海南熱帶海洋學(xué)院崖州灣創(chuàng)新研究院，海南 三亞 572022；2.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316022)

基于環(huán)境DNA技術(shù)進行魚類多樣性調(diào)查最早始于2012年，Minamoto等利用脊椎動物線粒體細胞色素b(Cytb)簡并引物，首次對河流中的魚類進行監(jiān)測，共檢出6種淡水魚類[1]。之后，Thomsen等通過使用多組COI、Cytb引物對丹麥某港口的魚類多樣性進行評估，發(fā)現(xiàn)該海域中有15種魚類[2]。但是，Minamoto等、Thomsen等受所用通用引物的限制，能夠檢測的魚類種數(shù)仍然有限。2015年是魚類環(huán)境DNA技術(shù)發(fā)展史上的重要年份，Miya等使用880種魚類的線粒體基因組全序列設(shè)計出了一套魚類環(huán)境DNA宏條形碼通用引物(MiFish)，并基于沖繩水族館附近的海水樣品對該12S引物進行有效性驗證，累計鑒定出70個科、152個屬、共232種魚類[3]。國內(nèi)方面，趙夢迪亦較早利用該12S引物對冬季中國東黃海水域的魚類多樣性進行分析，并取得了較理想的研究結(jié)果[4]。目前，部分觀點認為環(huán)境DNA技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)調(diào)查方法[5]。然而，目前使用環(huán)境DNA技術(shù)進行魚類多樣性調(diào)查的相關(guān)研究仍處于不斷探索中，該技術(shù)還有許多問題尚待解決[6]。特別是以往的魚類多樣性調(diào)查多位于海洋、河流等開放水域，缺乏準確的物種本底資料驗證環(huán)境DNA結(jié)果[5,6]。因此，為了解環(huán)境DNA技術(shù)的優(yōu)缺點，方便后期基于該技術(shù)開展魚類多樣性調(diào)查，本研究擬對環(huán)境DNA技術(shù)用于魚類多樣性調(diào)查的準確性進行探究。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查水域

青島海底世界位于青島市萊陽路2號，總建筑面積7000m2，水體4000t。館內(nèi)魚種豐富，同時水質(zhì)條件良好，水體中環(huán)境DNA濃度高。以青島海底世界為驗證水域，不僅能夠降低實驗難度，而且方便與已知魚類名單對比驗證。通過與海底世界工作人員交流得知，軟骨魚缸內(nèi)的魚類個體較大，物種名錄最清晰。因此，本研究選取青島海底世界軟骨魚缸作為調(diào)查水域。

1.2 本底魚類鑒定

使用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法對放入海底世界軟骨魚缸的魚類進行鑒定。此工作由海底世界工作人員在魚種買入時完成。

1.3 水樣采集及保存

軟骨魚缸長約40m，寬約25m，最深處約7m，最淺處約0.5m，平均水深約4m。共設(shè)置5個取樣點(位于缸的四角及中間位置，取樣點編號SZG1～SZG5)，每個取樣點取3個平行樣(平行樣編號X.1～X.3，X代表SZG1～SZG5)。用直徑47mm、孔徑0.45μm的WCN硝酸纖維濾膜過濾2L水樣。濾膜用酒精常溫保存后送至華大基因青島研究院進行高通量測序。

1.4 建庫、測序及后續(xù)分析

利用高保真酶(Q5?High-Fidelity Master Mix，New England Biolabs)進行PCR 擴增以確保擴增效率和準確性。擴增引物為MiFish簡并引物，引物序列分別為F：5’-GTYGGTAAAWCTCGTGCCAGC-3’；R：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCYAGTTTG-3’。PCR擴增程序：94℃變性5min；94℃變性30s，54℃退火20s，72℃延伸30s，執(zhí)行35個循環(huán)；72℃終延伸5min。此外，擴增時設(shè)置陰性對照檢測DNA污染。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，利用AMPure XP Beads(Beckman Coulter，Inc.)進行純化。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(Illumina)連接上測序所需接頭后完成文庫的構(gòu)建。使用高通量測序儀進行2×250bp雙末端測序，測序平臺為華大基因BGISEQ-500RS。根據(jù)標簽序列進行樣品分離，使用solexaQA軟件對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，去除可能存在錯誤的序列(

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品數(shù)據(jù)產(chǎn)出

原始序列經(jīng)拼接、剔除嵌合體、剔除低質(zhì)量序列等操作后生成的去引物后序列數(shù)據(jù)量為602～16775條。稀釋曲線最終趨于平緩，表明樣品測序量足夠、測序深度已經(jīng)基本覆蓋樣品中所有的物種[2]。然而，SZG5比SZG1～SZG4的數(shù)據(jù)量低一個數(shù)量級，該取樣點可能存在實驗操作方面的失誤。

表1 樣品及測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.2 物種注釋結(jié)果

高通量測序結(jié)果共生成164個OTUs。剔除鳥類、哺乳類、微生物、陰性對照及3%閾值下的OTUs后剩余52個OTUs。這52個OTUs中，有48個與NCBI公共數(shù)據(jù)庫參考序列相似度≥99%，成功注釋到種水平。其中，OTU-66為赤魟(Dasyatis akajei)和黃魟(Dasyatis bennetti)的復(fù)合序列，代表了2個種。剩余4個OTUs注釋到屬或科水平。與OTU-66類似，OTU-10與鈍尾鰕虎魚屬(Amblychaeturichthys)和矛尾鰕虎魚屬(Chaeturichthys)內(nèi)的多個物種有相同的序列相似度，只能粗略確定該物種的階元。

2.3 環(huán)境DNA結(jié)果與本底資料的比較

海底世界軟骨魚缸共紀錄有25種魚類，環(huán)境DNA技術(shù)檢測出了其中的23種，名單見表2，有2種魚類——三點鯧和鉸口鯊(Ginglymostoma cirratum)未被檢測出。此外，環(huán)境DNA還檢測出30種其它魚類的存在：其中有7種來自海底世界其它缸，23種來源未知或不確定。由于海底世界魚種買入時未進行稱重處理，無生物量相關(guān)信息，因此本研究不做關(guān)于“序列豐度-生物量”方面的定量分析。

表2 高通量測序OTUs物種注釋結(jié)果

續(xù)表 高通量測序OTUs物種注釋結(jié)果

3 討論

3.1 環(huán)境DNA技術(shù)的高靈敏度

海底世界軟骨魚缸25種魚類中，環(huán)境DNA技術(shù)初步檢測出了其中的23種?；谛螒B(tài)鑒定的目標種“三點鯧”學(xué)名不明，且除OTU-52外剩余155個OTUs未比對到潛在的鯧亞目(Stromateoidei)物種，因此“三點鯧”可能鑒定有錯誤或?qū)嶋H并不存在于軟骨魚缸中。基于形態(tài)學(xué)鑒定的鉸口鯊(Ginglymostoma cirratum)可能也有錯誤：根據(jù)Fishbase(https://www.fishbase.se/search.php)物種分布圖可知，鉸口鯊主要分布在北美大西洋沿岸，其在西北太平洋沒有分布紀錄。環(huán)境DNA比對結(jié)果顯示，OTU-50與鉸口鯊的參考序列相似度僅96%，但與銹須鯊(Nebrius ferrugineus)參考序列相似度高達100%。同時，這2種軟骨魚類皆屬于絞口鯊科(Ginglymostomatidae)[8]。目前該科名下僅3種魚類，是比較小的一個科，關(guān)于該科物種分類也有爭議，因此鉸口鯊形態(tài)鑒定錯誤的可能性較大[8]?？傮w而言，基于環(huán)境DNA分析技術(shù)的目標物種檢出率約為92%。此檢出率與Miya在沖繩美之海水族館調(diào)查結(jié)果接近[3]，但高于舞鶴灣的魚類檢出率(54.8%)[7]。環(huán)境DNA不僅可靈敏地進行水體中的魚類多樣性鑒定，而且可以檢驗部分魚類的形態(tài)鑒定結(jié)果。

3.2 生物信息學(xué)分析過程中物種剔除的重要性

海底世界軟骨魚缸目標魚類僅25種，但環(huán)境DNA實際擴增出的OTUs個數(shù)多達156個，表明基于MiFish引物的環(huán)境DNA高通量測序極易擴增出氣溶膠等介質(zhì)中的線粒體片段，使結(jié)果中出現(xiàn)大量細菌、鳥類、哺乳類等類群的OTUs[9]。故陰性對照中出現(xiàn)的魚種在后續(xù)分析過程中都要剔除，否則會影響結(jié)果的準確性。但僅剔除陰性對照中出現(xiàn)的物種仍會致使大量非目標物種殘留于結(jié)果中，需對更多的OTUs進行剔除。本研究參照Yamamoto等的建議采用3%剔除閾值[7]，在該剔除閾值下絕大多數(shù)假陽性O(shè)TUs都被成功剔除。剩余的52種OTUs序列數(shù)占總序列數(shù)的98.8%(1522709/1541200)，仍能有效反映環(huán)境DNA樣本的物種情況。本研究的結(jié)果再次表明，樣品在取樣、保存、運輸、測序過程中的污染問題較為嚴重，Yamamoto等提出的3%剔除閾值是合理的[7]。

3.3 環(huán)境DNA技術(shù)的假陽性

假陽性主要原因是污染，這由環(huán)境DNA技術(shù)的高靈敏度導(dǎo)致[3]。在有本底參照資料的情況下，只能確認部分OTUs的來源，如OTU-33錦鯉(Cyprinus carpio haematopterus)、OTU-37舒氏海龍(Syngnathus schlegeli)等7個OTUs來源于海底世界其它缸，暗示海底世界軟骨魚缸可能和其它缸存在水體交換。然而，OTU-10鰕虎魚科未定種1(Gobiidae sp.1)和OTU-61翼魟屬未定種(Pteroplatytrygon sp.)等23個OTU來源未知，無法確認這部分魚類存在于海底世界還是受高通量測序平臺污染產(chǎn)生。因此，本研究的結(jié)果暗示在無本底參考資料的情況下(如對野外開放海域進行魚類多樣性調(diào)查)，很容易將假陽性魚種誤判為水域內(nèi)真實存在的魚種。解決假陽性問題主要依賴以下幾種措施：水樣采集、環(huán)境DNA保存、提取、建庫、測序過程中采取嚴格的隔離措施，防止樣品污染[10]；設(shè)置陰性對照，陰性對照數(shù)目越多，被檢出的假陽性物種就越多，多樣性分析就越準確，環(huán)境DNA實驗的每一步(水樣采集、環(huán)境DNA提取、PCR擴增、測序)最好都設(shè)置陰性對照[3]；設(shè)置較高的物種閾值，二次剔除潛在假陽性結(jié)果[7]。

3.4 環(huán)境DNA技術(shù)的假陰性

假陰性主要由以下原因造成：參考序列缺失，經(jīng)過3%閾值剔除后，最高相似度≤98%的OTUs有4個，此4個OTUs由于無準確參考序列，只能大致確定其所在階元；部分魚種間條形碼片段高度同源[3]，OTU-66同時代表Dasyatis akajei-赤魟和Dasyatis bennetti-黃魟2種魚類，此外OTUs比對過程中發(fā)現(xiàn)，平鲉屬、蝴蝶魚屬、吻鰕虎魚屬、綠鰭魚屬等屬下存在多個物種條形碼參考序列100%相似的情況，若無本底參考資料，則很容易出現(xiàn)假陰性誤判；部分物種擴增效率低、檢測結(jié)果具有偶然性，MiFish對硬骨魚類擴增效率較高，對軟骨魚類則適用性很差[3]。因此，后續(xù)需進行通用引物的改進工作[11]。

4 結(jié)論

基于MiFish引物的環(huán)境DNA技術(shù)靈敏度高、物種檢出率高，可基本滿足魚類多樣性研究需求。但是，環(huán)境DNA樣品易被氣溶膠污染及產(chǎn)生錯誤擴增，因此務(wù)必增加陰性對照以提高結(jié)果準確性。此外，在具體海域開展魚類多樣性調(diào)查前需建立本地參考數(shù)據(jù)庫，以提高物種注釋的準確性。