陳知龍 ,鄭佳豪 ,吳坤龍 ,張壹

(1.文成縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)研究院,浙江 文成 325300;2.文成縣科學(xué)技術(shù)局,浙江 文成 325300)

薯蕷屬 (Dioscorea) 是被子植物門(mén)單子葉植物綱薯蕷目薯蕷科下的一個(gè)屬,目前該屬已知植物有600 種以上,多為纏繞藤本,有地下塊狀或根狀塊莖是該屬的主要特征[1]。薯蕷屬植物中許多種類(lèi)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,如溫帶地區(qū)普遍栽種的薯蕷(D.opposita),熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛栽種的參薯(D.alata)、甜薯 (D.esculenta) 可以供食用和藥用;盾葉薯蕷 (D.zingibernsis)、穿龍薯蕷(D.nipponica)、黃山藥 (D.panthaica) 等植物的根狀莖中含有薯蕷皂苷元,是合成避孕藥及生產(chǎn)甾體激素類(lèi)藥物的重要原料;薯莨 (D.cirrhosa)的塊莖富含縮合性鞣質(zhì)和酚類(lèi)化合物,常用于止血、治療潰瘍、抗菌消炎,也可用于制革等。

淀粉是薯蕷屬植物塊莖的重要組成成分,山藥塊莖中的淀粉可占干物質(zhì)的50%～80%[2]。淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種形態(tài),在淀粉合成過(guò)程中,顆粒結(jié)合淀粉合成酶 (granule-bound starch synthase,GBSS) 是控制直鏈淀粉合成的關(guān)鍵蛋白質(zhì),負(fù)責(zé)催化生成線(xiàn)性多聚葡萄糖分子[3]。該蛋白由GBSS基因來(lái)編碼,該基因也稱(chēng)糯性基因(Waxy),或蠟質(zhì)基因。GBSS基因廣泛存在于大麥、小麥、水稻、玉米、番茄、馬鈴薯等作物中,且已被克隆。研究[4]已證明Waxy基因突變導(dǎo)致胚乳中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量及比例發(fā)生變化,是禾谷類(lèi)作物糯性形成的根本原因。對(duì)于薯蕷屬植物GBSS基因的研究還鮮有報(bào)道,僅吳志剛等[5]克隆了參薯種糯性栽培品系-文成糯米山藥的GBSS基因序列,并進(jìn)行了初步的基因結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)進(jìn)化分析。本研究主要通過(guò)生物信息學(xué)分析,比較分析參薯、幾內(nèi)亞白山藥、灌叢薯蕷和盾葉薯蕷4 種薯蕷屬植物GBSS基因結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育特點(diǎn)。研究結(jié)果將為進(jìn)一步闡述薯蕷屬植物GBSS基因及其編碼蛋白調(diào)控淀粉合成的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 電子克隆

以文成糯米山藥GBSS基因序列為探針,BLAST 檢索美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (National center for biotechnology information,NCBI,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中的參薯[D.alata(taxid:55 571)]、幾內(nèi)亞白山藥[D.rotundata(taxid:55 577)]、灌叢薯蕷[D.dumetorum(taxid:167 584)]、盾葉薯蕷[D.zingibernsis(axid:325984)] 基因組數(shù)據(jù)庫(kù),同源比對(duì)獲得4 種薯蕷屬植物GBSS基因同源序列。

1.2 基因結(jié)構(gòu)與GBSS 蛋白結(jié)構(gòu)分析

以NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已注釋的玉米、番茄、馬鈴薯等植物GBSS基因結(jié)構(gòu)為參考,使用同源比對(duì)方法分析5 種薯蕷屬植物的GBSS基因結(jié)構(gòu)。利用mVISTA (http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml)程序比較分析5 種薯蕷屬植物GBSS基因組序列同源 性。利用 Interpro 數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) 對(duì)GBSS 蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)功能域分析。

1.3 GBSS 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

從 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲取小麥 (Triticum aestivum,AAL05405)、大麥 (Hordeumvulgare,AAM74048)、節(jié)節(jié)麥 (Aegilopstauschii,XP _020188467)、水稻 (Oryzasativa,XP_015644489)、小米 (Setariaitalica,NP_001267750)、玉米 (Zea mays,NP _001358937)、高粱 (Sorghumbicolor,XP_002436418)、鐵皮石斛 (Dendrobiumcatenatum,XP _ 028549213)、油棕 (Elaeisguineensis,XP _010940833)、芭蕉(Musaacuminata,XP_009415991)、茶樹(shù) (Camelliasinensis,XP_028108084)、擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP _ 174566)、番茄(Solanumlycopersicum,NP _001311458)、馬鈴薯(Solanumtuberosum,NP _ 001274918)、煙草(Nicotianatabacum,NP _ 001311577)、辣椒(Capsicumannuum,XP _ 016564900)、牽?；?Ipomoeatriloba,XP _ 031124794)、羽扇豆(Lupinusangustifolius,XP _019431273)、百脈根(Lotusjaponicus,ACB30384)、蘋(píng)果 (Malus domestica,NP_001280924)、油桃 (Prunuspersica,XP_007211283) 和木薯 (Manihotesculenta,XP_021603997) 22 種被子植物的GBSS 蛋白序列。利用ClustalX 2.0 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的多重序列比對(duì),MEGA7 軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),并對(duì)生成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行 Bootstrap 校正,循環(huán)次數(shù)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 GBSS 基因結(jié)構(gòu)分析

以文成糯米山藥GBSS基因序列為探針,通過(guò)同源比對(duì)方法獲得參薯、幾內(nèi)亞白山藥、灌叢薯蕷和盾葉薯蕷GBSS基因的基因組核苷酸序列。參照玉米、番茄、馬鈴薯等已詳細(xì)注釋的GBSS基因結(jié)構(gòu),同源比對(duì)分析獲得5 種薯蕷屬植物的GBSS基因結(jié)構(gòu) (表1)。從表中我們可以看出5 種薯蕷屬植物的GBSS基因結(jié)構(gòu)高度相似,都包含13 個(gè)可編碼蛋白質(zhì)的外顯子和12 個(gè)內(nèi)含子,其中第2～12外顯子的大小在所列物種間高度保守。

表1 薯蕷屬植物GBSS 基因結(jié)構(gòu)分析

以文成糯米山藥GBSS基因組核苷酸序列為參照,比較分析參薯、幾內(nèi)亞白山藥、灌叢薯蕷和盾葉薯蕷與文成糯米山藥GBSS基因組核苷酸序列的同源性差異 (圖1)。從圖中可以發(fā)現(xiàn),不管是外顯子序列還是內(nèi)含子序列,文成糯米山藥的GBSS基因序列均與參薯高度同源,這也一定程度說(shuō)明了文成糯米山藥是參薯種的一個(gè)地方栽培品系。盾葉薯蕷的GBSS基因序列與文成糯米山藥保守性稍差,但其外顯子序列的保守性明顯高于內(nèi)含子。

圖1 薯蕷屬植物GBSS 基因組序列同源性比較分析

2.2 GBSS 蛋白結(jié)構(gòu)分析

參薯、幾內(nèi)亞白山藥、灌叢薯蕷和盾葉薯蕷GBSS基因的編碼區(qū)核苷酸長(zhǎng)度依次為1 845、1 842、1 863 和1 839 bp,分別編 碼614、613、620 和612 個(gè)氨基酸。4 種薯蕷屬植物GBSS基因的編碼區(qū)核苷酸序列與文成糯米山藥的同源性分別為99.3%、97.4%、90.5% 和85.4%,其 編碼的GBSS 蛋白氨基酸序列與文成糯米山藥的同源性分別為98.7%、95.3%、86.3%和81.9%。

GBSS 蛋白屬于淀粉合成酶類(lèi)蛋白質(zhì),除N 端含有一段70 多個(gè)氨基酸組成的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽外,還包含一個(gè)淀粉合成酶催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域 (圖2)。選取玉米、小米為單子葉代表植物,擬南芥、馬鈴薯為雙子葉代表植物,與5 種薯蕷屬植物GBSS 蛋白進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)分析。從圖3 中可以看出,GBSS 蛋白N 端質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的保守性較差,但淀粉合成酶催化結(jié)構(gòu)域和糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域高度保守,這說(shuō)明GBSS基因的淀粉合成功能在植物進(jìn)化過(guò)程中高度保守。

圖2 GBSS 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

圖3 GBSS 蛋白氨基酸序列分析

2.3 GBSS 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了分析不同薯蕷屬植物的GBSS 蛋白之間,以及與其他植物GBSS 蛋白間的進(jìn)化關(guān)系,我們選取5 種薯蕷屬植物以及玉米、小米、擬南芥、馬鈴薯等22 種其他植物的GBSS 蛋白進(jìn)行同源比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) (圖4)。從進(jìn)化角度上看,不同植物的GBSS 蛋白在進(jìn)化過(guò)程中可分為單子葉植物和雙子葉植物兩個(gè)分支。文成糯米山藥GBSS 蛋白在所列薯蕷屬植物中與參薯GBSS 蛋白的親緣關(guān)系最近,與盾葉薯蕷GBSS 蛋白親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。薯蕷屬植物GBSS 蛋白與屬于天門(mén)冬目植物的鐵皮石斛GBSS 蛋白的進(jìn)化距離較近,與油棕目、姜目、禾本目植物的GBSS 蛋白都屬于單子葉植物進(jìn)化分支。

圖4 多種植物GBSS 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討論

淀粉是高等植物光合產(chǎn)物主要的儲(chǔ)存形式,可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對(duì)含量可以影響淀粉的口感、黏性、糊化性以及回生性等特性[6]。植物中有多種酶參與淀粉的合成,其中顆粒結(jié)合淀粉合成酶 (GBSS) 被認(rèn)為在直鏈淀粉的延長(zhǎng)中扮演著重要角色[3],它催化形成α-1,4-糖苷鍵,將葡萄糖單元連接在α-1,4-葡聚糖的非還原端,延長(zhǎng)α-1,4-葡聚糖鏈。

GBSS 蛋白不能正常表達(dá)或活性下降是禾谷類(lèi)作物糯性形成的根本原因。研究已證明,糯稻主要是由GBSSI基因第1 內(nèi)含子5′端G/T 突變和第2外顯子23 bp 堿基片段插入,引起前體mRNA 不能正常剪切,導(dǎo)致GBSSI表達(dá)量減少所形成的[7]。糯玉米的兩種缺失突變體Wx-D7 和Wx-D10 分別是由于GBSSI基因第7 外顯子和第10 外顯子內(nèi)堿基缺失造成GBSSI 蛋白功能喪失形成的[8-9]。糯性大麥GBSSI基因啟動(dòng)子區(qū)397 bp 堿基缺失則造成了基因啟動(dòng)子活性比非糯性大麥弱[10]。控制小麥GBSS 蛋白表達(dá)的Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1 3 個(gè)等位基因發(fā)生突變都會(huì)影響小麥的糯性,其中缺少3 個(gè)Wx 亞基就會(huì)得到糯小麥[11]。

利用現(xiàn)代生物技術(shù)突變GBSS基因或降低GBSS 蛋白表達(dá)也可以使作物獲得糯性特點(diǎn)。利用RNA 沉默策略轉(zhuǎn)化小麥,降低GBSS 蛋白表達(dá)可以顯著下降小麥籽粒胚乳中直鏈淀粉含量[12]。利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對(duì)水稻W(wǎng)axy基因的外顯子區(qū)核苷酸序列實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變,可以將直鏈淀粉含量從親本的15.5%降到2.0%～2.6%,接近或達(dá)到糯稻水平[13]。馬鈴薯GBSS4 個(gè)等位基因經(jīng)CRISPR/Cas9 基因編輯均產(chǎn)生突變的突變體則完全缺少了直鏈淀粉的合成[14]。淀粉也是薯蕷屬植物地下塊莖的重要組成成分,因此,深入解析薯蕷屬植物GBSS基因的結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn),可為今后調(diào)控薯蕷屬植物直鏈和支鏈淀粉合成,以滿(mǎn)足食品、醫(yī)藥、工業(yè)等行業(yè)對(duì)不同性質(zhì)淀粉的需要提供科學(xué)依據(jù)。