李志帥，高 健，陳純琪，郭瑞庭，劉衛(wèi)東,3，韓 旭

(1.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.國(guó)家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308；4.湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 省部共建生物催化與酶工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

聚酯類塑料聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)由對(duì)苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)通過(guò)酯鍵連接而成。它是一種半結(jié)晶熱塑性塑料，由均勻堆積的結(jié)晶區(qū)和隨機(jī)排列的非晶區(qū)組成[1]。PET的合成技術(shù)在1941年首次被申請(qǐng)專利，并于20世紀(jì)50年代初開(kāi)始商業(yè)化[2]，作為紡織工業(yè)的合成聚酯織物以及食品和飲料的包裝材料，PET已成為最重要的大規(guī)模生產(chǎn)的石化塑料之一[3]，大多數(shù)PET制品有較高的結(jié)晶度，具有抵抗力學(xué)和化學(xué)應(yīng)力的耐久性[4]。石油基塑料制品的大規(guī)模生產(chǎn)、大規(guī)模消費(fèi)和廢棄物管理不當(dāng)所造成的氣候變化和環(huán)境污染讓人類社會(huì)面臨前所未有的挑戰(zhàn)[5-8]。近年來(lái)，利用生物技術(shù)進(jìn)行塑料廢棄物的回收利用已成為一個(gè)蓬勃發(fā)展的研究領(lǐng)域，許多研究人員對(duì)PET塑料降解酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析、功能以及酶工程改造研究，獲得了一些有潛在應(yīng)用價(jià)值的高效降解酶[9-10]，并利用相關(guān)酶進(jìn)行了催化反應(yīng)研究嘗試[11-13]，為將塑料廢棄物進(jìn)入低碳再循環(huán)利用鋪平了道路。

1 PET塑料生物降解研究

早在20世紀(jì)70年代初，科學(xué)家開(kāi)始研究塑料垃圾的生物降解[7,14-15]，人們?cè)J(rèn)為熔點(diǎn)超過(guò)260 ℃的PET無(wú)法使用酶促解聚，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)某些來(lái)自真菌的酶可以在高結(jié)晶度的PET材料上誘導(dǎo)表面改性[16]，如，來(lái)自絲狀放線菌(Thermobifidafusca)的角質(zhì)酶TfH(Thermobifidafuscahydrolase)，孵育3周后能讓PET瓶(10%結(jié)晶度)的質(zhì)量損失大于50%[17]。隨著近幾年對(duì)降解酶的進(jìn)一步研究，TfH水解PET的活性已經(jīng)被提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)以上[18]。利用宏基因組方法鑒定出來(lái)的葉枝堆肥角質(zhì)酶LCC[19]也是近期研究的熱點(diǎn)，目前獲得的最好突變體可在10 h內(nèi)以工業(yè)規(guī)模快速解聚非晶化PET廢物，回收的單體可用于合成相關(guān)聚合物，從而將廢棄物進(jìn)入低碳再循環(huán)利用。近期，受關(guān)注較多的是PET降解菌Ideonellasakaiensis201-F6[20]，它能以PET為主要能量和唯一碳源，在30 ℃能將PET分解成小片段——單(2-羥乙基)對(duì)苯二甲酸(MHET)，再將分解后的產(chǎn)物運(yùn)入體內(nèi)進(jìn)一步經(jīng)過(guò)IsMHETase(MHET降解酶)水解，最終轉(zhuǎn)化為T(mén)PA和EG，它們的催化反應(yīng)見(jiàn)圖1。IsPETase和其他具有PET降解活性的酯酶或脂肪酶序列同源性較高，但它在30 ℃下水解PET的活性比其他酯酶或脂肪酶高5.5～120倍[21]。目前已知的催化PET水解酶大多屬于α/β-水解酶家族[22]，α/β-水解酶根據(jù)形成氧陰離子孔的氨基酸不同，可以分為GX型和GGGX型以及Y型[23]，現(xiàn)有的IsPETase等PET降解酶都屬于GX型[24]。

圖1 Ideonella sakaiensis 201-F6 中關(guān)鍵PET降解酶的反應(yīng)

2 PET塑料降解酶的結(jié)構(gòu)

由于酯鍵在天然生物分子(如角質(zhì)和亞角質(zhì))中普遍存在，所以角質(zhì)酶是尋找能解聚合成聚酯酶的起點(diǎn)，目前獲得的能降解PET塑料的酶也主要來(lái)源于能水解酯鍵的脂肪酶、角質(zhì)酶以及水解酶三大類，已有超過(guò)60個(gè)PET塑料降解酶的晶體結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)，詳見(jiàn)表1。

表1 現(xiàn)有PET塑料降解酶結(jié)構(gòu)

將這些不同來(lái)源的PET塑料降解酶的序列通過(guò)MEGA 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2(a)，大部分PET塑料降解酶同源性較為接近。圖2(b)展示了不同來(lái)源的PET塑料降解酶單體結(jié)構(gòu)重疊比對(duì)，可以發(fā)現(xiàn)它們的整體結(jié)構(gòu)折疊基本相同。將這些PET塑料降解酶和來(lái)自Streptemycesefoliatus的脂肪酶(PDB：1JFR)進(jìn)行主鏈均方根(RMSD[55])比較，可以發(fā)現(xiàn)所有比值均低于0.07 nm(表2)，表明它們的主鏈結(jié)構(gòu)一致性很高。這些PET水解酶表現(xiàn)出保守的結(jié)構(gòu)特性，并且可以分類為單個(gè)亞類，第一個(gè)獲得晶體結(jié)構(gòu)的是鏈霉菌來(lái)源的脂肪酶(PDB：1JFR)，該酶比聚酯水解真菌角質(zhì)酶(EC 3.1.1.74)有更短的肽鏈和更緊湊的結(jié)構(gòu)[56]。

表2 不同PET降解酶主鏈結(jié)構(gòu)比對(duì)

1JFR—灰色；7EC8—黃橙色；3VIS—綠色；4CG2—青色；6THT—洋紅；4WFI—黃色；5LUI—橙色；7DS7—深藍(lán)色；5XH3—淺色；6SBN—熱粉色；7DZT—紫羅蘭紫色；7NEI—藍(lán)白色

3 PET塑料降解酶的催化機(jī)制

自從2017年首個(gè)IsPETase的晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道以來(lái)[39]，有許多不同研究組都報(bào)道了IsPETase的晶體結(jié)構(gòu)[40-51]，對(duì)IsPETase結(jié)構(gòu)研究也是PET水解酶里面研究得最多的[57]。IsPETase由261個(gè)氨基酸組成(圖3(a))，屬于典型的α/β-水解酶折疊類結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)中有9個(gè)β-折疊，外圍有7個(gè)α-螺旋，具有保守的催化三聯(lián)體S131-H208-D177和氧陰離子洞穴(Y58、M132)，S131作為親核試劑和H208、D177形成電荷中繼網(wǎng)絡(luò)(圖3(b))，PET塑料降解酶可能的催化機(jī)制見(jiàn)圖3(c)。

IsPETase具有不同于其他PET水解酶的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。它有2個(gè)分子內(nèi)二硫鍵：DS1(C174-C210)和DS2(C244-C260)。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，DS2是這類水解酶共有的，它連接C末端和最后一段loop區(qū)，遠(yuǎn)離催化活性中心，所以DS2不直接參與水解，主要與酶結(jié)構(gòu)的完整性相關(guān)。DS1是IsPETase特有的二硫鍵結(jié)構(gòu)，臨近催化中心，對(duì)催化活性和催化位點(diǎn)的完整性至關(guān)重要，分子動(dòng)力學(xué)模擬證明DS1與活性位點(diǎn)的柔韌性相關(guān)，將其突變后會(huì)使催化三聯(lián)體不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致酶活性幾乎完全喪失[41](圖3(a))。IsPETase底物結(jié)合區(qū)的1個(gè)氨基酸W156側(cè)鏈具有A、B和C這3種構(gòu)型(圖3(b))，底物結(jié)合之后，W156側(cè)鏈被固定為B構(gòu)型，并為底物的結(jié)合提供重要的作用力，W156位點(diǎn)的色氨酸在所有類似酶中是保守的，在其他類似酶中W156側(cè)鏈一般為C構(gòu)型，但這種C構(gòu)型并不利于底物PET結(jié)合，所以其他類似酶對(duì)PET的降解活力較低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，IsPETase中的W156側(cè)鏈能夠擺動(dòng)是因?yàn)槠溧徑牡?85位絲氨酸(S185)，而在其他活力較低的類似酶中都是組氨酸，組氨酸與W156之間的堆疊作用力將W156的側(cè)鏈固定在了C構(gòu)型，所以將IsPETase的S185突變成為組氨酸后，酶對(duì)PET的水解效率顯著降低[39]。IsPETase特有的結(jié)構(gòu)可以維持它對(duì)PET較高活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，一旦將催化三聯(lián)體中的絲氨酸突變成丙氨酸后，活性完全喪失[40,42,58]；如果破壞其二硫鍵DS1會(huì)導(dǎo)致活性降低，Tm值下降10 ℃，表明IsPETase特有的二硫鍵結(jié)構(gòu)對(duì)活性和穩(wěn)定性都至關(guān)重要。若將氧陰離子洞穴中的氨基酸Y58突變后再結(jié)合不同底物(PET膜、PET瓶子和BHET單體)發(fā)現(xiàn)，酶活性降低[47]；氧陰離子洞穴的另一個(gè)氨基酸M132突變成其他氨基酸后同樣會(huì)引起酶活性的降低；擺動(dòng)的W156替換成丙氨酸后也會(huì)引起活性的顯著降低[42,45]。

圖3 IsPETase的晶體結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制

4 PET塑料降解酶的分子改造

一般認(rèn)為，PET水解酶的催化中心在與芳香族底物結(jié)合后會(huì)發(fā)生局部動(dòng)態(tài)變化，所以在獲得酶的結(jié)構(gòu)后，許多研究工作都集中在活性區(qū)域。IsPETase中擺動(dòng)的W156，在許多其他已知的PET水解酶中也是保守的，該殘基的取代通常導(dǎo)致對(duì)PET的水解活性顯著降低，Chen等[50]發(fā)現(xiàn)S185和I189獨(dú)特地存在于IsPETase中，可以減少W156的空間位阻(圖4)，因此使吲哚側(cè)鏈具有更高的柔韌性，以提高聚合物的水解速率。在同源的聚酯水解酶中引入相應(yīng)的雙殘基取代可提高PET水解活性。底物結(jié)合區(qū)附近的氨基酸也會(huì)影響酶活性，將IsPETase的I179、W130和T59分別突變?yōu)楸彼岷蟀l(fā)現(xiàn)，酶活性顯著降低，說(shuō)明這些氨基酸對(duì)催化很重要[39-40]。他們對(duì)底物結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ區(qū)的氨基酸也進(jìn)行了突變(圖4)后發(fā)現(xiàn)，S209A和N212A突變的酶活性顯著降低。Son等[44]研究發(fā)現(xiàn)，P152A突變導(dǎo)致酶在30和40 ℃下活性降低，但Tm比野生型IsPETase的高0.5 ℃，解析IsPETaseP152A的結(jié)構(gòu)(PDB：6IJ5)發(fā)現(xiàn)催化位點(diǎn)D177從H208殘基轉(zhuǎn)移開(kāi)，證實(shí)突變導(dǎo)致催化位點(diǎn)塌陷[44]。將IsPETase結(jié)合位點(diǎn)變?yōu)楦窠琴|(zhì)酶的活性位點(diǎn)(S209F/W130H)，突變體的活性提高了1～2倍，F(xiàn)209可能是通過(guò)芳香族相互作用來(lái)穩(wěn)定底物和活性部位[42]。

由于PET降解酶降解的是高聚長(zhǎng)鏈化合物，所以PET降解酶中離活性中心略遠(yuǎn)的氨基酸殘基也可能影響催化作用，或與蛋白表面其他的氨基酸殘基有相互作用，但這需要通過(guò)了解長(zhǎng)鏈PET特定的結(jié)合構(gòu)象才能確定?？拷繕?biāo)酯鍵的長(zhǎng)鏈聚合物需要足夠的空間，才能通過(guò)催化位點(diǎn)絲氨酸的初始親核攻擊形成四面體的催化中間體[59]。迄今為止，并沒(méi)有長(zhǎng)鏈底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)被解析，僅僅有很少的PET水解酶和產(chǎn)物單體類似物復(fù)合體結(jié)構(gòu)被研究，所以Joo等[40]利用分子對(duì)接以及分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法來(lái)研究結(jié)合口袋中底物和催化三聯(lián)體的作用。他們通過(guò)對(duì)較長(zhǎng)底物2-HE(MHET)與IsPETase的對(duì)接實(shí)驗(yàn)，推測(cè)了長(zhǎng)鏈底物在酶表面可能的結(jié)合位置，較長(zhǎng)的分子在酶表面通過(guò)疏水作用形成一個(gè)約4 nm的長(zhǎng)且淺的L形裂縫，結(jié)合位點(diǎn)分為2個(gè)亞位點(diǎn)，亞位點(diǎn)I結(jié)合1個(gè)MHET，結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ結(jié)合3個(gè)MHET。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，距離催化中心約2.3 nm的R251在底物結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ區(qū)(圖4)，呈現(xiàn)突出狀，影響底物PET的結(jié)合。如果將R251突變成丙氨酸后，突變酶18和36 h對(duì)PET膜的活性比野生型對(duì)PET膜的活性分別提高了22.4%和32.4%；由所得到的蛋白結(jié)構(gòu)(PDB：5YNS)發(fā)現(xiàn)丙氨酸提供了一個(gè)疏水且不突出的裂縫，由此可見(jiàn)，遠(yuǎn)離活性部位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)變化可能會(huì)影響酶的活性[24,44]。IsPETase比同源的角質(zhì)酶和酯酶具有更開(kāi)放的活性位點(diǎn)裂縫，通過(guò)改造還可以降解另一種新興的生物衍生PET替代品，聚乙烯-2,5-呋喃二甲酸酯(PEF)[58]。IsPETase突變體S64M、W130F和N212F可以提高萘酯降解性能，對(duì)它們的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這些突變改變了疏水性，降低了酶特異性的空間效應(yīng)[43]。已報(bào)道的基于IsPETase結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵改造位點(diǎn)如圖4所示，大部分改造都集中于底物結(jié)合的Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)，許多有益突變位于帶正電荷的Ⅱ區(qū)[27]，說(shuō)明Ⅱ區(qū)與底物的結(jié)合有關(guān)。

圖4 IsPETase中已知的關(guān)鍵改造位點(diǎn)

PET材料自身較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度要求水解酶具有較高的熱穩(wěn)定性[43]，因此在解聚中使用嗜熱且熱穩(wěn)定性良好的酶有明顯的優(yōu)勢(shì)[10]。野生型IsPETase的熔融溫度(Tm)為48.81 ℃[47]，但其在環(huán)境溫度下具有較高的PET水解活性，這可能是由于其更靈活和開(kāi)放的底物結(jié)合裂縫所致[58]。所以許多研究者通過(guò)酶工程對(duì)IsPETase進(jìn)行改造來(lái)提高其熱穩(wěn)定性[43]，在二價(jià)離子(如Ca2+或Mg2+)存在下，許多細(xì)菌來(lái)源的PET水解酶的整體熱穩(wěn)定性得到改善，Tm增加10～16 ℃，或最適溫度提高10 ℃。基于共結(jié)晶結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)力學(xué)模擬，Baker等[60]發(fā)現(xiàn)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)可能接近催化三聯(lián)體，并且通過(guò)與Ca2+的相互作用來(lái)控制底物結(jié)合過(guò)程，活性位點(diǎn)會(huì)存在打開(kāi)和關(guān)閉的狀態(tài)，由于反應(yīng)過(guò)程中Ca2+會(huì)和苯二甲酸酯產(chǎn)生不溶性副產(chǎn)物[60]，所以不能完全依賴鈣鹽來(lái)實(shí)現(xiàn)工業(yè)級(jí)高降解效率，但可通過(guò)定制生物催化劑使Ca2+結(jié)合位點(diǎn)最小化，如通過(guò)鹽橋或二硫鍵取代一個(gè)主要的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，如來(lái)自Thermobifidafusca的TfCut2，按此方法獲得的突變體Tm提高了25 ℃，并通過(guò)蛋白質(zhì)晶體學(xué)驗(yàn)證了二硫鍵的形成[61-62]。在另外一個(gè)PET塑料降解酶PET2中，也用同樣策略引入并確證了二硫鍵的存在，但Tm僅僅提高了3.1 ℃[27]。通過(guò)與熱穩(wěn)定性較高的TfCut2等酶結(jié)構(gòu)的比較發(fā)現(xiàn)，改造獲得IsPETaseS92D/D157H雙突變體的Tm比野生型提高了8 ℃[47]，這些氨基酸可能形成額外的氫鍵來(lái)提高β6～β7連接環(huán)的穩(wěn)定性，在40 ℃下，24和72 h的催化活性分別提高4.7和6.0倍。研究者將這些發(fā)現(xiàn)相結(jié)合，設(shè)計(jì)了2個(gè)三重突變體S92D/D157H/R251A和S92E/D157H/R251A，2個(gè)突變體的Tm值分別為56.41和57.62 ℃，比野生型IsPETase的提高了7.60和8.81 ℃，2個(gè)突變體的活性也比野生型的有所提高，在30 ℃下24和72 h的酶活性分別提高了4.3和5.2倍，在40 ℃下24和72 h的酶活性分別增加了9.1和13.9倍。但四突變體S92E/D157H/N217D/251A的酶活性和熱穩(wěn)定性都降低。另一個(gè)四突變體S92E/D157H/S213T/N217D(PDB：6KUS)的酶活性和Tm都高于IsPETase的，37 ℃下酶活性是野生型的58倍[47]。基于IsPETase結(jié)構(gòu)改造獲得的突變體ThermoPETase(92E/D157H/R251A)，40 ℃下活性也提高了14倍，Tm比野生型的提高8.8 ℃[44]。

除了上述基于酶結(jié)構(gòu)的改造外，近期比較受關(guān)注的其他技術(shù)，如人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)等技術(shù)，也被用于PET塑料降解酶的改造?；谪澙贩e累策略方法獲得的DuraPETase是具有10個(gè)氨基酸突變的IsPETase突變體(A185H/I139R/W130H/S159Q/R251A/A151I/G136A/Q80Y/L88F/T111D)，比野生型IsPETase的Tm大幅度增加(達(dá)31 ℃)，對(duì)高結(jié)晶度PET粉末水解活性也超過(guò)了300倍[48]。通過(guò)基于機(jī)器學(xué)習(xí)并應(yīng)用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練穩(wěn)定性優(yōu)化，獲得DuraPETase+N204K突變體，Tm進(jìn)一步提高至83.5 ℃，是目前Tm最高的IsPETase突變體[63]。

定向進(jìn)化也被用于塑料降解酶性能的提升，通過(guò)篩選基于易錯(cuò)PCR的隨機(jī)IsPETase文庫(kù)，對(duì)超過(guò)13 000個(gè)IsPETase的突變體進(jìn)行評(píng)估，將高溫下的催化活性作為主要選擇指標(biāo)，與野生型IsPETase相比，獲得了21個(gè)突變的HotPETase變體(ThermoPETase+N204C/S253C/P152V/S178R/S185Y/Q90K/S184E/R61T/Q153M/N183K/R195L/S29A/S32V/K66N/M125G/N212C/K223M/T241Q)，Tm則提高至82.5 ℃[64]?；贛eng等[65]開(kāi)發(fā)的自然序列進(jìn)化的突變?cè)O(shè)計(jì)工具Premuse，篩選到了穩(wěn)定性較高的IsPETase突變體W130H/F200Y，雙突變體在40 ℃下24 h降解無(wú)定形PET膜片的效率比野生型的提高了近40倍。

不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的酶，因?yàn)楹罄m(xù)翻譯修飾系統(tǒng)不同，對(duì)酶的性能也可能會(huì)產(chǎn)生影響，當(dāng)PET水解酶在除大腸桿菌以外的宿主(例如枯草芽孢桿菌或巴斯德畢赤酵母)中表達(dá)時(shí)，熱穩(wěn)定性也有可能增強(qiáng)，如LCC分別在枯草芽孢桿菌和巴斯德畢赤酵母中表達(dá)，糖基化程度增加，Tm比在大腸桿菌中表達(dá)分別增加了4和12 ℃[66]。在畢赤酵母中表達(dá)的IsPETase活性可以提高36倍[67]。除了Pseudomonasputida、Escherichiacoli和Pichiapastoris等底盤(pán)之外，Ideonellasakaiensis也成為新興的可用作基因工程底盤(pán)的菌株[68]。光合微藻(Phaeodactylumtricornutum)也被設(shè)計(jì)用于功能性表達(dá)IsPETase，并能夠在21～30 ℃的咸水環(huán)境中降解選定的PET相關(guān)材料，是受PET微塑料污染海水的潛在生物修復(fù)載體[69]?？偨Y(jié)已報(bào)道的IsPETase的性能見(jiàn)表3。

表3 IsPETase突變體性能比較

5 PET塑料降解酶的催化過(guò)程強(qiáng)化

與天然聚合物降解酶(如纖維素酶)類似，酶促聚酯水解優(yōu)先發(fā)生在無(wú)定形部分，而不是良好有序的結(jié)晶區(qū)域[70]，特定的酶可以降低聚合物的結(jié)晶度，如在天然纖維素酶系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的使纖維素去結(jié)晶的酶[71]，特異性的聚合物結(jié)合模塊添加到反應(yīng)混合物中或與適當(dāng)?shù)慕到饷溉诤?，均有機(jī)會(huì)提升降解酶的活性。來(lái)自Cellulomonasfimi的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CenA)和來(lái)自里氏木霉的纖維二糖水解酶I的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM)[72]、來(lái)自糞產(chǎn)堿桿菌的PHA解聚酶的聚羥基鏈烷酸酯(PHA)結(jié)合模塊[73]、來(lái)自ChitinolyticbactermeiyuanensisSYBCH194的幾丁質(zhì)酶CmChi1的幾丁質(zhì)結(jié)合模塊和PET降解酶融合表達(dá)都能提高降解性能[74-75]。將來(lái)自白腐真菌Pycnoporuscoccineus(PcAA14A)的裂解多糖單加氧酶(LPMO)[76]和兩性離子聚合物(Ekylation，帶正電荷的賴氨酸和帶負(fù)電荷的谷氨酸)[77]加入IsPETase中，都可以提高酶對(duì)PET的降解性能，它們可能是通過(guò)與疏水蛋白或其他結(jié)合模塊不同的機(jī)制促進(jìn)酶促降解。生物催化水解不能從根本上破壞有序的結(jié)晶PET[70]，但氧化酶可能具有與木質(zhì)素、纖維素降解系統(tǒng)中已知的LPMO相同的功能，可以為聚酯去結(jié)晶度的開(kāi)發(fā)提供進(jìn)一步的選擇，具有酶促紡織品回收方面的應(yīng)用潛力。

強(qiáng)化PET塑料降解酶的催化過(guò)程，還可以從解除反應(yīng)底物抑制方面著手。對(duì)苯二甲酸單(2-羥乙基)酯(MHET)和對(duì)苯二甲酸雙(2-羥乙基)酯(BHET)是PET降解的中間體，會(huì)抑制許多PET水解酶解聚催化的效率[78-81]。MHET具有強(qiáng)抑制作用，幾乎不能被野生型IsPETase水解酶水解，而Ideonellasakaiensis產(chǎn)生獨(dú)特的IsMHETase水解MHET，產(chǎn)生TPA和EG[20]，這2種不同酶類(IsPETase和IsMHETase)可以串聯(lián)起來(lái)進(jìn)行聚合物降解，有助于它們?cè)赑ET廢棄物有效生物循環(huán)中的應(yīng)用。Knott等[82]建立了一種嵌合雙酶系統(tǒng)，將IsPETase和IsMHETase連接，使得PET降解效率提高至少2.8倍；并鑒定了來(lái)自Comamonasthiooxydans和Hydrogenophagasp.PML113116的具有MHETase酶類似的結(jié)構(gòu)[82]，但它們對(duì)MHET的底物親和力顯著低于IsMHETase。目前對(duì)這些技術(shù)瓶頸，提出了其他技術(shù)解決方案，例如使用不易受產(chǎn)物抑制的酶突變體[83]或用能滲透去除抑制劑的膜反應(yīng)器。這種催化特性可以和其他解聚酶的特性進(jìn)行組合，用于基于全細(xì)胞的多種酶系統(tǒng)[84]，以達(dá)到PET生物降解的目的。

6 結(jié)論與展望

在過(guò)去二十年中，PET的生物催化降解已從數(shù)周培養(yǎng)后有微量釋放的單體發(fā)展到數(shù)小時(shí)內(nèi)完成高效的塑料解聚，科學(xué)家們已經(jīng)成功地鑒定和制造了符合工業(yè)和商業(yè)規(guī)模的PET廢棄物解聚需求的生物催化劑[85]。未來(lái)可以利用生物催化劑降解塑料PET生成單體TPA和EG，然后利用產(chǎn)物TPA重新合成PET塑料，實(shí)現(xiàn)PET塑料的綠色循環(huán)利用。但如何高效回收TPA單體，將其循環(huán)利用生成高價(jià)值的PET再生塑料，仍是PET生物降解回收的瓶頸問(wèn)題。由于大規(guī)模測(cè)序數(shù)據(jù)的持續(xù)增長(zhǎng)，可從基因組和宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中探索其他新型PET水解酶[86]，更多的PET水解酶序列數(shù)據(jù)被挖掘。通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和祖先序列重建，探索的序列空間也可用于預(yù)測(cè)具有改進(jìn)特性的酶。強(qiáng)大的基于序列的方法和全自動(dòng)計(jì)算工作流程設(shè)計(jì)軟件如FireProtASR等[87]，可以幫助研究人員通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索確定更多的PET水解酶。未來(lái)的研究主要在于拓展對(duì)PET生物降解的理解，以應(yīng)對(duì)與其他塑料(如聚烯烴)或更類似的塑料(如聚酰胺(PA)和聚氨酯(PUR))與可水解骨架的生物技術(shù)降解相關(guān)的挑戰(zhàn)。這些廢棄物不能通過(guò)工業(yè)規(guī)模的其他處理方法有效回收，而新型生物催化劑的組合可以為未分類的混合塑料廢棄物的可循環(huán)利用鋪平道路。