梁靜，李秀璋，陳建博，唐楚煜，王濤，劉欣，李玉玲

(青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，西寧 810016)

冬蟲夏草(Cordycepssinensis)是麥角菌科冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體[1]，是青藏高原特有的生物資源。冬蟲夏草最早記載于《月王藥診》，距今有一千多年的應用歷史[2，3]，具有補肺益腎，抗衰老，增強免疫，促進代謝等作用[4]。它主要分布于青藏高原及周邊地區(qū)海拔3 000 m以上、雪線以下的地區(qū)，在我國的分布包括西藏、青海、甘肅、四川、云南5省區(qū)的高寒草甸草原[5]。作為冬蟲夏草菌重要的寄主昆蟲，蝙蝠蛾的種群動態(tài)和生態(tài)習性不僅是限制冬蟲夏草蘊藏量的基礎，也是冬蟲夏草資源可持續(xù)利用的關鍵[6]。研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草寄主主要分布于我國青藏高原、云貴高原和橫斷山脈等地[7]。蝙蝠蛾的繁殖限制因素眾多，李秀璋等[8]人的研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草寄主蝠蛾卵的孵化與溫度和濕度有關，溫度只有在適宜的范圍內(nèi)，才能促進蝙蝠蛾卵的孵化。

蝙蝠蛾的卵在常溫下易霉變、不耐儲存、孵化時間緩慢且孵化率低。為了探究蝙蝠蛾卵收集后的最佳儲存方式，本試驗以采集自化隆縣巴燕鎮(zhèn)的蝙蝠蛾卵為對象，研究其在不同儲存溫度及儲存時間下的孵化情況，并對其孵化率、孵化速率、孵化期、孵化歷期等卵孵化指標進行測定，以找到最適合的儲存條件，為蝙蝠蛾的人工繁育提供一定的數(shù)據(jù)支持，為人工栽培冬蟲夏草提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究供試蝙蝠蛾卵于2021年7月采集自青海省化隆縣巴燕鎮(zhèn)(E：102°19'，N：36°13'；H：3 200 m)。經(jīng)初步篩選后，將蝙蝠蛾卵置于培養(yǎng)皿中遮光保存于4±1 ℃冰箱。

1.2 試驗方法

將篩選的蝙蝠蛾卵分別置于25 ℃(常溫)、15 ℃、5 ℃、-5 ℃及-15 ℃干燥環(huán)境下儲存，儲存時間設置為2周、4周、6周和8周。試驗時，將儲存的蝙蝠蛾卵取出再次篩選，選出飽滿度均一的蝙蝠蛾卵使用1%的次氯酸鈉進行表面消毒3 min，隨后使用無菌水沖洗3次，將消毒后的蝙蝠蛾卵置于超凈工作臺的無菌濾紙上自然風干30 min。將風干后的蝙蝠蛾卵擺放到培養(yǎng)皿中，置于15 ℃人工氣候箱中進行遮光孵化，每個培養(yǎng)皿放置蝙蝠蛾卵100粒，每個處理4個重復。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過Microsoft Excel 2010進行試驗數(shù)據(jù)整理及繪圖，采用SPSS 19.0軟件對不同儲存溫度和時間下蝙蝠蛾卵的孵化率、孵化速率、孵化期及孵化歷期進行單因素方差分析，并用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較；采用Pearson相關性分析儲存溫度和儲存時間與蝙蝠蛾卵孵化情況的相關性。

2 結果與分析

2.1 儲存溫度和儲存時間對蝙蝠蛾卵孵化率及孵化速率的影響

如圖1所示，隨著儲存時間的增加，蝙蝠蛾卵的孵化率呈逐漸下降的趨勢，在儲存溫度和時間分別為15 ℃、2周處理下，蝙蝠蛾卵孵化率最高，達到50.67%，顯著高于其他2個儲存溫度處理下蝙蝠蛾卵的孵化率(P<0.05)。儲存溫度和時間分別為-5 ℃、8周處理下，蝙蝠蛾卵的孵化率僅為6.82%，顯著低于其他處理(P<0.05)。儲存溫度和時間分別為15 ℃、6周處理下，蝙蝠蛾的孵化速率最大，達到0.038。儲存時間和溫度分別為4周、5 ℃和-5 ℃處理下，蝙蝠蛾的孵化速率最小，僅為0.029。相對于其他處理，在儲存溫度為15 ℃處理下蝙蝠蛾卵的孵化率相對較高，在儲存溫度為-5 ℃處理下蝙蝠蛾卵的孵化率相對較低。

圖1 儲存溫度和時間對蝙蝠蛾卵孵化的影響注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，圖柱上不同小寫字母表示不同儲存條件之間蝙蝠蛾卵孵化率在0.05水平下的差異顯著性

2.2 儲存溫度和儲存時間對蝙蝠蛾卵孵化時間的影響

如圖2所示，在儲存時間和溫度分別為4周、5 ℃和-5 ℃處理下蝙蝠蛾卵的孵化期最長為34天。儲存溫度和時間分別為15 ℃、4周處理下蝙蝠蛾卵的孵化期最短為26 d。儲存溫度為15 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化期隨著儲存時間的增加呈先減少后增加的變化趨勢；儲存時間為5 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化期隨著儲存時間的增加呈先增加后減少的變化趨勢；儲存時間為-5 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化期隨著儲存時間的增加呈先增加后減少的變化趨勢。儲存溫度分別為5 ℃和15 ℃，儲存時間分別為4周和8周處理下,蝙蝠蛾卵孵化歷期最長為13 d；儲存時間和溫度分別為8周、-5 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化歷期最短僅為3 d。儲存溫度分別為15 ℃和-5 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化歷期均隨著儲存時間的增加呈先增加后減少的變化趨勢；在儲存時間為5 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化歷期隨著儲存時間的增加呈先增加后減少再增加的變化趨勢。

圖2 儲存溫度和儲存時間對蝙蝠蛾卵孵化時間的影響注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，圖柱上不同小寫字母表示不同儲存條件之間蝙蝠蛾卵孵化率在0.05水平下的差異顯著性

2.3 儲存溫度和儲存時間與蝙蝠蛾卵孵化情況的相關性分析

為了分析蝙蝠蛾卵的孵化率、孵化期等與儲存溫度及儲存時間的相關性，采用Pearson相關分析(表1)，儲存溫度和儲存時間與蝙蝠蛾卵的孵化率具有極顯著的負相關關系(P<0.01)，與蝙蝠蛾卵的孵化速率和孵化期具有正相關關系，與蝙蝠蛾卵的孵化期具有負相關關系，但相關性均不顯著(P>0.05)。

表1 儲存溫度和時間與蝙蝠蛾卵孵化情況的相關性系數(shù)

3 討論

蝙蝠蛾卵的儲存過程中，溫度起到了至關重要的作用，也是其發(fā)育的直接影響因素[9，10]。儲存過程中，溫度過高或者過低都會直接殺死卵，本試驗中蝙蝠蛾卵在儲存溫度為25 ℃和-15 ℃條件下均能孵化出幼蟲。通過對不同溫度處理下冬蟲夏草蝙蝠蛾的孵化研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草蝙蝠蛾卵的最適孵化溫度為14～16 ℃，孵化率達到85.67%[11，12]。通過對冬蟲夏草寄主昆蟲蝙蝠蛾卵孵化過程中不同儲存溫度處理發(fā)現(xiàn)，在2 ℃條件下保存7 d后的蝙蝠蛾卵比4 ℃條件下保存7 d的卵孵化率有所降低[13]。王宏生等[14]研究了蝙蝠蛾卵在-2 ℃、0 ℃、5 ℃條件下儲存孵化的情況，認為卵保存在-2 ℃條件下已不能孵化出幼蟲，5 ℃條件下保存的卵孵化率比0 ℃條件下保存的卵孵化率高，且蝙蝠蛾的卵在0 ℃和5 ℃條件下儲存15 d比儲存30 d孵化期縮短了。本試驗將蝙蝠蛾的卵保存于不同溫度下，結果發(fā)現(xiàn)，當蝙蝠蛾卵的儲存溫度為15 ℃、時間為2周時，孵化率顯著高于其他處理的孵化率，達到50.67%；蝙蝠蛾卵的儲存溫度越低，其孵化期越長，當儲存溫度為-5 ℃時蝙蝠蛾卵的孵化期顯著高于其他處理的孵化期，達到34 d；當蝙蝠蛾卵的儲存溫度為15 ℃和5 ℃時，孵化歷期最長，達到13 d，而儲存溫度為-5℃時，其孵化歷期僅有3 d。這一結果顯示，適宜的溫度有利于提高蝙蝠蛾卵的孵化率，縮短其孵化期，這與前人的研究結果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)蝙蝠蛾卵儲存在-5 ℃時，雖然孵化率低，但能孵化出幼蟲，這與前人的研究結果不一致。這可能與供試冬蟲夏草寄主昆蟲的種類差異有關。此外，蝙蝠蛾能在0 ℃以下生存可能因為其卵中含有糖、脂肪酸、蛋白質等物質，這些物質同原生質形成一定的有機結構可以抵抗低溫[15]，其內(nèi)在機制尚需要深入研究。

儲存時間也是影響冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾卵孵化的重要因素之一。通過對冬蟲夏草蝙蝠蛾的卵進行不同時間的儲存發(fā)現(xiàn)，儲存15 d卵的孵化率高于儲藏30 d卵的孵化率，且保存的時間越長卵的孵化率越低[14]。本試驗將蝙蝠蛾的卵分別儲存了2周、4周、6周和8周，結果發(fā)現(xiàn)隨著儲存時間的增加不同溫度下蝙蝠蛾卵的孵化率均顯著降低，這與前人的研究結果一致。蝙蝠蛾的卵隨著儲存時間的增加，孵化率有所下降可能與儲存時間久后卵消耗自身的營養(yǎng)物質有關。

昆蟲卵的孵化是多種生態(tài)因素共同作用的結果[16]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，儲存溫度和儲存時間與冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾卵的孵化率呈極顯著負相關(P<0.01)。當儲存溫度為15 ℃、時間為2周條件下，蝙蝠蛾卵的孵化率最高，達到50.67%；當儲存溫度為-5 ℃、時間8周條件下，其孵化率最低，僅為6.82%；當儲存溫度為5 ℃、時間4周條件下，其孵化期和孵化歷期最長，分別為34 d和13 d；而當儲存溫度為15 ℃、時間為4周條件下，其孵化期最短，為26 d，當儲存溫度為-5 ℃、時間8周條件下，其孵化歷期最短僅有3 d。

本文僅對采集自青?；】h境內(nèi)的冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾卵在不同儲存溫度和儲存時間條件下的孵化情況進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)儲存溫度為15 ℃、儲存時間為2周處理下蝙蝠蛾卵的孵化率最高；儲存溫度為15 ℃、儲存時間為4周條件下，其孵化期最短；儲存溫度為5 ℃、儲存時間4周條件下，其孵化歷期最長，然而蝙蝠蛾卵的孵化對儲存溫度和儲存時間的響應機制尚不明確，有待進一步研究。盡管研究發(fā)現(xiàn)儲存時間和儲存溫度對蝙蝠蛾卵的孵化有影響，但除此之外蝙蝠蛾卵儲存的位置、環(huán)境中的光等因素可能也是影響蝙蝠蛾卵孵化的關鍵因子。綜合考慮冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾卵對儲存條件的響應，篩選出冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾卵的最適儲存條件，為冬蟲夏草的人工培育提供技術支撐。