李振宇 ,趙建霞 ,張國亮,3 ,王曉彤 ,王瑛 ,徐靖 ,李明焱,李振皓,3?

(1.浙江壽仙谷植物藥研究院有限公司,浙江 杭州 310000;2.浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司,浙江 武義 321200;3.浙江省珍稀植物藥工程技術(shù)研究中心,浙江 武義 321200;4.壽仙谷珍稀藥材產(chǎn)品省級重點(diǎn)農(nóng)業(yè)企業(yè)研究院,浙江 武義 321200)

機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)能識別并排除異己抗原性物質(zhì)以及體內(nèi)發(fā)生突變的腫瘤細(xì)胞、衰老細(xì)胞、死亡細(xì)胞等,從而維持機(jī)體生理動態(tài)平衡與穩(wěn)定性。人體免疫系統(tǒng)的紊亂會誘發(fā)多種疾病,目前臨床上主要應(yīng)用胸腺肽、球蛋白等免疫增強(qiáng)劑來提高患者免疫功能,但會伴有不同程度的副作用,如過敏、肝腎損傷、繼發(fā)性重癥感染等[1]。相比之下,中藥對免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用,可增強(qiáng)機(jī)體免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子的作用,也可協(xié)助機(jī)體對抗炎癥、自身免疫性疾病、超敏反應(yīng)、排斥反應(yīng)。免疫調(diào)節(jié)的雙向性與中藥劑量、機(jī)體的機(jī)能狀態(tài)、中藥的不同成分等有關(guān)[2]。

鐵皮石斛 (Dendrobiumofficinale) 為藥用蘭科植物的莖,在中國及許多亞洲國家被作為一種傳統(tǒng)草藥廣泛應(yīng)用,具有益胃生津、滋陰清熱的功效,可用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足等?，F(xiàn)代研究[3]表明,鐵皮石斛含有多糖、黃酮、酚酸、芪類等多種化學(xué)成分,在增強(qiáng)免疫、降血糖、抗腫瘤等方面具有良好作用。鐵皮石斛多糖的2 個亞組分DOPa 及DOPb,可增強(qiáng)小鼠RAW264.7 細(xì)胞的增殖及吞噬作用,誘導(dǎo)TNF-α 的分泌和淋巴細(xì)胞的增殖,且具有劑量依賴性[4]。口服鐵皮石斛細(xì)粉及石斛粗多糖均可以顯著增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫和非特異性免疫,明顯促進(jìn)了小鼠脾細(xì)胞IFN-γ 的分泌,口服鐵皮石斛后,體液免疫力也得到增強(qiáng)[5]。鐵皮石斛超微粉末和鐵皮石斛水提物可使細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核巨噬細(xì)胞吞噬功能和NK 細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)[6]。

目前,多糖被認(rèn)為是鐵皮石斛調(diào)節(jié)免疫的主要活性成分之一。但是,鐵皮石斛中含有的黃酮、酚酸類成分也可能具有免疫調(diào)節(jié)活性[7],但活性成分尚未系統(tǒng)闡明,相關(guān)的藥效學(xué)及作用機(jī)制研究也較少。本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),探究鐵皮石斛具有免疫活性的小分子成分及其潛在的作用靶點(diǎn)及通路,從系統(tǒng)性和整體性出發(fā),揭示鐵皮石斛中參與免疫調(diào)節(jié)的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制,為鐵皮石斛的深入開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 化合物篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

從文獻(xiàn)以及數(shù)據(jù)庫中收集鐵皮石斛的小分子化合 物,再通過 SwissADME (http://www.swissadme.ch/) 進(jìn)一步篩選潛在活性較高的優(yōu)效化合物。篩選標(biāo)準(zhǔn)為:藥代動力學(xué)中胃腸吸收(GI bsorption) 高,類藥性 (Druglikeness) 指標(biāo)中Lipinski、Ghose 等指標(biāo)存在2 個或以上 “YES”。

通過 Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) 預(yù)測化合物相應(yīng)靶點(diǎn),選擇物種為 “Homo sapiens”,篩選possibility 大于0.1 的靶點(diǎn)。

1.2 免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)的檢索

在Genecards 數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中以 “immunoregulation” 為關(guān)鍵詞,搜集免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的靶點(diǎn),將免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的靶點(diǎn)集與鐵皮石斛候選靶點(diǎn)集取交集,作為鐵皮石斛免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)。通過Cytoscape 建立化合物-鐵皮石斛免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將鐵皮石斛免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/) 網(wǎng)站,限定物種選擇“Homo sapiens”,將Combined score 大于0.9 的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò),通過Cytoscape 軟件中工具欄中 “Analysis Network” 功能對整個PPI 網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行計算,以 “度(degree) ” 的2 倍中位數(shù)、緊密度 (Closeness)和介數(shù) (Betweenness) 的中位數(shù)為卡值,篩選核心靶點(diǎn),并在PPI 網(wǎng)絡(luò)圖查看核心靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。

1.4 核心靶點(diǎn)生物學(xué)功能富集分析

通過R 語言Cluster Profiler 包對核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析和KEGG 分析,從生物過程、分子水平、細(xì)胞水平3 個方面分別進(jìn)行GO 富集分析,并進(jìn)一步對其進(jìn)行KEGG 通路富集分析。以P<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,并將結(jié)果以條形圖和氣泡圖的形式輸出。

為了說明鐵皮石斛核心靶點(diǎn)與化合物、通路間的相互作用關(guān)系,通過 Cytoscape 軟件中的“merge” 功能,將化合物-鐵皮石斛免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、核心靶點(diǎn)-生物功能網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整合,建立化合物-核心靶點(diǎn)-生物功能網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)效化合物篩選及免疫靶點(diǎn)預(yù)測

本研究從文獻(xiàn)中共篩選鐵皮石斛優(yōu)效化合物124 個,包括7 個菲類化合物、26 個聯(lián)芐類化合物、15 個酚類化合物、50 個酸類化合物、5 個酰胺類化合物、12 個黃酮類化合物、9 個其他化合物,共預(yù)測到相關(guān)靶點(diǎn)421 個。

通過Genecards 數(shù)據(jù)庫獲得免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)569 個,通過與鐵皮石斛的421 個候選靶點(diǎn)取交集,獲得58 個共有靶點(diǎn),對應(yīng)60 個化合物,構(gòu)建化合物-鐵皮石斛免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 (圖1)。外層紅色節(jié)點(diǎn)為60 個化合物,內(nèi)部綠色節(jié)點(diǎn)為58 個免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn),共321 條邊,節(jié)點(diǎn)的大小與度值成正比,且節(jié)點(diǎn)按度值大小順時針排列,每個化合物平均與5.35 個靶點(diǎn)相互作用,每個靶點(diǎn)平均與5.53 個化合物相互作用。度值最大的10 個化合物包括 2-O-甲基槲皮素 (Di-Omethylquercetin)、槲皮素 (Quercetin)、金圣草黃素 (5-7-Dihydroxy-2-4-hydroxy-3-methoxyphenyl-4H-1-benzopyran-4-one)、異鼠李 素 (Isorhamnetin)、芹菜素 (Apigenin)、二氫槲皮素 (Taxifolin)、二氫阿魏酸酪胺 (Dihydro feruloyltyramine)、柚皮素(Naringenin)、鐵皮石斛素M (Dendrocandin M)、丁香樹脂酚 ((-) Syringaresinol),其中包括8 個黃酮、1 個聯(lián)芐、1 個木脂素。

圖1 化合物-鐵皮石斛免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2 免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將58 個共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫,篩選靶點(diǎn)間相互作用得分大于0.9 的靶點(diǎn)繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖 (圖2)。共41 個靶點(diǎn)存在明顯的相互作用關(guān)系,節(jié)點(diǎn)大小與顏色深度均與度值成正比,節(jié)點(diǎn)間連線的粗細(xì)與相關(guān)強(qiáng)度成正比。其中節(jié)點(diǎn)最大的9 個靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn),包括TNF、SRC、VEGFA、AKT1、MMP9、STAT1、NOS2、MAPK14、EGFR,提示鐵皮石斛可以通過這9 個核心靶點(diǎn)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

圖2 鐵皮石斛免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.3 核心靶點(diǎn)生物學(xué)功能富集分析

基于R 語言對核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析和KEGG分析,GO 分析獲得2 059 個條目,KEGG 分析獲得153 個代謝通路,篩選了較顯著的GO 注釋結(jié)果和KEGG 通路進(jìn)行作圖。細(xì)胞組分注釋結(jié)果如圖3中A,主要涉及膜筏 (membrane raft)、膜微結(jié)構(gòu)域 (membrane microdomain)、膜區(qū) (membrane region)、嚢腔 (vesiclelumen)、多泡體(multivesicular body) 等細(xì)胞組分;生物過程注釋結(jié)果如圖3 中B,主要涉及對活性氧類的響應(yīng)(response to reactive oxygen species)、肽基絲氨酸磷酸化 (peptidyl-serine phosphorylation)、肌肉細(xì)胞增殖 (muscle cell proliferation)、肽基絲 氨酸修飾(peptidyl-serine modification)、平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)控 (positive regulation of smooth muscle cell proliferation) 等;分子水平注釋結(jié)果如圖3 中C,主要涉及蛋白磷酸酶結(jié)合 (protein phosphatase binding)、磷酸酶結(jié)合 (phosphatase binding)、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性 (nitric-oxide synthase regulator activity)、鈣調(diào)素結(jié)合 (calmodulin binding)、蛋白磷酸酶2A 結(jié)合 (protein phosphatase 2A binding)等。KEGG 通路富集結(jié)果如圖3 中D,主要涉及松弛素信號通路 (relaxin signaling pathway)、癌癥中的蛋白多糖 (proteoglycans in cancer)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化 (fluid shear stress and atherosclerosis)、乙型肝炎 (hepatitis B)、肺結(jié)核(tuberculosis) 等。

圖3 核心靶點(diǎn)GO、KEGG 富集分析結(jié)果

建立化合物-核心靶點(diǎn)-生物功能網(wǎng)絡(luò)圖 (圖4),中間豎排黃色節(jié)點(diǎn)為核心靶點(diǎn),左側(cè)圈狀排列紅色節(jié)點(diǎn)為鐵皮石斛化合物,右側(cè)圈狀排列綠色節(jié)點(diǎn)為核心靶點(diǎn)富集到的生物功能,節(jié)點(diǎn)大小與度值成正比,且化合物、生物功能節(jié)點(diǎn)按度值大小順時針排列,靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)按度值大小自上而下排列。其中EGFR 度值最高,其與11 個化合物及40 個生物功能相連接,揭示鐵皮石斛中2-O-甲基槲皮素、異鼠李素、槲皮素、5-7-羥基-2-4-羥基-3-金圣草黃素、芹菜素、秦皮乙素、N-反式阿魏酰酪胺、對羥基苯丙酸、p-羥基苯丙酸、二氫阿魏酸酪胺、阿魏酸酰胺等11 個化合物可通過EGFR 等靶點(diǎn)及40個生物功能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

圖4 化合物-核心靶點(diǎn)-生物功能網(wǎng)絡(luò)

3 討論

免疫系統(tǒng)是維持機(jī)體生理動態(tài)平衡與穩(wěn)定性的重要條件,病毒感 染、炎 癥[8]、糖尿病[9]、癌癥[10]等疾病的治療效果與愈后與機(jī)體免疫密切相關(guān)。此次新冠疫情中也發(fā)現(xiàn),感染新冠病毒后是否轉(zhuǎn)為重癥與機(jī)體免疫狀態(tài)相關(guān)[11]。本研究以鐵皮石斛中菲類、聯(lián)芐類、酚類、酸類、酰胺類、黃酮類等小分子化合物為研究對象,運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究鐵皮石斛中免疫活性成分及其作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示,鐵皮石斛中黃酮類小分子化合物為主要的潛在免疫活性成分,主要通過TNF、SRC、VEGFA、AKT1、MMP9、STAT1、NOS2、MAPK14、EGFR 等靶點(diǎn)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

通過文獻(xiàn)對篩選的免疫活性成分的作用機(jī)制及靶點(diǎn)進(jìn)行初步驗(yàn)證。在10 個潛在的免疫活性化合物中,8 個為黃酮類化合物。其中,槲皮素有22個潛在免疫靶點(diǎn),研究表明,槲皮素可以通過增強(qiáng)中性粒細(xì)胞趨化性、巨噬細(xì)胞吞噬作用、NK 細(xì)胞裂解活性、淋巴細(xì)胞增殖速率等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[12]。異鼠李素、柚皮素分別有20 和11 個潛在免疫相關(guān)靶點(diǎn),是較為常見的黃酮類化合物,在款冬花、藿香等中藥以及清肺排毒湯中也有相關(guān)報道[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn),異鼠李素、槲皮素、柚皮素等可以通過抑制細(xì)胞因子的釋放,緩解過度的免疫反應(yīng)、消除炎癥,可能也是清肺排毒湯重要的藥效成分。芹菜素有19 個潛在免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn),其通過增多氧和氮自由基、抗體生成來增強(qiáng)免疫反應(yīng)[15]。Zhang 等[16]研究發(fā)現(xiàn),芹菜素通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中的多個信號通路,顯著抑制脂多糖 (LPS) 誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子 (如IL-6、IL-1β 和TNF-α) 的產(chǎn)生。Coelho 等[17]研究發(fā)現(xiàn),芹菜素可恢復(fù)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的免疫特性。Taxifolin 有15 個潛在免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn),Jung等[18]研究發(fā)現(xiàn),槲皮素、二氫槲皮素化合物在10～500 μmol·L-1濃度范圍內(nèi),強(qiáng)烈抑制胸腺嘧啶與DNA 的結(jié)合,在低濃度下,對胸腺嘧啶與DNA 的結(jié)合具有輕微增強(qiáng)作用,說明槲皮素、二氫槲皮素化合物對免疫細(xì)胞的影響具有雙向調(diào)節(jié)作用。上述文獻(xiàn)與本文結(jié)果一致,說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法具有良好的準(zhǔn)確性,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果需通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。

本研究也發(fā)現(xiàn),鐵皮石斛可作用于 TNF、SRC、VEGFA、AKT1、MMP9、STAT1、NOS2、MAPK14、EGFR 等核心靶點(diǎn)。TNF 作為一種炎性細(xì)胞因子,在急性炎癥過程中由巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞、T 細(xì)胞等分泌,可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,具有抗感染和抗癌作用[19],同時也具有引發(fā)炎癥反應(yīng)的不良作用[20]。SRC 家族激酶構(gòu)成了先天細(xì)胞中表達(dá)最大的胞質(zhì)酪氨酸激酶家族,這些激酶被認(rèn)為是許多免疫細(xì)胞受體下游的主要信號分子,包括免疫受體、細(xì)胞因子受體、整合素和各種病原體受體[21]。血管內(nèi)皮生長因子 (VEGFA) 家族通過直接抑制抗原呈遞細(xì)胞以及免疫效應(yīng)細(xì)胞或增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞 (MDSC) 的作用來驅(qū)動免疫抑制;免疫抑制性細(xì)胞也可以驅(qū)動血管生成,從而導(dǎo)致免疫激活受損的惡性循環(huán)[22]。AKT1 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 (AKT) 之一,AKT 信號通路成分調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的存活、遷移和增殖,也可以協(xié)調(diào)巨噬細(xì)胞對不同代謝和炎癥信號的反應(yīng)[23]。MMP9 參與了免疫/炎癥反應(yīng),具有加工和激活各種細(xì)胞因子和趨化因子的能力,如果釋放不當(dāng),MMP9 會導(dǎo)致多種腦部疾病,如癲癇、精神分裂癥、自閉癥譜系障礙、腦損傷、中風(fēng)、神經(jīng)退行性疾病、疼痛、腦瘤等[24]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器和轉(zhuǎn)錄激活器 (STAT1),介導(dǎo)細(xì)胞對干擾素 (IFNs)、細(xì)胞因子和生長因子的反應(yīng),使細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài)[25-26]。NOS2 是一種在全身具有多種功能的信使分子,能產(chǎn)生一氧化氮 (NO),NO 水平的變化會影響組織氧化還原環(huán)境和免疫力[27]。星形膠質(zhì)細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶 (MAPK14) 主要調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(TNFα、IL-6) 和趨化因子(CCL2、CCL4、CXCL1、CXCL2、CXCL10) 的特定亞群,從而影響星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫激活[28]。表皮生長因子 (EGFR) 突變導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌NSCLC 微環(huán)境中免疫浸潤的減少或免疫細(xì)胞的浸潤不足[29]。

在2 059 個GO 條目及153 個KEGG 代謝通路中,以P值靠前的生物功能為依據(jù),發(fā)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)過程涉及的主要細(xì)胞組分為細(xì)胞質(zhì)膜,涉及的主要分子水平有磷酸酶結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、鈣調(diào)素結(jié)合,涉及的生物過程主要有活性氧類的回應(yīng)、肌肉細(xì)胞增殖、肽基絲氨酸修飾調(diào)控等。KEGG 信號通路主要涉及松弛素信號通路、癌癥中的蛋白多糖、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、肺結(jié)核等。綜上所述,鐵皮石斛中的2-O-甲基槲皮素、槲皮素、金圣草黃素、異鼠李素等主要活性成分可能通過免疫因子、免疫細(xì)胞等相關(guān)信號通路 作用于 TNF、SRC、VEGFA、AKT1、MMP9、STAT1、NOS2、MAPK14、EGFR 等關(guān)鍵靶點(diǎn),發(fā)揮雙向免疫調(diào)節(jié)作用。上述結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步從分子、細(xì)胞及整體動物層面進(jìn)行驗(yàn)證。