彭 鵬，張金秀，李夢詩，覃蒙斌，孫 娟，吳晴茹，程若溪，劉詩權(quán)，黃杰安

(廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西南寧 530007)

結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是一種常見的消化道腫瘤。在全球人類腫瘤中，結(jié)直腸癌的總發(fā)病率排名第三，死亡率排名第二。雖然多種治療手段可應(yīng)用于結(jié)直腸癌的治療，但是其預(yù)后仍然不理想，尤其是在疾病晚期[1]。因此，研究結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制和尋找更有效的生物分子標記物具有重要意義。Tricellulin，也稱為TRIC、MARVELD2，是2005年科學家通過免疫電鏡技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)的存在于三細胞連接處的緊密連接蛋白，是第一個被發(fā)現(xiàn)的分布于三細胞連接處的分子[2]。它為細胞最終構(gòu)成各種立體結(jié)構(gòu)提供支點，是構(gòu)成和維持細胞間黏附功能的重要結(jié)構(gòu)[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，tricellulin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有可能成為評估腫瘤進展和治療的新靶點[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，tricellulin在結(jié)直腸癌組織中高表達，且與結(jié)直腸癌腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]，但是其中的分子機制尚不清楚。血管生成是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素之一。血管內(nèi)皮細胞是構(gòu)成血管內(nèi)膜的基本元素，在血管新生過程中起決定作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在介導腫瘤血管新生、轉(zhuǎn)移和侵襲等過程中發(fā)揮重要作用。因此，研究tricellulin和內(nèi)皮細胞的聯(lián)系對于探索其與腫瘤血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移具有重要作用。本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細胞HCT116過表達tricellulin，檢測轉(zhuǎn)染前后結(jié)直腸癌細胞MMP2、MMP7的表達及侵襲能力的變化，檢測轉(zhuǎn)染前后細胞上清液對人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC侵襲能力的影響，以探索tricellulin影響結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與慢病毒載體

人結(jié)直腸癌細胞株HCT-116、SW620、HCT8，正常人結(jié)腸黏膜上皮細胞系NCM460，人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC均購于中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞資源中心。根據(jù)tricellulin基因(GeneID：NM_001038603.2)設(shè)計的重組慢病毒過表達載體LV-tricellulin和空載體LV-GFP(陰性對照)購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器

CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國賽默飛世爾科技公司；移液器購自德國epppendorf公司；倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；垂直電泳儀、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；Odyssey雙色紅外熒光成像儀購自美國LI-COR公司。

1.1.3 主要材料與試劑

Transwell小室、細胞培養(yǎng)皿及24孔細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液(100×)購自北京索萊寶科技有限公司；結(jié)晶紫購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；tricellulin兔抗人多克隆抗體購自美國賽默飛世爾科技公司；GAPDH抗體購自美國Proteintech Group公司；IRDye?680RD Goat anti-Rabbit購自美國LI-COR公司；硝酸纖維素膜購自美國Millipore公司；Matrigel膠購自美國B&D公司；嘌呤霉素購自北京索萊寶科技有限公司；MMP2、MMP7 ELISA kits購于美國CLOUD-CLONE公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人結(jié)直腸癌細胞株HCT-116、SW620、HCT8，正常人結(jié)腸黏膜上皮細胞系NCM460以及人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC分別用含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染

選取處于對數(shù)生長期的HCT116細胞進行慢病毒轉(zhuǎn)染，待細胞鋪滿孔50%時，按照說明書將編碼人tricellulin的過表達慢病毒載體(TRIC-OE)及空載慢病毒(NC)分別轉(zhuǎn)染HCT116細胞，運用嘌呤霉素篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。采用western blot驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 Western blot

將40 μg細胞蛋白和上樣緩沖液混合并變性后，上樣在12%分離膠/5%積層膠上進行SDS-PAGE。應(yīng)用電轉(zhuǎn)移將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，濾膜經(jīng)5%脫脂奶粉-TBS溶液于室溫封閉1 h后，一抗孵育過夜。濾膜經(jīng)TBST緩沖液清洗3次后，再與熒光二抗于室溫孵育1 h。濾膜經(jīng)TBST緩沖液清洗3次后，應(yīng)用Odyssey 雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)顯影。GAPDH設(shè)置為內(nèi)參對照。

1.2.4 Transwell小室檢測HCT116細胞侵襲能力

將Matrigel膠用無血清DMEM培養(yǎng)基按照1∶8的比例稀釋，吸取50 μL鋪于上室，將鋪好的基質(zhì)膠放置到4℃冰箱包被過夜。分別將TRIC-OE、NC組細胞懸液種在上室，下室加入含20%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基，放置到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用適量甲醇將小室底膜上的細胞固定后置于0.1%結(jié)晶紫中染色。清洗后倒置風干，倒置顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照計數(shù)。

1.2.5 Transwell小室檢測TRIC-OE上清液對HUVEC細胞侵襲能力的影響

TRIC-OE在10 cm培養(yǎng)皿中長至約80%匯合度時，換成6 mL新鮮的完全培養(yǎng)基。24 h后收集細胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心5 min后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的15 mL離心管中。使用TRIC-OE上清液配制條件培養(yǎng)基(TRIC-OE-CM)，上清液∶20%FBS=8∶2。當HUVEC細胞達到約60%匯合度時，將培養(yǎng)基換成條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后消化、離心并收集HUVEC細胞。鋪膠方法同1.2.4節(jié)，將HUVEC細胞懸液種在上室，使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，下室加入培養(yǎng)條件培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，固定、染色、拍照方法同1.2.4節(jié)。

1.2.6 ELISA法檢測MMP2、MMP7的表達

各組細胞培養(yǎng)24 h后收集細胞上清液。根據(jù)ELISA試劑盒操作說明檢測TRIC-OE、NC兩組細胞上清液中MMP2、MMP7的表達含量。根據(jù)標準品濃度及A 值繪制標準曲線，計算每孔待測品濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果與分析

2.1 Tricellulin在人結(jié)直腸癌細胞系中的表達

Tricellulin蛋白在人結(jié)直腸癌細胞系HCT116、SW620、HCT8的表達量均高于人結(jié)腸黏膜上皮細胞系NCM460(圖1)，說明tricellulin在人結(jié)直腸癌細胞中高表達。選擇中等量表達內(nèi)源性tricellulin蛋白及侵襲能力中等的HCT116細胞株，以進行下一步實驗。

圖1 Tricellulin在人結(jié)直腸癌細胞系及人結(jié)腸黏膜上皮細胞系的表達Fig.1 Expression of tricellulin in human colorectal cancer cell lines and human colonic mucosal epithelial cell lines

2.2 過表達tricellulin的鑒定

過表達慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細胞HCT116，經(jīng)過篩選后獲得穩(wěn)定過表達tricellulin的細胞株，熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達大于70%(圖2)。提取總蛋白進行western blot實驗，以GAPDH為參照基因，結(jié)果如圖3。Western blot的驗證實驗結(jié)果說明，穩(wěn)定過表達tricellulin 的HCT116細胞株成功構(gòu)建，此細胞株可用于后續(xù)實驗。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染tricellulin (TRIC-OE)與陰性對照組細胞(NC)內(nèi)綠色熒光蛋白表達(250×)Fig.2 Green fluorescent protein expression in lentivirus-transfected tricellulin (TRIC-OE) and negative control cells (NC)(250×)

**indicates significant difference at P<0.01

2.3 過表達tricellulin對人結(jié)直腸癌細胞侵襲能力的影響

通過Transwell小室實驗檢測各組細胞對人結(jié)直腸癌細胞的侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，與NC組相比，TRIC-OE組的侵襲細胞數(shù)量明顯增加(圖4，P<0.01)，說明過表達tricellulin可增強人結(jié)直腸癌細胞的侵襲能力。

**indicates significant difference at P<0.01

2.4 過表達tricellulin細胞上清液對HUVEC細胞侵襲能力的影響

通過Transwell小室實驗檢測各組細胞上清液對HUVEC細胞的侵襲能力的影響。與NC組相比，使用TRIC-OE上清液配制條件培養(yǎng)基(TRIC-OE-CM組)可使HUVEC細胞侵襲數(shù)量明顯增加(圖5，P<0.01)，說明過表達tricellulin人結(jié)直腸癌細胞上清液可增強HUVEC細胞的侵襲能力。

2.5 過表達tricellulin細胞上清液對MMP2、MMP7表達的影響

ELISA法檢測各組細胞上清液中MMP2、MMP7的表達，結(jié)果顯示TRIC-OE組中MMP2、MMP7的含量明顯升高(圖6，P<0.01)，說明tricellulin可能通過MMP2、MMP7影響HUVEC的侵襲能力。

**indicates significant difference at P<0.01

**indicates significant difference at P<0.01

3 討論

雖然多種治療手段可應(yīng)用于結(jié)直腸癌的治療，如手術(shù)、放化療、免疫治療、靶向治療等，但是結(jié)直腸癌的預(yù)后仍不佳[7]。在所有腫瘤中，結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移率位居第三，是消化內(nèi)科臨床患者的常見死亡原因。目前結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制尚未完全闡明。腸上皮屏障由單層細胞和細胞間連接組成，細胞間連接包括緊密連接、黏附連接、橋粒、縫隙連接[8]。越來越多的研究表明，緊密連接蛋白在腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色[9-11]。Tricellulin作為緊密連接蛋白中的一員，其主要表達在三細胞連接處。筆者在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)，tricellulin在結(jié)直腸癌組織中高表達，且與結(jié)直腸癌腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]，但是其異常表達對腫瘤的生物學行為產(chǎn)生影響，目前作用機制尚不明確。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個復雜的、多階段的過程[12]。內(nèi)皮細胞構(gòu)成了血管的內(nèi)層，參與了血管生成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是腫瘤治療的重要靶點之一[13]。血管生成與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤細胞生長必須依賴血管的生成來提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣[14]，此外，腫瘤細胞可分泌蛋白降解酶類(如MMPs),降解細胞外基質(zhì)(ECM)后形成腫瘤細胞移動的通道，腫瘤細胞穿透ECM，并穿透血管壁的基底膜進入血液循環(huán)，從而實現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移[15]。MMPs作為目前已知能降解細胞外基質(zhì)的重要酶類，在介導腫瘤血管新生、轉(zhuǎn)移和侵襲等過程中發(fā)揮重要作用[16]。本研究通過基因工程技術(shù)調(diào)控tricellulin的表達發(fā)現(xiàn)，過表達tricellulin可增強結(jié)直腸癌細胞HCT116的侵襲能力，并且其上清液可增加HUVEC細胞的侵襲能力，可能是通過增加MMP2、MMP7的表達來實現(xiàn)的。綜上所述，結(jié)直腸癌細胞過表達tricellulin可能通過調(diào)控MMP2、MMP7的表達促進HUVEC細胞的侵襲能力。本研究為探索tricellulin調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移提供了新的理論依據(jù)，但仍需更深入的探索。

4 結(jié)論

結(jié)直腸癌中過表達tricellulin可能通過MMP2、MMP7調(diào)控HUVEC細胞的侵襲能力，可能與腫瘤血管生成密切相關(guān)。Tricellulin有望成為結(jié)直腸癌治療的分子靶點。