丁錢華

(1.杭州蕭山丁家莊農(nóng)機專業(yè)合作社,浙江 杭州 311256;2.浙江農(nóng)藝師學院,浙江 杭州 310021)

由真菌、細菌、病毒、線蟲和原生動物等各種植物病原微生物引起的農(nóng)作物病害會嚴重影響全球范圍內(nèi)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn),同時導致糧食產(chǎn)量與糧食安全的大幅下降。20%～40%的農(nóng)作物產(chǎn)量損失是由病原微生物感染引起的[1]。減少農(nóng)作物病害發(fā)生的防治措施目前主要有一系列農(nóng)藥的使用以及抗性作物的研發(fā)等,但是這兩者都存在一定的局限性。過度使用合成農(nóng)藥會對環(huán)境和其他非靶標生物產(chǎn)生不良影響,擾亂生態(tài)系統(tǒng)功能,降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)性[2]。2022 年1 月,中央五部門聯(lián)合印發(fā) 《農(nóng)業(yè)農(nóng)村污染治理攻堅戰(zhàn)行動方案 (2021—2025年) 》,強調(diào)要深入實施化肥農(nóng)藥減量增效行動?？剐宰魑镫m然具有很強的抗病能力,但是往往產(chǎn)量不如普通作物,需要考慮產(chǎn)量與抗病性的平衡[3]。因此,亟需一種更加穩(wěn)定、可靠以及環(huán)境友好型的農(nóng)作物病害防治措施。利用微生物進行農(nóng)作物病害的防治是一種創(chuàng)新的方法,不僅能夠直接對植物病原體產(chǎn)生拮抗作用,更能夠全面提高農(nóng)作物的抗病能力[4]。生物防治的定義是利用有益微生物減少病原微生物對農(nóng)作物的負面影響以及提升農(nóng)作物免疫能力[5]。

小麥 (TriticumaestivumL.) 作為世界三大谷物之一,供給著世界三分之一的人口,是世界范圍內(nèi)重要的糧食作物之一。隨著世界人口持續(xù)不斷的增長,人們對小麥產(chǎn)量的提升也提出更高的要求。但是,小麥生產(chǎn)過程中非常容易遭受根腐病、全蝕病以及紋枯病等土壤病害的侵害,導致產(chǎn)量受損,進而影響糧食供給[6]。秸稈還田本身是一種能夠維持田間養(yǎng)分平衡的新耕作方式,近幾年來被廣泛推廣。但是,目前越來越多的研究證據(jù)表明,秸稈還田會顯著地提升土壤中植物病原菌的富集,增加小麥的病害風險[7]。為降低秸稈還田后小麥土傳病害的發(fā)生,全面提高小麥抗病能力,同時又積極響應落實國家相關農(nóng)藥減量政策,本研究從生物防治角度,重點研究了多種微生物菌劑復合施用對小麥抗病能力的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗在杭州市蕭山區(qū)的小麥試驗田中進行,試驗田總面積2.1 hm2,有2 a 秸稈還田歷史,肥力較好,未施用過殺菌劑以及微生物菌劑。供試小麥品種為揚麥20 號。試驗使用的3 種微生物菌劑均為顆粒劑,主要成分分別為枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisB1514)、膠凍樣 芽孢桿 菌(Bacillusmucilaginous) 以及巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。對照藥劑為3%苯醚甲環(huán)唑懸浮種衣劑,購于河南浩迪農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 處理設計

試驗共設置3 個微生物菌劑單獨施用處理、1個微生物菌劑復合施用處理、1 個藥劑對照以及1個未添加任何菌劑及藥劑的空白對照:CK,未添加任何菌劑及藥劑的空白對照組;Dif,3%苯醚甲環(huán)唑懸浮種衣劑處理種子;B1,枯草芽孢桿菌單獨施用;B2,膠凍樣芽孢桿菌單獨施用;B3,巨大芽孢桿菌單獨施用;Bmix,微生物菌劑復合施用。每個處理設置3 個重復,每個重復試驗田面積為225 m2(15 m×15 m)。小麥于2020 年9 月26日播種,2021 年6 月20 日成熟收獲,然后進行室內(nèi)考種。藥劑對照組采用拌種方法處理小麥種子,藥劑與種子質(zhì)量的比例為1∶40,拌種、風干后播種 (現(xiàn)拌現(xiàn)用)。其他處理組與對照組種子均用清水做相同處理。4 組微生物菌劑施用組均拌入底肥中,采用溝施方法進行,有效活菌數(shù)量≥10 億·mL-1。其中,微生物復合施用組為3 種微生物菌劑1∶1∶1 混合。小麥種植期間采用統(tǒng)一的肥水管理方案:施用底肥純氮120 kg·hm-2,P2O5112.5 kg·hm-2、K2O 11.2 kg·hm-2。

1.3 小麥生長指標與產(chǎn)量測定

小麥在成熟收獲后根據(jù)室內(nèi)考種結(jié)果統(tǒng)計各生長指標。對照組與處理組每個重復各取10 株,測定株高、次生根數(shù)、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)以及千粒重。有效穗數(shù)為單株剔除5 粒以下小穗的麥穗數(shù)量;穗粒數(shù)為單株隨機從根部選取20 個分蘗,剔除小穗后記錄的穗粒數(shù);千粒重為1 000 粒穗粒質(zhì)量。根據(jù)這3 項指標計算理論產(chǎn)量:理論產(chǎn)量=(有效穗數(shù)×穗粒數(shù)×千粒重)/106×0.85。

1.4 小麥病害調(diào)查

在小麥成熟期以5 級分類法分別統(tǒng)計小麥根腐病、全蝕病以及紋枯病的病害情況。并分別計算病害指數(shù)和防治效果:病害指數(shù)=∑ (各級病株率×相對級數(shù)值)/ (調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高病級);防治效果=(空白對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/空白對照組病情指數(shù)×100%。

1.5 小麥植物抗病基因表達量測定

稱取0.2 g 小麥成熟期根部樣品,用1 000 μL RNA 保護液 (Trizol Reagent,B610409-0100,生工生物工程上海股份有限公司) 研磨、提取RNA。氯仿200 μL,振蕩器上振蕩15～30 s,冰上放置5 min 后4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min,取最上層200 μL 到新離心管。加入200 μL 異丙醇,上下顛倒溫和混勻,冰上放置10 min 后4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min,去上清。加入1 mL 75%的乙醇洗滌,4 ℃ 8 000 r·min-1離心3 min,去上清,重復兩次。RNA 沉淀晾干后加入20 μL 超純水溶解,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (HiScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper),諾唯贊有限公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用不同引物 (表1) 進行實時熒光定量PCR (qRT-PCR) 試驗。

表1 基因引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌劑對小麥生長的影響

從表2 可以看出,與對照相比,微生物菌劑能夠顯著提高小麥的株高和次生根數(shù),其中,復合微生物菌劑表現(xiàn)最佳。單一施用組中,膠凍樣芽孢桿菌施用后小麥株高和次生根數(shù)的增加量相比于其他兩個菌劑更大。藥劑對照組也能夠顯著提升小麥株高,但是會減少次生根數(shù)量。

表2 微生物菌劑對小麥生長指標的影響

2.2 微生物菌劑對小麥產(chǎn)量的影響

從表3 可以看出,與對照相比,微生物菌劑能夠顯著提高小麥的產(chǎn)量,其中,復合微生物菌劑表現(xiàn)最佳,增產(chǎn)率達到59.4%。單一施用組中,膠凍樣芽孢桿菌的施用對小麥產(chǎn)量的增加相比于其他兩個菌劑更大。藥劑對照組也能夠顯著提升小麥產(chǎn)量,這可能與其殺菌效果有關,能夠抑制小麥病害發(fā)生從而達到產(chǎn)量提升的目標。

表3 微生物菌劑對小麥產(chǎn)量的影響

2.3 微生物菌劑對小麥病情的影響

從表4 可以看出,與對照相比,微生物菌劑能夠顯著降低小麥多種病害,其中,復合微生物菌劑表現(xiàn)最佳,對根腐病、全蝕病和紋枯病的防治效果分別達到68.9%、69.8%和63.4%。單一施用組中,膠凍樣芽孢桿菌的施用對小麥土傳病害防治效果相比于其他2 個菌劑更佳。藥劑對照組相比于微生物菌劑防治效果更佳,復合微生物菌劑能夠與其具有相近的效果。

表4 微生物菌劑對小麥病情的影響

2.4 微生物菌劑對小麥免疫基因表達的影響

為觀察微生物菌劑對小麥免疫力的影響,利用qRT-PCR 技術分析了5 個關鍵免疫基因的表達量(圖1)。所有微生物菌劑施用組都能夠上調(diào)多個小麥免疫基因的表達。單一微生物菌劑處理中,巨大芽孢桿菌促進免疫表達的能力顯著小于枯草芽孢桿菌和膠凍樣芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌對PDF1.2、WRKY29 基因表達的上調(diào)作用高于其他兩種菌劑單獨施用,而膠凍樣芽孢桿菌對PR1、PR2 基因表達的上調(diào)作用在單獨微生物菌劑施用組中最大。相比于單獨施用微生物菌劑,復合微生物菌劑對小麥免疫能力的提升更大。PR1、PR2、PDF1.2、ERF1、WRKY29 基因在復合微生物菌劑處理組中表達量分別為空白對照組的3.4、2.8、1.5、3.9、5.8 倍。與微生物菌劑處理不同,藥劑對照組中部分小麥免疫基因相比于空白對照組顯著下調(diào),包括PR1(下調(diào)40.4%) 和WRKY29 (下調(diào)49.7%)。

圖1 微生物菌劑對小麥免疫基因表達的影響

3 小結(jié)與討論

小麥土傳病害,包括本試驗中重點考慮的根腐病、全蝕病以及紋枯病是造成小麥產(chǎn)量降低的重要原因。近年來,由于秸稈還田新耕作方式的推廣,反而增加了土壤中有害病原體的豐度,造成小麥土傳病害發(fā)病率的不斷提升[7]。本試驗中使用的試驗田具有秸稈還田史,其中,空白對照組小麥根腐病、全蝕病以及紋枯病病情嚴重,進一步證實了秸稈還田對土傳病害的不利影響。

化學藥劑的施用,主要是殺菌劑,如本試驗藥劑對照組中施用的苯醚甲環(huán)唑,會產(chǎn)生一系列不利后果。比如本試驗結(jié)果表明,殺菌劑的施用雖然由于其更直接的殺菌作用促進小麥病害的防治以及產(chǎn)量的提升,但是并不能提升小麥的免疫能力。相反,殺菌劑的施用會抑制小麥根部生長以及部分免疫功能,不利于后代的生長。除此之外,化學藥劑的施用會在環(huán)境中產(chǎn)生藥物殘留,造成環(huán)境污染,也會引起病原體的耐藥性,不利于防治工作的持續(xù)開展[8]。

本試驗結(jié)果表明,微生物菌劑均能夠顯著提升小麥株高和次生根數(shù),這兩個生長指標分別對應了地上部分和地下部分的生長情況。此外,微生物菌劑能夠顯著提升小麥的產(chǎn)量。先前已有諸多研究表明,有益微生物菌劑的施用能夠促進植物的生長與產(chǎn)量。王劍等[9]研究表明,在有機肥施用過程中配施解淀粉芽孢桿菌能夠顯著提升大棚草莓的成活率及產(chǎn)量,并能夠有效改良土壤。侯棟等[10]在辣椒生長過程中,利用功能型混合微生物菌劑配施化肥的方式成功達到了化肥減量增效的目標。李文略等[11]研究結(jié)果也表明,微生物菌肥不僅能夠提高綠蘆筍產(chǎn)量,還能進一步提升其品質(zhì),主要表現(xiàn)在可溶性蛋白和可溶性糖含量的增加。

利用微生物菌劑進行植物病害防治的研究已有較多報道,尤其是芽孢桿菌。王麗麗等[12]從黃瓜枯萎病高發(fā)地區(qū)的健康土壤中分離得到了芽孢桿菌菌株15,室內(nèi)和室外試驗結(jié)果一致地表明該菌株能夠顯著抑制甜瓜根腐病與西瓜枯萎病。常娜等[13]以枯草芽孢桿菌和膠凍樣芽孢桿菌為試驗菌株,驗證了其對不同地區(qū)小麥紋枯病、根腐病以及全蝕病的抑制作用,指出微生物菌劑對病原菌的拮抗作用和對小麥營養(yǎng)吸收的促進作用可能是緩解小麥病情的主要原因。

本試驗結(jié)果也揭示了化學藥劑與微生物菌劑緩解小麥病害的不同機制?；瘜W藥劑主要依賴于對病原體的直接消殺從而達到防治病害的作用。而微生物菌劑則能夠促進小麥免疫應答,從而增強小麥對病原體的抵抗能力。先前研究也有類似報道,在康乃馨根中接種熒光假單胞菌WCS417r,顯著增強了康乃馨對尖孢鐮刀菌的抗性,并增強了病原菌感染部位植物抗菌素的積累[14]。Smigielskl 等[15]研究表明,為蒺藜苜蓿接種叢枝菌根真菌能夠顯著增加其對黃單胞菌的抗性。Pieterse 等[16]在2014 年的開創(chuàng)性研究中發(fā)現(xiàn),有些病原菌與有益菌沒有直接聯(lián)系,表明植物抗病是通過植物調(diào)節(jié)的免疫應答引起的。有益微生物相關分子是常見的免疫激發(fā)子,如幾丁質(zhì)、鞭毛蛋白和脂多糖,它們可以被植物模式識別受體感知從而激發(fā)相應的免疫反應。有些微生物能夠分泌植物激素 (如生長素與細胞分裂素)而被植物激素信號識別。

本試驗結(jié)果還表明,不同微生物菌劑對小麥抗病性的影響程度不同,3 種不同假單胞菌菌劑單獨施用時,膠凍樣芽孢桿菌對小麥病情的防治效果最佳。將不同的微生物菌劑進行復合施用,能夠達到協(xié)同的效果,從而最優(yōu)化小麥病害防治效果。Raupach 等[17]研究中也有類似結(jié)果報道,由短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌組成的有益菌群能夠產(chǎn)生協(xié)同效應,增強了黃瓜對病原體的抗性。