王俊曉 ，安 莉 ，馬 歡 ，許?？?，馬婧瑋 ，汪 紅 ，吳緒金 ，楊 靜 ，李 萌 *

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/河南省糧食質(zhì)量安全與檢測重點實驗室，鄭州 450002）

金銀花為常用中藥材之一，主要作用是清熱解毒、疏散風(fēng)熱[1]。近年來，受疫情因素的影響，金銀花的市場需求量進一步增大，但隨著人工種植面積的增加，病蟲害問題更加突顯，尤其是白粉病愈加突出[2]。目前，金銀花種植戶主要采取化學(xué)農(nóng)藥進行防治，但由于缺乏專業(yè)的培訓(xùn)，用藥不規(guī)范，造成作物中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，加重了對生態(tài)環(huán)境和人類身體健康的危害。吡唑醚菌酯作為德國巴斯夫公司生產(chǎn)的新型殺菌劑，被廣泛用于黃瓜、草莓、苦瓜等作物上白粉病的防治，其主要作用方式是通過阻止病菌線粒體呼吸作用，使病菌體內(nèi)供給細(xì)胞的正常代謝活動所需的能量減少，從而造成細(xì)胞的死亡[3-4]。

目前關(guān)于吡唑醚菌酯的研究主要包括對柑橘[5]、蘋果[6]、草莓[7]、桃[8]等作物的病蟲害防效，以及采用氣相色譜、液相色譜及串聯(lián)質(zhì)譜測定吡唑醚菌酯在作物上的殘留量。例如，楊茜茹等[9]選用乙腈作為提取液利用C18固相萃取柱和石墨化碳黑/氨基雙層固相萃取柱，采用氣相色譜檢測小麥樣品中吡唑醚菌酯殘留量。喻歆茹等[10]選用1.0%甲酸乙腈提取草莓樣品，采用分散固相萃取凈化，借助氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，測定吡唑醚菌酯的殘留量。劉霞等[11]選用乙腈提取蘋果樣品，經(jīng)弗羅里硅土固相萃取柱凈化，在波長為275 nm情況下，借助高效液相色譜配合紫外檢測器測定吡唑醚菌酯的殘留量。在膳食風(fēng)險評估方面，有研究報道桑椹中吡唑醚菌酯在各個年齡段上的慢性膳食攝入風(fēng)險為3.7%～22.3%[12]；小白菜、油麥菜和西葫蘆中吡唑醚菌酯的長期攝入風(fēng)險在0.7%～8.0%[13]。除此之外，吡唑醚菌酯在刺梨[14]、豇豆[15]和桑椹[12]等作物中的消解規(guī)律也有所報道。然而，關(guān)于吡唑醚菌酯在金銀花上殘留檢測消解動態(tài)和膳食風(fēng)險評估鮮少報道。本研究采用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜儀對金銀花中吡唑醚菌酯的殘留量進行檢測，分析其殘留消解動態(tài)，并對吡唑醚菌酯在普通消費人群中的膳食風(fēng)險進行評估，旨在為指導(dǎo)吡唑醚菌酯在金銀花上的合理使用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

供試試劑。25%吡唑醚菌酯SC，河南遠(yuǎn)見農(nóng)業(yè)科技有限公司；吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲酸（色譜純），CNW Technologies；乙腈（色譜純），默克股份兩合公司；氯化鈉（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；N-丙基乙二胺固相吸附劑（PSA）、十八烷基硅烷鍵合相吸附劑（C18），天津博納艾杰爾科技有限公司；提取溶液1（乙腈10 mL＋水10 mL）、提取溶液2（乙腈溶液10 mL＋水20 mL）。

供試儀器。LC/MS-8050超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津儀器公司；TARGIN?VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器，北京踏錦科技有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TDZ5-WS臺式低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 田間試驗方案

按照NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》要求，田間試驗于2020年進行，試驗地點詳見表1。將25%吡唑醚菌酯SC于金銀花白粉病初發(fā)時噴霧施藥。本試驗施藥劑量按農(nóng)藥標(biāo)簽規(guī)定設(shè)為250 mg/kg，施藥2次，施藥間隔7 d。于最后1次施藥后間隔2 h，3、5、7、10 d采集金銀花樣品進行消解試驗；于最后1次施藥后間隔7、10 d采集金銀花樣品進行最終殘留試驗。隨機在金銀花植株的不同部位采集生長正常、無病害的金銀花1.5 kg。將金銀花樣品均分為2組，其中一組用電熱鼓風(fēng)干燥箱烘干制成金銀花（干）樣品，另一組為金銀花（鮮）樣品，均置于-20℃冰柜保存。烘干方式：溫度設(shè)置為35℃，預(yù)熱30 min，金銀花樣品置于電熱鼓風(fēng)干燥箱，35℃維持1.5 h；溫度升高到40℃，維持10 h；溫度升高到50℃，維持10 h；溫度升高到55℃，維持2 h，烘干時間總共為24 h。

表1 試驗信息

1.3 提取及凈化

準(zhǔn)確稱取5.00 g金銀花樣品于100 mL離心管中，金銀花（鮮）加入提取溶劑1，金銀花（干）加入提取溶劑2，分別加入2.5 g氯化鈉，混勻后震蕩提取10 min，靜置5 min后于4 000 r/min離心10 min；取2 mL上清液置于含有0.03 g C18和0.02 g PSA吸附劑的5 mL離心管中，渦漩混勻2 min，4 000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜待測。

1.4 儀器條件

色譜條件。液相色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（3.0 mm ×100 mm，3.5 μm）；柱溫：40℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：1 μL。梯度洗脫條件見表2。

表2 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件。掃描方式：電噴霧離子源ESI＋；CID氣：270 Kpa；霧化氣流速：3.0 L/min；加熱氣流速：10 L/min；接口溫度：300℃；DL溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。吡唑醚菌酯定性離子對：387.9/163.2（m/z），碰撞電壓：25 eV；定量離子對：387.9/194.25（m/z），碰撞電壓：14 eV。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

稱取0.010 1 g吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品至燒杯中，加入乙腈溶解，并用10 mL容量瓶定容，制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別用乙腈、金銀花（鮮）空白基質(zhì)溶液和金銀花（干）空白基質(zhì)進行稀釋，稀釋成0.005、0.01、0.05、0.1、0.2 mg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.4條件下進行檢測。

1.6 添加回收測定

將濃度為0.01、0.1、1 mg/kg的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入金銀花空白對照樣品中，每檔濃度重復(fù)5次，按照1.4所述分析方法測定，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

基質(zhì)效應(yīng)。關(guān)于基質(zhì)效應(yīng)（ME）評價，需對標(biāo)準(zhǔn)曲線間斜率的比值按式（1）計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗證

吡唑醚菌酯在金銀花（鮮）和金銀花（干）中基質(zhì)效應(yīng)ME值分別為30%和22%，基質(zhì)效應(yīng)在20%～50%范圍內(nèi)。根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)，均屬于中等基質(zhì)效應(yīng)，因此可選用金銀花空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液并進行定量分析。

在0.005～0.2 mg/L范圍內(nèi)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x）與其峰面積（y）間的線性關(guān)系良好。金銀花（鮮）的線性回歸方程為y=57 684 904.195 5x＋214 657.593 7，R2=0.999 5；金銀花（干）線性回歸方程為y=62 037 055.927 6x＋822 620.717 3，R2=0.998 4。

當(dāng)吡唑醚菌酯的添加水平為0.01、0.1、1 mg/kg時，金銀花（鮮）的平均回收率為102%～108%，RSD為1.3%～1.4%；金銀花（干）的平均回收率為76%～80%，RSD為0.9%～2.4%。吡唑醚菌酯在金銀花中的定量限均為0.01 mg/kg，符合NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[18]規(guī)定，適用于殘留分析研究。

2.2 吡唑醚菌酯在金銀花中的消解行為

于2020年在河南焦作、湖南長沙兩地進行吡唑醚菌酯殘留消解試驗。吡唑醚菌酯在金銀花中的消解動態(tài)曲線符合一級動力學(xué)方程（圖1）。其中，河南焦作金銀花（鮮）和金銀花（干）半衰期分別為2.7和4.3 d，湖南長沙金銀花（鮮）和金銀花（干）半衰期分別為2.1和2.2 d（表3）。

圖1 吡唑醚菌酯在金銀花上的消解動態(tài)曲線

表3 吡唑醚菌酯在金銀花中的消解趨勢

2.3 吡唑醚菌酯在金銀花中的最終殘留量

于2020年在河南、湖南、山東、湖北四地進行最終殘留試驗。河南焦作的金銀花（鮮）和金銀花（干）中吡唑醚菌酯的最終殘留量分別為0.017～0.031 mg/kg和0.059～0.10 mg/kg；湖南長沙的金銀花（鮮）和金銀花（干）中吡唑醚菌酯的最終殘留量分別為0.019～0.060 mg/kg和0.035～0.092 mg/kg；山東泰安的金銀花（鮮）和金銀花（干）中吡唑醚菌酯的最終殘留量分別為0.028～0.041 mg/kg和0.13～0.21 mg/kg；湖北荊州的金銀花（鮮）和金銀花（干）中的吡唑醚菌酯最終殘留量分別為0.013～0.024 mg/kg和＜0.037 mg/kg。由于各個試驗地點的氣候、溫度、光照等天氣因素差異較大；不同品種的金銀花，導(dǎo)致作物形態(tài)有所區(qū)別，兩者共同作用使得吡唑醚菌酯降解存在差距，造成不同試驗地點的最終殘留量的差別[19-20]。

結(jié)果還顯示，河南焦作、湖南長沙、山東泰安和湖北荊州地區(qū)的吡唑醚菌酯在金銀花中的殘留量均隨著時間的延長而逐漸減少，說明吡唑醚菌酯在金銀花上的殘留量與采收時間呈負(fù)相關(guān)。

2.4 吡唑醚菌酯在金銀花中的膳食風(fēng)險評估

國際食品法典委員會（CAC）和我國未規(guī)定金銀花中吡唑醚菌酯的最大殘留限量[22]。為指導(dǎo)吡唑醚菌酯在金銀花上的合理使用，需對其進行膳食風(fēng)險評估?；谠囼炇仪捌趯︴r黃花菜和楊梅中吡唑醚菌酯的殘留結(jié)果，得到其對應(yīng)的淺色蔬菜和水果規(guī)范殘留試驗中值（STMR）分別為0.097和0.89 mg/kg。居民體重以63 kg計，我國規(guī)定吡唑醚菌酯的每日允許攝入量（ADI）為0.03 mg/kg bw，最后1次施藥后間隔7 d時，吡唑醚菌酯在金銀花上的規(guī)范STMR值為0.10 mg/kg，通過風(fēng)險評估模型（表4）計算出普通人群吡唑醚菌酯的國家估算每日攝入量（NEDI）為1.422 9 mg，占日允攝入量的75.29%，表明吡唑醚菌酯的殘留量對一般消費人群健康危害是可接受的。

表4 金銀花中吡唑醚菌酯的膳食風(fēng)險評估結(jié)果

3 結(jié)論與討論

當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)的絕對值范圍在0～20%時，屬于弱基質(zhì)效應(yīng)；范圍為20%～50%時，屬于中等基質(zhì)效應(yīng)；大于50%，屬于強基質(zhì)效應(yīng)。本試驗吡唑醚菌酯的|ME|在20%～50%的范圍內(nèi)，屬于中等基質(zhì)效應(yīng)。在使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析金銀花中吡唑醚菌酯殘留量時，建議使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量。

金銀花（干）原始沉積量和最終殘留量相對金銀花（鮮）較高，可能是由于吡唑醚菌酯的熱穩(wěn)定性較好，在金銀花烘干過程中，溫度對吡唑醚菌酯殘留量降解影響小。再者，烘干后金銀花（干）較金銀花（鮮）含水量低，對吡唑醚菌酯殘留量起到一定濃縮作用，導(dǎo)致單位質(zhì)量下金銀花（干）的殘留量較高。吡唑醚菌酯在金銀花（鮮）上的半衰期為2.1～2.7 d，在金銀花（干）上的半衰期為2.2～4.3 d，吡唑醚菌酯的半衰期均小于30 d，屬于易消解類農(nóng)藥。此外，金銀花的半衰期在兩地之間差異并不明顯，原因可能是溫度或氣候?qū)吝蛎丫埩袅康慕到庥绊戄^小。已有文獻報道吡唑醚菌酯在鐵皮石斛[22]、人參[23]、蒔蘿[24]和山藥[25]中的半衰期分別為38.1、0.2～8.4、2.7～10.1和4.3～9.9 d，由此可以看出吡唑醚菌酯在金銀花上的半衰期與人參、蒔蘿和山藥相似，但明顯短于鐵皮石斛。

25%吡唑醚菌酯SC在防治金銀花病害時，當(dāng)制劑施藥劑量為250 mg/kg，施藥2次，施藥間隔7 d，采收間隔期7 d時，金銀花（鮮）和金銀花（干）中的吡唑醚菌酯國家估算每日攝入量（NEDI）為1.422 9 mg，占日允許攝入量的75.29%，對一般消費人群健康危害是可接受的。