黃素君（上饒市人民醫(yī)院藥學(xué)部，江西 上饒 334000）

病毒、軍團(tuán)菌、曲霉菌、肺孢子菌等病原體是重癥肺炎（SP）主要的致病微生物［1-2］。重癥肺炎患者可出現(xiàn)低氧血癥或急性呼吸衰竭，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡，因此應(yīng)積極治療。采用抗生素進(jìn)行抗感染治療是該病主要的治療手段，明確病原體后選擇敏感抗生素是關(guān)鍵一步。目前，采集患者的痰液或肺泡灌洗液（BALF）或血液進(jìn)行分離培養(yǎng)一直是臨床確診病原體感染采用的方法［3］，但傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)檢出病原體的耗時(shí)長(zhǎng)、檢出率低，難以進(jìn)行快速診斷。臨床醫(yī)師在未明確感染病原體時(shí)多采取經(jīng)驗(yàn)性用藥治療，治療SP的效果有限［4］?；驒z測(cè)的敏感性高，且不受抗生素應(yīng)用的影響，現(xiàn)已成為微生物檢測(cè)研究的熱點(diǎn)。宏基因組學(xué)測(cè)序（mNGS）在得到宏基因組的核酸序列后利用生物信息學(xué)工具分析得到的核酸序列，可明確病原體核酸序列的微生物信息，現(xiàn)臨床在中樞神經(jīng)感染、不明原因發(fā)熱病原體中應(yīng)用較多［5-6］。mNGS檢測(cè)能用于患者致病病原體的早期確定，可指導(dǎo)臨床藥師選擇抗菌藥物的應(yīng)用。這種由臨床藥師參與的mNGS下指導(dǎo)SP患者的抗感染方案制定，或能提高抗感染治療效果，降低肺部炎癥，從而加快患者的康復(fù)出院?；诖?，本研究將探討臨床藥師參與mNGS下SP抗感染治療的效果。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年5月至2022年1月我院收治的SP患者60例，隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組各30例。對(duì)照組中男14例、女16例；年齡60～77（69.80±6.41）歲；標(biāo)本類型：痰液5例、肺泡灌洗液15例、靜脈血10例；治療情況：已用抗生素治療24例、未用抗生素6例。觀察組中男18例、女12例；年齡61～78（69.72±6.70）歲；標(biāo)本類型：痰液6例、肺泡灌洗液13例、靜脈血11例；治療情況：已用抗生素治療26例、未用抗生素4例。兩組患者性別、年齡、標(biāo)本類型等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合SP的診斷［7］；（2）患者有發(fā)熱癥狀；（3）肺實(shí)變體征或聞及濕性啰音；（4）年齡18～80歲；（5）患者及家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入組前已確診為肺結(jié)核；（2）合并血液疾病；（3）合并惡性腫瘤者；（4）自身免疫性疾病。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本取樣類型及注意事項(xiàng) （1）BALF：患者入院后即行BALF，留取10～20 ml灌洗液行細(xì)菌檢查培養(yǎng)及mNGS檢測(cè)。（2）或采集三個(gè)不同部位的靜脈血進(jìn)行血培養(yǎng)，（3）或采集患者痰液：取痰標(biāo)本前需漱口以清潔口腔，取深咳出的痰液，痰液不能留唾液，標(biāo)本放在標(biāo)本盒中，注意不要污染，盡快送檢。

1.3.2 對(duì)照組 留取合適的標(biāo)本進(jìn)行病原微生物培養(yǎng)以指導(dǎo)臨床治療。（1）BALF按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)與分離；（2）血液標(biāo)本按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分離培養(yǎng)；（3）痰液標(biāo)本按照《痰培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序》進(jìn)行分離培養(yǎng)。對(duì)于培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本使用珠海迪爾DL-96全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析儀進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定和藥敏試驗(yàn)。臨床醫(yī)師根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果及細(xì)菌藥敏試驗(yàn)制定抗感染治療方案。

1.3.3 觀察組 在留取合適的標(biāo)本進(jìn)行mNGS以指導(dǎo)臨床抗感染治療。（1）血液樣本處理和DNA提取，采集3 ml抗凝血液，離心后取300μl血漿，參考廣州吉賽生物科技股份有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作。（2）呼吸道樣本處理和DNA提?。喝√狄夯駼ALF 0.5～3 ml，參考賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作。（3）將提取的DNA用作DNA文庫(kù)構(gòu)建，并采用BGIsEQ-5（華大基因）測(cè)序。（4）測(cè)序結(jié)束后去除低質(zhì)量及長(zhǎng)度不足的數(shù)據(jù)，參考基因組序列的數(shù)據(jù)，與專用的微生物大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定感染病原體。（5）臨床藥師和臨床醫(yī)生根據(jù)患者的臨床特征和mNGS報(bào)告明確致病菌，制定明確有效的抗感染治療方案。均觀察至患者出院。

1.4 臨床觀察指標(biāo) （1）比較兩組治療效果；（2）病原體檢出陽(yáng)性率。（3）記錄患者的住院天數(shù)。（4）炎癥控制情況：治療前、治療5 d后，采集患者的靜脈全血，取全血樣本采用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（mindray BC-6800PLUS）檢測(cè)白細(xì)胞（WBC）水平，并采集靜脈全血，離心后取血清樣本，使用全自動(dòng)生化分析儀（ADVIA2400）檢測(cè)C反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）水平。并記錄患者抗感染治療前、5 d后的體溫。

1.5 療效判定標(biāo)準(zhǔn)［8］于治療10 d后評(píng)價(jià)。治愈：血清炎癥指標(biāo)及體溫恢復(fù)正常范圍，及胸部CT檢查提示炎癥完全吸收或大部分吸收，患者自主呼吸良好，完全脫離呼吸機(jī)；好轉(zhuǎn)：血清炎癥指標(biāo)較治療前明顯下降，肺部CT檢查顯示肺部感染面積下降，可脫離呼吸機(jī)，在導(dǎo)管下吸氧可恢復(fù)血氧飽和度等指標(biāo)。無(wú)效：血液檢查指標(biāo)及影像學(xué)檢查指標(biāo)均未改善，需在呼吸機(jī)下輔助呼吸?？傆行?（治愈+好轉(zhuǎn)）/總例數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用（±s）表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（百分率）表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療效果比較 觀察組治療總有效率為93.33%，高于對(duì)照組的73.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組治療效果比較［n(%)］

2.2 兩組病原體檢出陽(yáng)性率比較 對(duì)照組病原體檢出陽(yáng)性有17例，占比56.67%，觀察組原菌檢出陽(yáng)性有27例，占比90.00%。觀察組的病原體檢出陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 兩組住院天數(shù)、炎癥控制情況、體溫比較 治療前，兩組患者的WBC、CRP、PCT、體溫比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療5 d后，觀察組WBC、CRP、PCT低于對(duì)照組，體溫低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組住院天數(shù)短于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組住院天數(shù)、炎癥控制情況、體溫比較（±s）

表2 兩組住院天數(shù)、炎癥控制情況、體溫比較（±s）

注：與同組治療前比較，*P＜0.05。

組別 n WBC（×109/L） CRP（mg/L） PCT（μg/L） 體溫（℃） 住院天數(shù)（d）治療前 治療5 d后 治療前 治療5 d后 治療前 治療5 d后 治療前 治療5 d后對(duì)照組觀察組t P 30 30 18.50±1.47 17.89±1.25 1.731 0.089 10.33±2.55*7.40±1.04*5.827＜0.001 92.46±11.04 91.71±10.37 0.271 0.787 50.21±6.12*42.34±5.31*5.320＜0.001 16.49±2.18 15.49±2.80 1.543 0.129 8.40±1.21*7.31±1.05*3.727＜0.001 38.56±0.34 38.42±0.30 1.691 0.096 37.70±0.33*37.43±0.32*3.217 0.002 14.61±2.37 12.56±2.01 3.613 0.001

3 討論

SP屬于危重癥，疾病惡化可引起器官功能障礙或危及生命。引起SP可有細(xì)菌、病毒和真菌感染［9］，不同病原體感染的治療藥物不同，明確感染病原體后給予抗感染治療是患者康復(fù)的關(guān)鍵。微生物實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果一直是臨床常規(guī)選擇明確病原體感染的方式，但細(xì)菌培養(yǎng)耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，且分離培養(yǎng)存在敏感性、特異性、時(shí)效性、信息量不足的問題。由于無(wú)法快速明確感染病原體，以及病原體的檢出率受抗生素用藥的影響，使得常規(guī)病原體檢出方法對(duì)于治療臨床用藥的效果局限，臨床醫(yī)師多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)性用藥，危重癥患者難以做到早期精準(zhǔn)治療，使得SP治療有效率欠佳［10］，還可能加重抗生素濫用的問題。提高病原體檢出的精準(zhǔn)度和效率是病原微生物檢出的主要目標(biāo)。mNGS不依賴于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)，可對(duì)標(biāo)本進(jìn)行無(wú)差別測(cè)序和生物信息分析，快速精準(zhǔn)的病原學(xué)診斷有助于臨床藥師及醫(yī)師及時(shí)調(diào)整用藥方案，并選擇敏感抗生素進(jìn)行治療，以期能提高抗感染的治療效果。

本研究發(fā)現(xiàn)mNGS可快速、準(zhǔn)確診斷出SP患者感染病原體，臨床藥師參考診斷結(jié)果指導(dǎo)臨床醫(yī)師準(zhǔn)確用藥，從而提高抗感染治療的效果，有效降低SP患者的機(jī)體炎癥，促進(jìn)患者康復(fù)出院。這一發(fā)現(xiàn)與賈建超、賈建敏等［11］研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了mNGS在感染性疾病中的應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)分析認(rèn)為：首先，mNGS利用二代測(cè)序技術(shù)獲取樣本中所有核酸片段的序列信息，可得到標(biāo)本中含量較低、甚至是痕量病原體的信息［12］。然后經(jīng)生物信息比對(duì)可快速確定目標(biāo)病原體。此外，還可檢出無(wú)法培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的病原體，表明這種直接進(jìn)行基因提取方法相較于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)的靈敏度高。臨床藥師結(jié)合患者的臨床特點(diǎn)及藥學(xué)專業(yè)知識(shí)提出個(gè)性化的藥學(xué)建議，以在早期精準(zhǔn)選擇合適的抗感染藥物，準(zhǔn)確指導(dǎo)臨床治療。從而利于患者肺部炎癥的控制，緩解臨床癥狀及體征，促進(jìn)康復(fù)出院。另有研究表示［13-14］，mNGS這種高通量測(cè)序方法無(wú)需特異性擴(kuò)增，可快速、客觀檢出臨床樣本中的微生物，在危急、重癥感染疾病中應(yīng)用具有重要意義，但痰液標(biāo)本極易受到口腔正常菌群、共生菌的污染，因此需重視檢測(cè)的標(biāo)本前處理。

綜上所述，mNGS技術(shù)可快速、準(zhǔn)確診斷出引起SP感染的病原體，有助于臨床藥師指導(dǎo)臨床醫(yī)師準(zhǔn)確用藥，從而提高抗感染治療的效果，并有效降低SP患者的機(jī)體炎癥，促進(jìn)患者的癥狀體征恢復(fù)。但目前mNGS在臨床的推廣應(yīng)用仍存在一些問題，一方面在于目前病原體的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)尚不完善，難以囊括所有微生物；另外，mNGS分析的成本高，且對(duì)檢測(cè)的技術(shù)水平要求較高，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中難以推廣應(yīng)用，也存在無(wú)法自動(dòng)化檢測(cè)的問題。另一方面在于這種技術(shù)無(wú)法鑒別定植菌與致病菌，而這可一定程度感染結(jié)果的判讀。