田大剛

(福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所， 福建 福州 350003)

由稻瘟病菌引起的水稻稻瘟病是水稻生產(chǎn)上最具破壞性的病害之一。在流行年份大大降低了水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)，病害暴發(fā)時幾乎無法控制。對水稻生產(chǎn)者來說，避免由此造成的經(jīng)濟損失是一個巨大的挑戰(zhàn)。在防治該病害的措施中，培育抗稻瘟病品種是經(jīng)濟和環(huán)境友好的首選策略[1]。水稻對稻瘟病的抗性符合“基因對基因”互作模式，這使得抗性基因會因稻瘟病菌生理小種的快速變異而快速失去抗性，并由此導致抗病育種的進展緩慢，嚴重地影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。因此，不斷挖掘和利用新型稻瘟病抗性基因，將有助于解決這一難題。

自20世紀末以來，分子遺傳學技術在農(nóng)作物上的應用大大加快了水稻抗稻瘟病研究的步伐。目前，水稻中已有超過130個抗性基因和350個數(shù)量性狀位點(QTL)定位在所有染色體上[2-3]；然而，大多數(shù)抗性基因的抗性水平較低，大部分功能還有待驗證。在水稻中目前已克隆的26個主效抗性基因中，大多數(shù)編碼具有核苷酸結合位點(NBS)和富亮氨酸重復結合域(LRR)的蛋白質(zhì)，并且許多NBS-LRR型抗性基因作為等位基因位于同一基因座上[4]，其中以第6染色體的Piz基因座和第11染色體的Pik基因座最為突出。Piz基因座含有Pi9、Pi2、Pi50、Piz-t和Pigm等抗性基因，Pik基因座包含Pi1、Pik、Pik-m、Pik-p、Pik-s、Pik-h和Pike等抗性基因，這兩個基因座的大多數(shù)基因已被證實具有廣譜抗性，在抗病育種中具有較大的應用潛力[5-6]。Piz和Pik基因座上的稻瘟病抗性基因Pi9、Piz-t和Pik/km/kp的有效性取決于其對應的無毒基因AVR-Pi9、AVR-Piz-t和AVR-Pik/km/kp，目前已發(fā)現(xiàn)AVR-Pik主要有AVR-Pik-A、AVR-Pik-B、AVR-Pik-C、AVR-Pik-D、AVR-Pik-E和AVR-Pik-F等多個等位基因，并有報道AVR-Pik/km/kp和AVR-Piz-t通過基因獲得/缺失、堿基替換和轉座子插入等多種方式來逃避抗性基因的識別[7-11]。

為促進Piz和Pik基因座上的功能基因在生產(chǎn)上的廣泛應用，本課題組自2008年以來采用分子生物學、植物病理學和多組學的研究方法，一直在對它們的抗性機制和育種應用進行相關的研究。本文回顧了本課題組在稻瘟病抗性基因鑒定與篩選、新型抗性基因挖掘、功能基因標記開發(fā)和標記輔助改良抗性等方面的研究工作，以及水稻抗病基因及稻瘟病菌無毒基因的研究進展。

1 水稻稻瘟病抗性資源的篩選與鑒定

由于稻瘟病菌的遺傳復雜性和易變性等特點，造成利用單一主效基因的抗病品種在推廣應用3～5年后易喪失抗性，引起病害的暴發(fā)和流行。因此，尋找廣譜抗性的抗源、挖掘及利用新抗病基因是解決問題的關鍵。常規(guī)的抗性基因篩選利用不同的稻瘟病菌生理小種從地方品種、栽培品種或野生稻群體中進行鑒定[12]，這種依據(jù)發(fā)病表型的篩選方法費時費力，不適宜于大規(guī)模種質(zhì)資源鑒定。

通過在稻瘟病重發(fā)區(qū)的田間自然鑒定，可簡便快捷地初選出抗性材料，再結合基于PCR的分子標記鑒定，在確定含有已克隆基因材料的同時，可篩選出可能含有的新抗性基因種質(zhì)資源。目前，該方法已用于Piz和Pik基因座的功能基因的鑒定中[13-15]。例如，福建省沙縣富口鎮(zhèn)良種場位于沙縣西北部，水稻生長季節(jié)高溫高濕，是稻瘟病重發(fā)、多發(fā)區(qū)，本課題組在該地從2009-2011年間對1 092份不同類型水稻種質(zhì)資源進行了田間苗葉瘟和穗莖瘟的自然鑒定，篩選到中抗以上的種質(zhì)資源344份；同時，利用已報道的抗性基因分子標記，確定了部分抗性種質(zhì)資源源于已知的抗性基因[16]。進一步為挖掘新的抗病基因，本課題組還對篩選出來的谷豐A、閩北晚秈和02428等抗性資源進行遺傳分析，確定谷豐A抗性不僅源于Pigm、Pid2和Pid3等已知基因[17]，還可能含有新基因[18-19]，閩北晚秈的抗性主要由Pigm基因貢獻，而02428中發(fā)現(xiàn)了新單倍型的抗性基因pi21[20]。

全基因組關聯(lián)研究(GWAS)有助于理解復雜數(shù)量性狀和遺傳變異[21-23]。在水稻中，GWAS結合高通量測序和基因敲除技術已被用于快速鑒定影響產(chǎn)量、抽穗期、芒長和其他農(nóng)藝性狀的新功能基因[24-25]。近年來，GWAS在定位水稻抗稻瘟病基因中也得到了廣泛的應用。如陳學偉等[26]挖掘到1個調(diào)控廣譜抗病的C2H2轉錄因子Bsr-d1；Wang等[27]利用從中國各地收集的16個典型稻瘟病菌株，在秈稻群體中鑒定到30個與稻瘟病抗性相關的位點；Wang等[28]通過對低SSR標記覆蓋率的151份材料進行GWAS分析，確定了21個與稻瘟病抗性有關的位點，其中6個位于與已克隆的稻瘟病抗性基因的區(qū)域；Guo等[29]在對同樣是SSR標記覆蓋率較低的227個粳稻的稻瘟病抗性基因分析中，確定13個顯著位點，其中8個是以前報道的稻瘟病抗性基因；Raboin等[30]通過對150份熱帶粳稻和190份秈稻品種的田間抗性評價，分別在粳稻品種的第1號、12號染色體和秈稻品種的第8號染色體上定位到3個顯著的位點，并確定了2個候選基因；Kang等[31]和Zhu等[32]分別通過在室內(nèi)用5個不同的稻瘟病菌株進行接種試驗及在3個水稻主產(chǎn)區(qū)對5個主要栽培稻亞群體的420份代表性材料進行田間自然發(fā)病鑒定，前者鑒定出97個稻瘟病抗性位點，其中82個屬于未報道的基因；田間鑒定出的16個稻瘟病抗性位點中，有13個也是未報道的基因。Lin等[33]利用RDP I和兩個臺灣稻瘟病菌株，鑒定出32個與抗瘟性有關的QTLs，其中22個與先前報道的抗性基因或QTLs重合；此外，Li等[34]利用3個中國菌株對RDP I進行了稻瘟病抗性的GWAS分析，鑒定到56個QTLs，其中1個對所有3個菌株都具有抗性，并被確定含有一個新的Pik等位基因；而Liu等[35]利用3個稻瘟病菌株對RDP II做了抗性鑒定，確定了27個與稻瘟病抗性相關的位點，其中22個為未報道的基因，并確定了1個新的抗性基因，該基因可對稻瘟病產(chǎn)生部分抗性。以上這些研究成果表明，GWAS技術是鑒定水稻稻瘟病新抗原的強有力工具。本課題組利用過去50年來積累的120份南方稻區(qū)主栽品種的測序數(shù)據(jù)，通過關聯(lián)室內(nèi)外稻瘟病抗性鑒定，獲得了多個顯著的區(qū)間，其中包括3個已克隆的稻瘟病抗性基因和1個新的位點(圖1A)。

圖1 利用多組學技術挖掘稻瘟病抗性基因和解析Piz-t抗性機制

2 水稻稻瘟病抗性基因與稻瘟病菌無毒基因的互作

在已確定的稻瘟病抗性基因與對應無毒基因的配對中，如Pi-ta/AVR-Pita、Piz-t/AVR-Piz-t、Pik/AVR-Pik、Pia/AVR-Pia、Pi33/ACE1、Pi-CO39/AVR1-CO39、Pi54/AVR-Pi54、Pii/AVR-Pii、Pi9/AVRPi9和Pib/AVRPib[36]。其中Pi-ta/AVR-Pita和Piz-t/AVR-Piz-t是單個抗性基因識別單個AVR基因[37]，而在Pik、Pi5和Pia/Pi-Co39介導的識別相應AVR基因的過程中，分別需要Pik-1和Pik-2、Pi5-1和Pi5-2以及由RGA4和RGA5組成的兩個R基因共同參與。近來，Cesari等根據(jù)水稻NLRs Pikp-1和RGA5蛋白利用HMA (重金屬相關的)物理結合稻瘟病菌無毒蛋白Avr-PikD、Avr-Pia和Avr1-CO39集成誘餌結構域IDs以識別稻瘟菌效應子的特性，在抗病蛋白RGA5_HMA中引入Pikp-1_HMA與Avr-PikD結合殘基，為RGA5_HMA創(chuàng)建了高親和力的結合表面。攜帶這種結合表面的RGA5變異體不僅能感知Avr-Pia和Avr1-CO39，還能識別Avr-PikD[38-39]。

值得注意的是，在CC型NLR蛋白ZAR1的蛋白質(zhì)結構研究中，ZAR1識別并被病原菌蛋白AvrAC激活后，組裝成含3個亞基共15個蛋白的環(huán)狀五聚體蛋白機器“抗病小體”，抗病小體形成后直接在細胞質(zhì)膜上發(fā)出自殺指令，很可能是植物細胞死亡和免疫執(zhí)行者[40-41]。另外，結構分析表明TIR-NBS-LRR蛋白通過代謝分解輔助因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，介導細胞死亡信號通路和誘導植物產(chǎn)生抗性[42-43]。上述結果說明了R蛋白通過多種機制介導植物的免疫反應。因此，基于結構的水稻抗稻瘟病相關蛋白的分析，可能有助于了解植物的免疫機制。例如，Zhou等[44]報道了水稻NPR1的高分辨率的三維結構，從分子水平上闡述了水稻NPR1調(diào)控抗病的基因轉錄機制，反映了NPR1如何與同源或異源轉錄子結合來調(diào)控抵抗病原菌的基因轉錄模型。

為研究近年來福建省稻瘟病菌生理小種組成，利用2017-2019年收集自福建省17個縣市(地區(qū))的中稻稻瘟病穗頸瘟樣本分離單孢，用7個中國鑒別品種進行分類鑒定，并從中篩選出60個福建省內(nèi)具有代表性的稻瘟病菌株。其中，稻瘟病菌生理小種ZA群出現(xiàn)頻率為39.48%，為優(yōu)勢種群；ZB、ZC和ZD群菌株的占比分別為23.68%、13.82%和11.18%，致病力達到50%以上的生理小種分布在邵武、建陽、光澤、寧化、龍巖和松溪。這一結果說明，不同區(qū)域和年份間的稻瘟病菌菌株致病力存在差異[45-46]。

了解水稻AVR基因的分子結構及進化，對于抗病育種中合理利用抗病基因，以及采取更有效的策略來控制病害發(fā)生具有潛在的意義。通常情況下，在病原菌與植物之間長期的互作中，植物利用抗病基因來抵御病原菌，而病原菌也在試圖沖破植物的防御體系，它們之間的共同進化在基因組水平上有跡可循[47-48]。稻瘟病菌利用無毒基因結構突變來適應寄主抗病基因和環(huán)境的變化[8，49-50]，因此，分析稻瘟病菌田間分離株的DNA序列變異，有助于了解水稻抗性基因的有效性和持久性。本課題組利用6個稻瘟病菌無毒基因和9個水稻抗性基因的分子標記，分別檢測上杭縣稻瘟病菌35個生理小種和117個近50年來南方水稻主栽品種，結合在福建上杭的田間抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)AVR-Pita、AVR-Piz-t和AVR-Pik都存在變異類型菌株，它們對應的抗性基因在該地區(qū)也失去抗性；而另一方面Pigm、Pi2和Pi9基因對該地的菌株有廣譜的抗性，并且在這117份水稻中含有較少的Piz基因座的功能基因，說明這些功能基因仍可以在當前抗性育種中廣泛應用。

3 多組學挖掘涉及水稻Piz-t基因調(diào)控的抗病新基因

水稻受到稻瘟病菌侵染時，會通過體內(nèi)的生化物質(zhì)調(diào)節(jié)信號轉導，進而調(diào)節(jié)其抗病相關基因的表達，這是一個由多種信號通路所調(diào)節(jié)的復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，單從某一方面研究無法較為完整地探究其中機理。得益于日趨發(fā)展的測序技術及手段，以高通量、大規(guī)模、高靈敏度為特點的數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計方法開始大量應用于作物應答病原菌侵染的研究。在分子生物學和數(shù)據(jù)科學中，組學指的是研究發(fā)生在生物體內(nèi)特殊的、暫時的或全面性的變化；它是在一個單一或一群細胞、組織或器官中衡量功能和提取相關的生物信息。水稻全基因組序列的易獲得性，為基因組學、轉錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組學等多種組學研究提供了平臺[51-60]。

對生物體完整轉錄組的破譯始于20世紀90年代[61]。在過去30年中，利用深度測序技術的RNA-Seq方法在各種作物改良中獲得了巨大的推廣應用。綜上所述，轉錄組學有助于破譯未注釋的基因和分析基因表達模式[62]。前期研究表明，水稻對稻瘟病菌的抗性是包括轉錄因子[MYB、WRKY、乙烯應答因子(ERF)等]、信號激酶、亮氨酸重復基因、細胞壁修飾相關基因等多個調(diào)節(jié)子的聯(lián)合作用；同時，參與水稻抗性反應的各種防御反應基因上調(diào)[63]。但是，這些研究都缺乏水稻與稻瘟病互作的動態(tài)變化。本課題組在比較轉Piz-t日本晴(NPB-Piz-t)與日本晴在接種稻瘟病菌KJ201的轉錄組學的分析中，確定了接菌后24 h是最特異的時間點(圖1B)，該時間點最顯著的蛋白-蛋白互作途徑包含絲裂原活化蛋白激酶信號通路、與DNA結合結構域相關的抗病基因。進一步利用加權基因共表達網(wǎng)絡分析確定了幾個與光合作用、重要農(nóng)藝性狀及特異核苷酸結合域和富亮氨酸重復(NLR)基因以及與B3 DNA結合域蛋白相關的基因在抗感病之間受到差異調(diào)控[64]。

蛋白質(zhì)組學由Mark Wilkins于1994年提出[65]。蛋白質(zhì)組學借助于其他組學技術，如基因組學、轉錄組學和代謝組學去認識感興趣蛋白的結構與功能。確切地說，蛋白質(zhì)組是指細胞、組織或有機體中的一組或全部蛋白質(zhì)，它提供了一個在特定條件下數(shù)據(jù)豐富的表達蛋白全景。目前蛋白質(zhì)組學研究幾乎涵蓋了正?；蛎{迫條件下的所有水稻組織和器官[66]。在水稻與稻瘟病菌互作方面，蛋白質(zhì)組學研究已經(jīng)揭示了DUF26、核苷酸結合富含亮氨酸重復序列、病程相關基因、活性氧產(chǎn)生清除酶、熱休克蛋白(HSPs)、核重組相關蛋白、轉錄因子和植物激素信號傳導在水稻抗病中的作用；其中對病原體感知和信號轉導相關的蛋白質(zhì)在病原菌侵染的早期階段發(fā)揮重要的作用。但在丙烯唑誘導蛋白1(PBZ1)和苯丙素在抗病和感病品種中的作用方面，iTRAQ與之前使用2-DE方法的研究結果相反，這說明需要更系統(tǒng)的利用iTRAQ技術去挖掘和確認這種互作中的關鍵因子[67]。本課題組利用iTRAQ技術比較NPB-Piz-t與日本晴在接種稻瘟病菌KJ201和RB22(KJ201和RB22分別對Piz-t表現(xiàn)為不致病和致病，但兩者對日本晴都是致病的)后的變化[68]，獲得56個在NPB-Piz-t與日本晴中都存在的差異表達蛋白，如Bowman-Birk胰蛋白酶抑制劑、C3HC4型RING家族E3泛素化酶、病程相關蛋白、與激素調(diào)節(jié)和防御及應激反應有關的蛋白質(zhì)、類受體激酶和細胞色素P450等。有趣的是，NPB-Piz-t接菌KJ201和RB22之間只有少數(shù)不同的差異表達蛋白，如乙醇脫氫酶I、類受體蛋白激酶、內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、類Rubisco大亞基、NADP依賴型蘋果酸酶和兩種假定蛋白，這些蛋白可能是導致抗感性不同結果的重要因素。如Bowman-Birk胰蛋白酶抑制劑APIP4和C3HC4型RING家族E3泛素化酶APIP10都參與到Piz-t調(diào)控的免疫反應，后者不僅可以降解效應蛋白Avr-Piz-t，激活PTI[69-70]；還可與維管植物單鋅指蛋白VOZ1/VOZ2互作，調(diào)控NLR蛋白Piz-t介導的ETI[71]。bZIP類型的轉錄因子APIP5也參與植物免疫調(diào)控[72-73]。之后，Zhang等[74]在水稻與白葉枯菌的互作研究中也做了類似的探索(圖1C)。

不同于基因組學、轉錄組學和蛋白質(zhì)組學所揭示的細胞內(nèi)基因表達模式，代謝組學是利用高通量的技術來鑒定和定量一個細胞、組織或器官中所有小分子或代謝物的生命科學研究，以提供一個生物體或生物系統(tǒng)的生化狀態(tài)全貌[75]。最值得注意的是，代謝組學能提供生物體發(fā)生的證據(jù)，并描述了生化表型[76]。本課題組在NPB-Piz-t與日本晴接種稻瘟病菌KJ201的葉片中，相對于各自接種緩沖液的對照來說，分別檢測到78個和52個(含22個共同的)的差異表達代謝物。N-順式-芥子酰酪胺和N-順式阿魏酰酪胺是它們中兩個差異最顯著的物質(zhì)，可作為生物防治稻瘟病害的候選。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，色氨酸代謝途徑和吲哚生物堿生物合成在抗病和感病反應中差異顯著[77](圖1D)。多數(shù)吲哚生物堿是由色氨酸衍生而來的一類植物代謝產(chǎn)物[78]，它們在195種植物抵御病原菌和食草動物侵害的過程中起著關鍵作用[79-80]，這使得生物堿在醫(yī)藥中得到廣泛應用[81]。除此之外，已有研究報道如月桂素3-O-纖維二糖甙、脫落酸葡萄糖苷酯、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷、刺苞菊甙和櫻桃素等在抗稻瘟病的水稻品種中特異產(chǎn)生[82]，它們可作為開發(fā)稻瘟病菌生物防治藥物的物質(zhì)基礎。

植物根部微生物組與植物免疫密切有關，加強病原微生物與有益微生物間互作的交叉研究，闡明植物識別病原菌和有益微生物的分子應答和免疫反應激發(fā)機制的差異，可為提高農(nóng)作物產(chǎn)量與抗性提供新的途徑[83]。目前尚缺乏水稻與稻瘟病菌互作對根部微生物影響相關的研究。本課題組采用16s rRNA和內(nèi)轉錄間隔子1(ITS1)序列分析方法，對NPB-Piz-t與日本晴在接種稻瘟病菌KJ201的根內(nèi)、根際土壤微生物進行了測序。除根內(nèi)真菌豐富度外，根際土壤的細菌和真菌的豐富度和多樣性均高于根內(nèi)；接菌后的根內(nèi)細菌群落豐富度和多樣性有所增加，以日本晴的增加最多，而真菌豐富度和多樣性降低，分別以日本晴的豐富度和NPB-Piz-t的多樣性最低，且NPB-Piz-t與日本晴的根內(nèi)真菌存在顯著差異；共生網(wǎng)絡分析表明，細菌和真菌群落分別以藻門變形菌和子囊菌為主[83](圖1E)，該結果為利用微生物防控稻瘟病菌提供理論參考。

4 色氨酸代謝途徑介導水稻廣譜抗性

在上述的多組學分析Piz-t調(diào)控的抗性途徑中，色氨酸途徑在轉錄、蛋白質(zhì)和代謝物等多層次水平上受到影響，表明這一途徑參與了Piz-t調(diào)控的免疫反應。

由色氨酸途徑生成的5-羥色胺是一種次生代謝物，易被活性氧氧化[84-85]。由于5-羥色胺抗氧化活性，其在抗病過程中起著至關重要的作用。另外，5-羥色胺也起著物理屏障的作用，使水稻對褐斑病和稻瘟病產(chǎn)生抗性；并在水稻對胡麻斑病的抗性反應和衰老的過程中積累[86-89]。此外，水稻植株受到害蟲入侵時，會誘導5-羥色胺的生物合成；而在5-羥色胺生物合成受到抑制時，則會增強水稻植物對螟蟲和稻飛虱的抗性[90]。

SL基因控制5-羥色胺的合成，課題組借助于對SL基因突變體的研究，確定了sl突變體能提高水稻活性氧爆發(fā)水平，并能通過調(diào)控水楊酸、茉莉酸、乙烯和脫落酸等物質(zhì)的協(xié)調(diào)作用，增強水稻抗性。另外，sl突變體還廣泛參與對胡麻斑病、白葉枯病和稻飛虱的抗性[91-95]。與SL互作的泛素化蛋白SLBP可在體內(nèi)降解SL蛋白；不僅如此，在對比NPB-Piz-t與日本晴接菌KJ201的72 h時SL表達的數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)，SL在NPB-Piz-t中受到明顯抑制；進一步分析發(fā)現(xiàn)SLBP可與稻瘟菌無毒蛋白AvrPiz-t互作，表明SL可能參與Piz-t調(diào)控的ETI免疫反應。

5 Piz和Pik基因座功能標記的開發(fā)及種質(zhì)資源鑒定

在已克隆的稻瘟病抗性基因中，接近1/3位于Piz和Pik基因座上，這些基因多數(shù)都是廣譜高抗基因；其中位于著絲粒近端的第6號染色體短臂上的Piz基因座的等位基因，如Pi2、Pi9、Piz-t和Pigm都嵌入在1個包含多個序列相關的同源基因的簇中，它們限定在LRR區(qū)域內(nèi)的有限序列變異決定了它們對不同稻瘟病菌株的識別特異性[96-98]。Piz基因座的等位基因間具有高度序列化的復雜組織結構特征，使得開發(fā)區(qū)別于這些基因的分子標記十分困難。類似地，位于第11染色體長壁末端的Pik基因座的抗性基因均由2個緊密連鎖但轉錄方向相反的CC-NBS-LRR類基因(Pik-1和Pik-2)共同決定，且基因序列間高度同源[6,15,99-100](圖2)。

為促進Piz和Pik基因座所含功能基因在育種中的應用，近年來出現(xiàn)了多個關于這兩個基因座功能基因的分子標記[14, 101-103]，但由于多數(shù)標記和基因有一定的遺傳距離或者需要酶切等步驟，因此很難在大規(guī)模種質(zhì)資源篩選或育種中應用。本課題組基于Piz和Pik基因座的基因序列，開發(fā)出Pi9-Pro、Pi2-LRR、Pigm/2/9InDel、Pikp-Del和Pi1-In等標記[104-106](圖2)。利用這些標記系統(tǒng)鑒定了我國南方水稻種植區(qū)的品種及育種材料，確定了Pi2、Pigm和Pik等抗性基因尚未在水稻生產(chǎn)中廣泛使用。這些信息不僅為下一步布局抗性基因提供試驗數(shù)據(jù)，也便于利用這兩個基因座所含的功能基因開展分子育種。

注：A.Piz 和Pik基因座功能基因；B.Piz 和Pik基因座功能基因標記圖

6 Piz和Pik基因座用于創(chuàng)制水稻稻瘟病抗性新品種

分子標記輔助育種是抗病育種的重要途徑，特別是針對已克隆基因的使用，大大縮短了育種周期和成本[107-110]。在早期利用已克隆稻瘟病抗性基因對福建優(yōu)勢菌株的抗性鑒定中，篩選出具有廣譜高抗基因Pi9、Pi2和Pi1。為了加速它們在水稻生產(chǎn)中的應用，本課題組設計了一個基于回交轉育的策略。以供體親本C750或75-1-127(Pi9)、BL123(Pi1+Pi2)和華占(Pi2)與CBB23(Xa23)和B5(Bph14/Bph15)組合，改良抗性較弱的強優(yōu)勢恢復系閩恢6118、閩恢3189、恢316和閩恢3301雜交，在每個回交世代中選擇攜帶所有目標基因的植株進行進一步回交；在每一代回交選擇中，首先對目標基因進行標記選擇，然后對田間農(nóng)藝性狀進行選擇；經(jīng)過5～7代回交后自交，選出目標基因純合的植株進行抗性和農(nóng)藝性狀評價，獲得了Pi9、Pi2和Pi1與其他抗性基因組合的品系[111-113]。經(jīng)稻瘟病抗性鑒定和農(nóng)藝性狀調(diào)查分析，改良系在產(chǎn)量幾乎不受影響的情況下，抗性水平得到了明顯的提高。所獲改良系CNA20110332.2、CNA20110330.4、CNA20110334.0和CNA20110333.1等已在生產(chǎn)中得到應用，對水稻的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)提供了保障。

7 展望

稻瘟病一直伴隨著水稻的生產(chǎn)，由于病害的復雜性，本課題組仍在尋找有效的防治措施。經(jīng)過近15年的深入研究，已經(jīng)對稻瘟病的發(fā)生規(guī)律和防治方法有了較深入的認識。通過上述的研究，稻瘟病抗病機制逐漸顯現(xiàn)。更重要的是，本課題組和其他實驗室培育了一些生產(chǎn)上適用的抗病品種，表明了利用分子標記輔助育種將使抗病育種更加便利、快捷、有效。

然而，目前仍有許多問題存在。由于對這些抗病基因的抗性機制尚不明確，由遺傳背景導致的抗性差異的原因也不清楚；生產(chǎn)中使用的抗病基因數(shù)量有限，并且大多數(shù)已確定的抗性基因的防治效果較??；導致了目前抗病育種中存在著針對特定水稻種植區(qū)的可用基因數(shù)量有限和基因選擇的盲目性。此外，由于抗病性狀、農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀均受多基因控制，而且還可能存在選擇上的連鎖累贅，因此如何兼顧所有性狀仍是一個難題。綜合運用基因編輯、合成生物、分子設計和全基因組選擇可能是今后進行水稻性狀綜合改良的一種可行方法。