馬世科，孫蕓，周玉青，孫武，馬玉紅

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；2.海北藏族自治州農(nóng)牧科學(xué)研究所，海北 812200；3.海北藏族自治州高原生態(tài)畜牧業(yè)科技示范園管委會(huì)，海北 812200)

藏羊是青藏高原最具代表性綿羊品種。在自然放牧條件下，繁殖性能較低，一般為一年一胎，一胎一羔，雙羔極少。因此，學(xué)術(shù)界認(rèn)為藏羊?yàn)閱翁ゾd羊品種。對(duì)海北藏族自治州高原型藏羊多胎情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在111戶飼養(yǎng)戶中52.52%群體存在產(chǎn)多胎情況，數(shù)量占調(diào)查母羊總數(shù)的0.90%[1]。FecB基因是科學(xué)家最早發(fā)現(xiàn)與綿羊繁殖力有關(guān)的基因。近年來(lái)，人們一直試圖通過(guò)分子遺傳標(biāo)記技術(shù)來(lái)培育具有高繁殖力的綿羊后代。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)的策勒黑羊、多浪羊、小尾寒羊、杜寒雜交肉羊以及洼地綿羊等羊群中都存在FecB 基因，且FecB基因可能是這些綿羊具有多胎性狀的主效基因[2]。研究團(tuán)隊(duì)在完成高原型藏羊多胎性能調(diào)查基礎(chǔ)上，對(duì)特定群體開(kāi)展基因檢測(cè)，首次發(fā)現(xiàn)藏羊群體中存在攜帶有FecB基因個(gè)體，因此，組建多胎藏羊群開(kāi)展跟蹤研究和定向選育?，F(xiàn)將前期研究結(jié)果匯總?cè)缦拢?/p>

1 材料與方法

1.1 血液樣品采集

血樣采用 EDTA-K2抗凝采血管靜脈采血2 mL，于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

血液基因組DNA純化試劑盒、基因分型試劑盒Light Cycler 480 High Resolution Melting Master購(gòu)自羅氏公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為羅氏公司Light Cycler 480 II。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

為檢測(cè)該突變，采用primer 6.0 軟件設(shè)計(jì)BMPR-1B基因外顯子6部分序列克隆及HRM檢測(cè)引物(BMPR-1B基因登錄號(hào)：NC_040257)，引物信息見(jiàn)表1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 引物

1.4 BMPR-1B片段擴(kuò)增與FecB基因鑒定

以基因組DNA為模板，擴(kuò)增不同檢測(cè)位點(diǎn)的PCR片段，反應(yīng)體系為25 μl。PCR反應(yīng)體系：DNA Template 2 μl， Primer F(10 μM) 1 μl，Primer R(10 μM) 1 μl，Premix Taq 12.5 μl，ddH2O 補(bǔ)至25 μl。PCR反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性30 sec 60 ℃復(fù)性30 sec，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將檢測(cè)條帶單一的樣品送往北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.5 HRM檢測(cè)體系

以多胎藏羊選育群中的母代與子代羊群為檢測(cè)對(duì)象，以構(gòu)建好的FecB基因HRM檢測(cè)體系為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)羊群所有個(gè)體進(jìn)行FecB基因分型。HRM反應(yīng)體系為10 μL：High Resolution Melting Master 5 μL，MgCl2(25 mmol/μL)1.2 μL，F(xiàn)ecB_H正反引物各0.1 μL，模板DNA(20 ng/μL)0.5 μL，ddH2O為3.1 μL。反應(yīng)程序如下：首先95 ℃預(yù)變性10 min；隨后擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)溫度依次為94 ℃保持15 s，退火溫度62 ℃保持30 s；擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行HRM分型，分型條件為：95 ℃保持1 min，40 ℃保持1 min，65 ℃保持1 s；從65 ℃開(kāi)始按25 次/℃的頻率收集熒光信號(hào)；最后降溫至40 ℃保持40 s。檢測(cè)結(jié)果用自帶Gene Scanning軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 生長(zhǎng)性能測(cè)定

選擇海北州高原生態(tài)畜牧業(yè)科技示范園多胎藏羊群所產(chǎn)羔羊?yàn)闇y(cè)定對(duì)象，多胎和單胎羔羊分別在初生和6月齡測(cè)定體重。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 多胎繁殖母羊FecB突變基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

從多胎母羊分布群中，采集多胎母羊血樣41份，單羔母羊血樣60份。在多胎組中檢出GA型雜合子個(gè)體13 只，占31.71%；AA型28只，占68.29%；對(duì)照組檢出GA型1只，占1.67%；AA型59只，占98.33%。試驗(yàn)組GA型雜合子比例顯著高于對(duì)照組，基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 多胎繁殖母羊FecB突變基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

2.2 FecB基因在大群體中的篩查

在海北州四縣高原型藏羊群中隨機(jī)抽取3 880只羊的血樣進(jìn)行基因檢測(cè)，結(jié)果顯示僅有0.49%個(gè)體存在FecB突變個(gè)體，其中：祁連縣群體中FecB突變個(gè)體比例最高為2.04%，剛察縣群體中沒(méi)有檢測(cè)到FecB突變個(gè)體。檢測(cè)到個(gè)體均為雜合子(GA)，其余為野生型(AA)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 海北四縣FecB基因篩查情況統(tǒng)計(jì)表

2.3 多胎藏羊定向選育結(jié)果

在只有雜合子母羊、缺乏純合子和雜合子種公羊情況下，從2014年開(kāi)始組建多胎母羊群，與普通種公羊選配，從多胎后代中檢測(cè)多胎基因，選留雜合子(GA)種公羊，然后利用雜合子(GA)種公羊與雜合子(GA)母羊選配，培育純合子(GG)種公羊。經(jīng)過(guò)持續(xù)定向培育，現(xiàn)已培育出純合子和雜合子種羊。2021年，對(duì)海北州高原生態(tài)畜牧業(yè)科技示范園、祁連縣種羊場(chǎng)2 個(gè)先期建立多胎群所產(chǎn)538只羔羊進(jìn)行基因鑒定，含F(xiàn)ecB基因個(gè)體比例已達(dá)53.16%，其中純合子比例達(dá)到10.59%，雜合子比例達(dá)到42.57%，當(dāng)年羔羊基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 多胎群羔羊基因檢測(cè)結(jié)果

2.4 不同F(xiàn)ecB基因型母羊多胎率

目前培育純合子母本數(shù)量少，尚未進(jìn)入繁殖年齡，本次統(tǒng)計(jì)只涉及多胎群雜合子和野生型。連續(xù)三次產(chǎn)羔記錄顯示，AG型母本其多胎概率平均為45.79%；AA野生型，其多胎的概率為25.00%。對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)得出，AG型母本產(chǎn)多胎率顯著(P<0.05)高于AA型母本。多胎群不同基因型藏羊連續(xù)三胎多胎率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同F(xiàn)ecB基因型母本連續(xù)三產(chǎn)多胎率統(tǒng)計(jì)表

2.5 多胎羔羊生長(zhǎng)發(fā)育

對(duì)多胎和單胎羔羊體重進(jìn)行跟蹤測(cè)定，多胎羔羊的初生重平均3.14±0.60 kg，單胎為4.24±0.62 kg，進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，二者差異極顯著(P<0.01)；多胎羔羊6月齡體重28.11±2.48 kg，單胎28.35±3.78 kg，二者差異不顯著(P>0.05)。羔羊初生和六月齡體重測(cè)定見(jiàn)表6。

表6 羔羊體重統(tǒng)計(jì)表

3 結(jié)果與討論

3.1綿羊多胎性能是目前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，前期團(tuán)隊(duì)在完成調(diào)查和基因檢測(cè)基礎(chǔ)上，開(kāi)始組建多胎群進(jìn)行跟蹤研究，研究并證實(shí)藏羊群體中存在與多胎性能相關(guān)的FecB基因，且 FecB基因?qū)Σ匮蚨嗵バ阅艽嬖陲@著影響，但高原型藏羊多胎性能分子遺傳機(jī)理尚不明晰，F(xiàn)ecB基因多胎表型分類界定仍需要細(xì)化，藏羊多胎性能可能還存在其它多基因互作，相關(guān)機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。

3.2隨著多胎性狀越來(lái)越被人們熟知，具有多胎高產(chǎn)性狀的綿、山羊在外界環(huán)境影響的基礎(chǔ)上，被人們有目的的選育，逐步產(chǎn)生了具有穩(wěn)定性狀的品種，但羊的繁殖性狀作為數(shù)量遺傳性狀，其遺傳力較低，僅有0.1 左右，采用常規(guī)育種手段十分困難[3]。團(tuán)隊(duì)前期在僅有雜合子母羊情況下，通過(guò)單基因分子選擇，開(kāi)展多胎定向選育，培育純合子雖未進(jìn)入產(chǎn)羔階段，但雜合子雙羔率最高達(dá)58.82%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)藏羊多胎性能不僅與內(nèi)在基因相關(guān)，而且與飼養(yǎng)管理等外部環(huán)境重要相關(guān)。團(tuán)隊(duì)在完成育種前端主要試驗(yàn)研究后，在開(kāi)展定向培育的同時(shí)，將開(kāi)展多胎藏羊飼養(yǎng)管理方面配套技術(shù)研究。多胎型藏羊培育對(duì)提升我省在藏羊種業(yè)上的創(chuàng)新水平、培育符合現(xiàn)代羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢(shì)良種具有重大意義。

3.3自然放牧條件下，多胎母羊攝入營(yíng)養(yǎng)難以滿足多胎生產(chǎn)需要，常出現(xiàn)羔羊初生重低、死亡率高和生長(zhǎng)發(fā)育緩慢等現(xiàn)象。本試驗(yàn)研究表明，在同等放牧補(bǔ)飼管理?xiàng)l件下，多胎羔羊初生重雖低于單胎羔羊的初生重，但后期生長(zhǎng)發(fā)育迅速；6月齡時(shí)，體重已與單胎羔羊體重?zé)o異，更不會(huì)對(duì)后期生產(chǎn)性能造成影響，因此，飼養(yǎng)多胎藏羊需加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和相關(guān)配套方面投入。