尹繼瑤，沈霞，胡靜，崔小敏，任慧，曲彤，李寧，屈凱，3#a，陳志永，#b（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 7083；.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 70003；3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病二科，西安 70003）

腎復(fù)康Ⅱ號膠囊（陜藥制字Z20130011）為陜西省中醫(yī)醫(yī)院的醫(yī)療機構(gòu)制劑，由山茱萸、菟絲子、熟地黃、淫羊藿、金櫻子、赤芍、丹參、黃芪、山藥、王不留行、姜黃、醋鱉甲12味中藥組成；其作為防治腎小球硬化的有效方劑，臨床療效顯著[1－4]。方中山茱萸能壯元氣，功專補陽固陰，菟絲子可溫腎固精，二者共為君藥；熟地黃能滋陰填髓，淫羊藿、金櫻子可溫腎壯陽，三者均能助君藥補腎之力；丹參、赤芍、姜黃能活血化瘀、散體內(nèi)凝滯之血，黃芪、山藥可補益脾氣以養(yǎng)腎，王不留行、醋鱉甲可活血通經(jīng)而散結(jié)；諸藥合用，共奏益腎散結(jié)之效。

本課題組的前期研究結(jié)果顯示，腎復(fù)康Ⅱ號膠囊組方及拆方均可調(diào)節(jié)Notch信號通路相關(guān)蛋白表達，從而抑制腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cells，GMCs）的晚期凋亡，有效改善腎小球硬化癥[3]；同時，其組方可抑制腎組織中纖溶酶原激活物抑制劑1和轉(zhuǎn)化生長因子 β1的表達，從而對抗腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[1，5－7]；此外，腎復(fù)康Ⅱ號膠囊亦可作用于肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）及其受體間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（c-mesenchymal-epithelial transition factor，c-Met），調(diào)控間充質(zhì)干細胞的旁分泌功能，起到改善腎功能的作用[8]。為提高腎復(fù)康Ⅱ號膠囊的質(zhì)量控制水平，本研究選取該制劑中各組方藥材在2020年版《中國藥典》（一部）[9]中的質(zhì)量控制成分，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定山茱萸中的莫諾苷、馬錢苷，赤芍中的芍藥苷，丹參中的丹酚酸B和淫羊藿中的淫羊藿苷含量，首次建立了該制劑的含量測定方法，以期保障其臨床使用的有效性和安全性。

1 材料

1.1 主要儀器

Agilent 1260系列HPLC儀系統(tǒng)（包括VWD檢測器和Agilent Chem Station工作站）購自美國Agilent公司；KQ-100型超聲波清洗機購自昆山超聲儀器有限公司；BS210S型電子分析天平（d＝0.1 mg）、BT25S型電子分析天平（d＝0.01 mg）均購自北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

腎復(fù)康Ⅱ號膠囊由陜西省中醫(yī)醫(yī)院生產(chǎn)，規(guī)格為0.3 g×45粒/瓶，批號分別為20201101、20201110、20210724、20210929、20211013。莫諾苷對照品（批號P11M11F2846，純度≥98.0%）、馬錢苷對照品（批號P24O11F128801，純度≥98.0%）、丹酚酸B對照品（批號P13N11F130912，純度≥98.0%）均購自上海源葉生物科技有限公司；芍藥苷對照品（批號MUST-17031901，純度≥99.3%）購自成都曼斯特生物科技有限公司；淫羊藿苷對照品（批號0737-200111，純度≥98.0%）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，10%A→20%A；20～30 min，20%A→30%A；30～40 min，30%A→40%A）；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；檢測波長為240 nm；進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷對照品各適量，置于10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋并定容，即得含莫諾苷0.240 mg/mL、馬錢苷0.242 mg/mL、芍藥苷0.350 mg/mL、丹酚酸B 0.236 mg/mL、淫羊藿苷0.259 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取腎復(fù)康Ⅱ號膠囊內(nèi)容物，研細，精密稱取0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，按料液比1∶100（g/mL）加80%甲醇50 mL使之溶解，稱定質(zhì)量；超聲（頻率40 kHz，功率300 W）處理30 min，冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻；經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照處方制劑工藝，分別制得缺山茱萸、缺赤芍、缺丹參和缺淫羊藿的陰性樣品，再分別按“2.2.2”項下方法制備各陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取上述供試品溶液、混合對照品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1）。由圖1可知，腎復(fù)康Ⅱ號膠囊中莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B、淫羊藿苷均能達到有效分離，理論板數(shù)分別為20 522、52 856、55 345、347 545、259 194，分離度分別為1.63、1.72、2.80、2.77、2.69，陰性樣品無干擾，表明該方法系統(tǒng)適用性良好。

圖1 腎復(fù)康Ⅱ號膠囊中5個成分的HPLC圖

2.4 線性關(guān)系、定量限和檢測限考察

精密量取上述混合對照品溶液0.2、0.5、1、2、5、10 mL，用80%甲醇分別定容至10 mL容量瓶中，再按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL，記錄峰面積。以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得到5個成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）和線性范圍，結(jié)果見表1。再以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限和檢測限，求得莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷的定量限分別為0.166、0.198、0.877、0.220、0.260 μg/mL，檢測限分別為0.056、0.066、0.292、0.073、0.086 μg/mL。

表1 5個成分的線性回歸考察結(jié)果

2.5 精密度考察

取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄各成分峰面積。結(jié)果顯示，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.42%、0.54%、1.62%、0.38%和0.23%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察

取同一批腎復(fù)康Ⅱ號膠囊（批號20201101）制備的供試品溶液，室溫存放，分別于0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分峰面積。結(jié)果顯示，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.65%、2.03%、0.62%、0.36%和2.36%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性考察

取同一批腎復(fù)康Ⅱ號膠囊（批號20201101），共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分峰面積，以外標法計算樣品中5個成分的含量。結(jié)果顯示，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷含量的RSD分別為1.66%、2.36%、1.09%、0.17%和1.45%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 準確度考察

精密稱取莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹酚酸B和淫羊藿苷對照品各適量，加80%甲醇溶解并稀釋，制成上述5個成分質(zhì)量濃度依次為1.000、0.816、2.984、2.860、0.616 mg/mL的單一對照品溶液。精密稱取已知5個成分含量的腎復(fù)康Ⅱ號膠囊（批號20201101）內(nèi)容物約0.25 g，共6份，精密加入各單一對照品溶液，再按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液后，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算各成分的平均加樣回收率，結(jié)果表明方法準確度良好，詳見表2。

2.9 樣品含量測定

取5批腎復(fù)康Ⅱ號膠囊，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分峰面積，以外標法計算樣品中5個成分的含量，每批樣品平行測定3次，結(jié)果見表3。

表3 莫諾苷等5個成分的含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 指標成分的選取

現(xiàn)代藥理研究證實，山茱萸中的莫諾苷可通過晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）-AGE受體（receptor of AGE，RAGE）信號通路抑制RAGE、核因子κB蛋白和絲裂原激活蛋白激酶的表達，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而起到對腎損傷的改善作用[10]；山茱萸中的馬錢苷可有效調(diào)節(jié)AGEs誘導(dǎo)GMCs產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕炎癥反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激，從而改善腎功能[11－12]；赤芍中的芍藥苷可以通過抑制硫氧還蛋白結(jié)合蛋白的表達而拮抗氧化應(yīng)激對GMCs的損傷，從而發(fā)揮腎臟保護作用[13－14]；丹參中的丹酚酸B可通過抗糖[15]、抗炎[16]、控制氧化應(yīng)激[17]等途徑減輕腎功能損傷；淫羊藿中的淫羊藿苷可通過免疫調(diào)節(jié)等作用改善腎功能[18]。以上5個成分均有良好的腎臟保護作用，且均為2020年版《中國藥典》（一部）中各藥材的質(zhì)量控制成分[9]，因此，本研究選取其作為腎復(fù)康Ⅱ號膠囊的質(zhì)量控制指標成分。

3.2 供試品溶液制備方法的考察

為優(yōu)化供試品溶液的制備方法，本研究分別考察了提取溶劑（乙醇、甲醇、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇）、提取方式（超聲提取、加熱回流提?。?、提取時間（15、30、45 min）、料液比（1∶50、1∶100、1∶150，g/mL）、提取次數(shù)（1、2、3次）對提取效果的影響，最終確定的制備方法為：以80%甲醇為提取溶劑，料液比為1∶100（g/mL），超聲提取1次，提取30 min。

3.3 色譜柱和流動相等色譜條件的考察

本研究考察了月旭XB-C18、Agilent 5 TC-C18這2種色譜柱對指標成分峰形的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用這2種色譜柱所得5個成分的峰形相近，即兩者均可用于腎復(fù)康Ⅱ號膠囊的含量測定。同時，還考察了不同柱溫（25、30、35℃）對5個成分分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個成分在30℃時的分離效果最佳，故最終選擇Agilent 5 TC-C18色譜柱，并將柱溫設(shè)置為30℃。

本研究考察了甲醇-磷酸溶液、甲醇-甲酸溶液、乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液等流動相系統(tǒng)，并考察了不同濃度（0.1%、0.3%）的甲酸、磷酸對5個成分分離度的影響。結(jié)果顯示，采用乙腈作為流動相系統(tǒng)時，色譜峰基線較平穩(wěn)、分離度較好；甲酸和磷酸的濃度對最終的分離效果影響不大，但磷酸的分離度優(yōu)于甲酸，故最終選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相。

3.4 檢測波長的選擇

由2020年版《中國藥典》（一部）[9]及相關(guān)文獻可知，上述5個成分的最佳檢測波長不同，最大吸收在230～270 nm之間。本研究考察了230～270 nm之間不同波長（230、240、260、270 nm）下各成分的出峰情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在240 nm波長下各成分分離度較高、峰形較好，故以240 nm為檢測波長。

綜上，本研究選取了腎復(fù)康Ⅱ號膠囊中含量較高且與其臨床藥效緊密相關(guān)的5個成分作為指標成分，首次建立了該制劑的多指標含量測定方法。該方法簡便、準確、重復(fù)性好，有助于提升腎復(fù)康Ⅱ號膠囊的質(zhì)量控制水平，保證其臨床應(yīng)用的有效性和安全性。