汪建文 曾濤 王欣 于洋 萬莉紅 周琰

（1. 四川大學(xué)華西醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041；2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041）

膿毒癥是由各種感染（病毒、細(xì)菌）引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，目前尚無特異性治療藥物，因而病死率高達(dá)30%-70%，是重癥監(jiān)護(hù)室患者的主要死因之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每天約有1.4 萬人死于膿毒癥并發(fā)癥，其中膿毒癥急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是最常見的并發(fā)癥之一[2]，超過50%的膿毒癥患者出現(xiàn)ALI，且發(fā)生ALI后患者死亡率明顯增高。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制，然而持續(xù)的ERS 則會(huì)激活凋亡等途徑引起細(xì)胞損傷，因此抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效減輕膿毒癥患者的病情[3]。中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）是一種新型保守的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔[4]，其基因上游啟動(dòng)子區(qū)域中含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)組件-Ⅱ（ER stress response element-Ⅱ，ERSE-Ⅱ），可接受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF6 和XBP-1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)基因。研究表明，MANF 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)上調(diào)或分泌增加，以對(duì)抗細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，在膿毒癥心肌細(xì)胞凋亡以及腎損傷中均發(fā)揮了明顯的保護(hù)作用[5-6]。為此，本文擬將MANF 應(yīng)用于膿毒癥急性肺損傷小鼠探究其保護(hù)作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）（Sigma，美國(guó)），重組小鼠源MANF（義翹神州科技有限公司，北京），還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒（Elabscience）。

1.1.2 動(dòng)物

6-8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 雄性小鼠（體重20~25 g）購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（中國(guó)，成都）。所有小鼠飼養(yǎng)于無病原菌的環(huán)境（溫度：22～25℃，濕度：55%，光暗循環(huán)12：12），可自由攝取食物和水，該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理審批。

1.2 方法

1.2.1 生存曲線

選取6-8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 雄性小鼠50只，隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、MANF 治療組（n=10），適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，模型組和MANF 治療組小鼠以LPS（15 mg?kg-1，i.p.）建立急性肺損傷模型；對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。MANF 治療組小鼠于LPS 注射后6 h 經(jīng)尾靜脈注射重組小鼠源MANF（250、500、750 μg?kg-1），其余組尾靜脈注射等量生理鹽水；記錄72 h 內(nèi)小鼠的生存情況，繪制生存曲線。

1.2.2 肺組織病理檢測(cè)

選取6-8 周C57BL/6 雄性小鼠24 只，隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、MANF 治療組（n=8），適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，采用1.2.1 中方法建立小鼠急性肺損傷模型。MANF 治療組小鼠于LPS 注射后6 h 經(jīng)尾靜脈注射重組小鼠源MANF（1.2.1 中所得最佳劑量），其余組尾靜脈注射等量生理鹽水。所有小鼠造模24 h 后，腹腔注射戊巴比妥50 mg?kg-1麻醉、心臟穿刺灌注后取左肺組織用4%多聚甲醛4℃固定過夜、包埋并切片，經(jīng)HE 染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理形態(tài)并比較肺組織損傷情況。

1.2.3 TUNEL （ TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色

取包埋后的肺組織切片，采用TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（FITC）觀察并比較小鼠肺組織凋亡發(fā)生情況，使用Hoechst 33258 染料和共聚焦激光熒光顯微鏡對(duì)肺組織進(jìn)行核染色及拍照。

1.2.4 肺組織氧化應(yīng)激水平測(cè)定

取新鮮右肺組織漂洗后加入PBS 進(jìn)行勻漿，在4℃條件下以10000×g 離心制備組織勻漿，取0.1 mL 待測(cè)樣品用PBS 稀釋兩倍后依次按照試劑盒說明加入不同試劑，采用酶標(biāo)儀分別在405 nm、532 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度并計(jì)算還原型谷胱甘肽及丙二醛含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，采用oneway ANOVA 方差分析檢驗(yàn)；計(jì)量資料以率（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)，其中P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 重組小鼠源MANF 對(duì)LPS 膿毒癥小鼠生存時(shí)間的影響

LPS（15 mg?kg-1, i.p.）誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷小鼠在LPS 注射后24 h 內(nèi)死亡明顯，存活率約70%；之后死亡繼續(xù)增加，在LPS 注射后72 h僅存活20%；而尾靜脈注射重組小鼠源MANF 750 μg?kg-1后，膿毒癥小鼠24 h 內(nèi)的病死率明顯降低（P＜0.05），但對(duì)長(zhǎng)期存活率未見明顯改善（P＞0.05），見圖1。

圖1 生存曲線

2.2 重組小鼠源MANF 對(duì)LPS 膿毒癥小鼠肺損傷的保護(hù)作用

對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整、排列緊密且無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；LPS（15 mg?kg-1）單次腹腔注射誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠出現(xiàn)明顯的肺損傷，表現(xiàn)為：肺泡結(jié)構(gòu)損傷、肺泡壁顯著增厚、大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)、可見肺泡內(nèi)出血；MANF 治療組小鼠肺組織病理變化較LPS 模型組明顯減輕，多數(shù)肺泡結(jié)構(gòu)完整、肺泡間隔變窄、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見圖2。

圖2 肺組織病理改變（HE，×200）

2.3 重組小鼠源MANF 對(duì)LPS 膿毒癥小鼠肺組織凋亡的影響

與對(duì)照組小鼠肺組織相比，LPS（15 mg?kg-1）單次腹腔注射誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織TUNEL 陽性細(xì)胞占比明顯增加；而與LPS 模型小鼠相比，MANF 治療組小鼠肺組織TUNEL 陽性細(xì)胞占比顯著減少，見圖3。

圖3 肺組織凋亡情況（TUNEL 染色，×200）

2.4 重組小鼠源MANF 對(duì)LPS 膿毒癥小鼠肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

與對(duì)照組小鼠肺組織相比，LPS（15 mg?kg-1）單次腹腔注射誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織GSH水平明顯下降，MANF 治療組小鼠肺組織GSH 水平明顯增加（P＜0.05）；而MDA 水平未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖4。

圖4 肺組織氧化應(yīng)激水平（A-GSH；B-MDA）

3 討論

目前大量研究證實(shí)MANF 作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)蛋白對(duì)多種疾病具有保護(hù)作用，包括腦缺血、心肌梗塞、視網(wǎng)膜變性等。

本文以膿毒癥肺損傷小鼠為研究對(duì)象，采用重組小鼠源MANF 尾靜脈注射的方式，首先觀察了MANF 對(duì)膿毒癥病死率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組小鼠源MANF（750 μg/kg，尾靜脈注射）對(duì)急性期（24 h 內(nèi)）病死率具有顯著降低作用；然而對(duì)長(zhǎng)期存活率未見明顯改善。這可能由于我們采用的給藥方式為靜脈注射，而重組MANF 的半衰期較短，單次注射難以長(zhǎng)時(shí)間維持其恒定的血藥濃度所致。但是，MANF 在膿毒癥急性期內(nèi)的保護(hù)作用是確切的，而急性期正是膿毒癥治療的關(guān)鍵時(shí)期。

肺是膿毒癥最易受損的靶器官，因此ALI 是膿毒癥最早發(fā)生的器官損傷，發(fā)生率也較高[7]，早期干預(yù)將對(duì)膿毒癥患者的肺損傷具有積極的防治價(jià)值。本研究選用生存曲線中效果最佳的MANF劑量750 μg/kg 進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果通過HE 染色發(fā)現(xiàn)MANF 尾靜脈注射對(duì)LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷具有顯著的改善作用，不僅明顯減輕了炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)肺組織結(jié)構(gòu)損傷也有顯著減輕。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肺損傷中扮演重要的角色，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效減輕膿毒癥患者的病情[3]。在持續(xù)的ERS 作用下，肺組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞在IRE1α 激活X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）轉(zhuǎn)錄，從而活化下游凋亡蛋白CHOP 的作用下發(fā)生凋亡[8]。本文采用TUNEL 染色對(duì)肺組織的凋亡情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MANF 尾靜脈注射可明顯減少LPS 誘導(dǎo)的凋亡，表現(xiàn)為TUNEL 陽性細(xì)胞的減少。

另外，持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可調(diào)節(jié)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而消耗細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽（Glutathione，GSH）引起細(xì)胞內(nèi)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量增加[9]。為此，本文通過測(cè)定GSH 和MDA 水平間接反映MANF對(duì)小鼠肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示MANF 治療后明顯增加抗氧化物質(zhì)GSH 的含量，對(duì)MDA 有一定的減輕作用，但缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能和MANF 半衰期短有關(guān)，后期需要進(jìn)一步加大樣本量以及改變MANF 給藥途徑來進(jìn)行研究。由于GSH 是肺泡上皮襯液中最主要的小分子抗氧化物質(zhì)，研究表明GSH 治療后的膿毒癥肺損傷大鼠外周血淋巴細(xì)胞凋亡率明顯降低[10]。因此，MANF 治療顯著增加GSH 含量在提高抗氧化應(yīng)激作用上效果明確。

綜上所述，重組小鼠源MANF 可明顯降低LPS 膿毒癥小鼠急性期病死率；同時(shí)對(duì)膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷具有明顯的保護(hù)作用，可抑制肺組織凋亡、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。