易巧蘭 陳小東 梁榮坤 鐘羽彤

1 福建醫(yī)科大學附屬龍巖第一醫(yī)院檢驗科，福建省龍巖市 364000；2 福建省龍巖市疾病預防控制中心檢驗科

染色體畸形是威脅人類生育質量的先天性遺傳性疾病，目前醫(yī)學界尚無有效的預防手段。因此，產(chǎn)前篩查及診斷染色體疾病，減少出生缺陷越來越受到重視。目前，羊水染色體核型分析是產(chǎn)前診斷染色體畸變的主要方法，可檢測出胎兒染色體數(shù)目與結構的異常，但該技術分辨率較低，對<5～10bp的染色體異常較難檢查，存在漏檢染色體微缺失或微重復狀況，且羊水染色體核型分析一般2周時間才可得到結果，不適宜在危重癥產(chǎn)婦中開展[1-2]?；蛐酒墙⒃诨蛱结樅碗s交測序技術上的一種高效快速的核酸序列分析技術，可檢出染色體的微缺失與微重復，彌補羊水染色體核型分析的不足[3-4]。目前，臨床比較兩種技術篩查孕婦產(chǎn)前染色體畸變的對比研究較多，而聯(lián)合篩查的研究相對較少。鑒于此，本研究旨在分析羊水染色體核型分析聯(lián)合基因芯片在高危孕婦產(chǎn)前染色體畸變篩查中的價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會審核批準，選取2021年2—10月于福建醫(yī)科大學附屬龍巖第一醫(yī)院門診進行產(chǎn)前染色體畸變篩查的125例疑似高危產(chǎn)婦為研究對象，產(chǎn)婦及家屬均簽署知情同意書。納入標準：(1)單胎妊娠、活胎；(2)于醫(yī)院建立產(chǎn)檢卡，且定期進行產(chǎn)檢；(3)于醫(yī)院接受羊水染色體核型、基因芯片檢查。排除標準：(1)具有先兆流產(chǎn)傾向；(2)有出血傾向(血小板≤70×109/L，凝血功能檢查異常)；(3)伴有盆腔或宮腔感染；(4)非自然妊娠；(5)體溫>37.2℃。125例孕婦年齡24～46歲，中位年齡[35.00(31.00，38.00)]歲；篩查時孕周16～28周，中位孕周[22.00(21.00，22.00)]周；孕次1～3次，中位孕次[2.00(2.00，3.00)]次；B超檢查異常21例，不良孕產(chǎn)史8例，血清篩查高危20例，頸部透明層(Nuchal translucency，NT)增厚14例，高齡孕婦62例。

1.2 方法

1.2.1 標本取材：孕婦及家屬均簽署羊水穿刺知情同意書，于孕16～28周在超聲(GE Ultrasound Korea, Ltd，國械注進20152232990，型號：LOGIQ P9)引導下抽取羊水30ml左右，具體方法：孕婦排空膀胱，取仰臥位，通過B超觀察胎盤位置、羊水量，確定穿刺點(需避開胎盤，尋找最大又緊貼腹壁的羊水池)；腹部消毒鋪巾，在無菌操作下，采用一次性腰穿針抽取羊水30ml，放入3個無菌管中。

1.2.2 羊水染色體核型分析：將2支無菌管，以1 500r/min速率離心10min，吸去上層清液，取下層沉淀，分別接種于5ml的羊水培養(yǎng)基中并混勻；分別放置在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，第7天后通過奧林巴斯YMPUS CKX4倒置顯微鏡觀察羊水細胞生長情況，若出現(xiàn)多個細胞集落生長進行換液再次培養(yǎng)；第9天時再次觀察生長情況，若細胞背景層出現(xiàn)折光性較強的圓形細胞>8個則表示生長狀況理想，加入100μg/ml秋水仙素2滴，4h后行細胞收獲、制片，并行常規(guī)染色體G顯帶，掃片后分析5個，計數(shù)20，參照《染色體核型檢驗診斷報告模式專家共識》[5]對染色體核型進行分析。

1.2.3 基因芯片：將基因芯片送至北京貝康醫(yī)學檢驗所進行檢查，具體方法：將另1個10ml的羊水標本以1 700r/min速率離心10min，棄上清，取沉淀物，采用核酸提取試劑盒提取羊水基因組DNA，保存于-20℃環(huán)境中，采用核酸蛋白分析儀(貝克曼庫爾特，IMMAGE 800型)測定DNA的濃度與純度，要求基因組DNA濃度>25μg/μl。(1)消化：將5μl全基因組DNA采用NspⅠ酶隨機消化為短片段；(2)連接：將消化后產(chǎn)物末端補齊后連接上共同引物；(3)PCR擴增：將上述處理后樣本擴增至150～2 000bp片段；(4)PCR產(chǎn)物純化：將擴增的產(chǎn)物采用磁珠法進行純化；(5)片段化：通過片段化酶片段化為25～125bp片段：(6)標記：連接上生物素標記；(7)雜交：將標記后產(chǎn)物與雜交液混合均勻并變性，加載于750 K芯片置于雜交箱子中，在50℃、60r/min條件下雜交16～18h；(8)沖洗、染色：將雜交后的芯片洗滌并染色；(9)掃描：將芯片放置于微陣列芯片掃描儀(博奧生物有限公司，LuxScan10K-B型)中獲取相關數(shù)據(jù)；(10)分析：參照《染色體基因組芯片在兒科遺傳病的臨床應用專家共識》[6]對相關軟件處理結果進行判讀。

1.2.4 病理或隨訪：染色體核型分析、基因芯片單獨及聯(lián)合檢查提示產(chǎn)前染色體畸變的孕婦在多學科聯(lián)合會診中心進行全面產(chǎn)前咨詢，并根據(jù)孕婦意愿選擇終止妊娠或繼續(xù)妊娠至正常分娩；選擇終止妊娠者，其引產(chǎn)胎兒由新生兒醫(yī)生進行臨床檢查；未引產(chǎn)者根據(jù)胎兒出生后的癥狀、體征及染色體檢查確診。

1.3 觀察指標 記錄病理及隨訪結果；記錄染色體核型分析、基因芯片單獨及聯(lián)合檢查的異常情況。其中單項檢查中任何一項異常則聯(lián)合檢查異常。

2 結果

2.1 病理及隨訪結果 經(jīng)病理或隨訪確診，125例疑似高危產(chǎn)婦中胎兒染色體畸變?yōu)?2例。其中B超檢查異常產(chǎn)婦中3例，不良孕產(chǎn)史產(chǎn)婦中2例，血清篩查高危產(chǎn)婦中5例，NT增厚產(chǎn)婦中10例，高齡孕婦中2例。

2.2 羊水染色體核型分析、基因芯片單獨及聯(lián)合篩查疑似高危孕婦產(chǎn)前染色體畸變情況 125例產(chǎn)婦羊水培養(yǎng)均成功，基因芯片均成功提取基因DNA。羊水染色體核型分析篩查中15例異常，檢出率為68.18%(15/22)；基因芯片中15例異常，檢出率為68.18%(15/22)；聯(lián)合篩查檢出22例，檢出率為100.00%(22/22)，羊水染色體核型分析聯(lián)合基因芯片聯(lián)合篩查產(chǎn)前染色體畸變檢出率高于單獨技術篩查，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 羊水染色體核型分析、基因芯片篩查高危孕婦產(chǎn)前染色體畸變類型 羊水染色體核型分析、基因芯片篩查對染色體非整倍數(shù)、嵌合染色體檢出率均為100.00%；羊水染色體核型分析對染色易位、倒拉檢出率為100.00%，對微小片段缺失或重復檢出率為0.00%；基因芯片對染色易位、倒拉的檢查率為0.00%，對微小片段缺失或重復的檢出率為100.00%。見表1。

表1 羊水染色體核型分析、基因芯片篩查高危孕婦產(chǎn)前染色體畸變類型[n(%)]

3 討論

染色體是基因的載體，染色體異?？蓪е禄蛟黾踊蛉笔?，從而導致胎兒發(fā)育異常、多器官或多組織畸形、多發(fā)自然流產(chǎn)或死胎等，是造成新生兒出生缺陷的重要原因之一。目前，羊水染色體核型分析是細胞遺傳學中較為成熟的技術，通過提取高危孕婦羊膜腔內(nèi)羊水，進行一系列脫落細胞培養(yǎng)等，可分析出染色體數(shù)目異常和較大片段的染色體缺失、重復、易位、插入、倒拉等，是降低出生缺陷的有效手段，且對孕婦再次生育時的再發(fā)風險評估與遺傳咨詢均具有指導性意義[7]。但臨床多項研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)G顯帶核型分析無法檢測微小片段缺失或重復，且樣本污染或培養(yǎng)失敗，無法得出分析結果[8-9]。因此，快速產(chǎn)前診斷技術的開發(fā)與應用研究得到了廣泛的關注。

基因芯片即DNA芯片，其實質是Southern技術的反向應用，利用原位合成或已合成好的一系列寡核苷酸固定于介質上，制備呈高密度的寡核苷酸陣列，促使基因樣本與探針在載體表面上雜交，可用于基因多態(tài)性、DNA測序、基因突變分析等[10]。該技術可檢測出>1kb的染色體不平衡畸變，且無須制備中期染色體，只需1μg的DNA量就可檢測出全基因組DNA拷貝數(shù)的變化，且全程由儀器操作，可減少人為主觀因素的干擾，對提高產(chǎn)前染色體畸變篩查的準確率具有一定的作用[11]。但由于染色體的平衡性變異，不涉及遺傳物質的丟失或增加，基因芯片無法檢出染色易位、倒拉等情況[12]。因而，從理論上來說，羊水染色體核型分析聯(lián)合基因芯片篩查產(chǎn)前染色體畸變可發(fā)揮各自的優(yōu)勢，可進一步發(fā)現(xiàn)染色體畸變情況。本研究結果顯示，在125例疑似高危產(chǎn)婦中，羊水染色體核型分析聯(lián)合基因芯片篩查出的產(chǎn)前染色體畸變檢出率高于單項技術篩查，證實了上述推測，且分析兩種方法檢查的染色體畸變類型，發(fā)現(xiàn)羊水染色體核型分析可精確檢測出易位、倒拉等大片段的染色體結構異常情況，而基因芯片可檢測出微小染色體的缺失、重復情況，因而，二種檢查方法可優(yōu)勢互補，可提高檢查的準確率。

綜上所述，高危孕婦產(chǎn)前染色體畸變篩查中運用羊水染色體核型分析聯(lián)合基因芯片檢查可減少單獨檢測的漏檢率，提高檢出率，對降低胎兒出生缺陷具有重要的指導作用。