張 蕊

蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，甘肅省蘭州市 730000

MicroRNA(miRNA)是由17～22個(gè)核苷酸組成且具有高度保守性的小單鏈RNA[1]。miRNAs不翻譯成蛋白質(zhì)，主要通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因結(jié)合來(lái)抑制其進(jìn)一步的翻譯表達(dá)，或通過(guò)RNA誘導(dǎo)直接降解靶標(biāo)mRNA分子來(lái)調(diào)控靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄等方式起調(diào)控作用[2-3]。研究表明miRNAs在腫瘤、免疫性疾病、代謝性疾病、內(nèi)分泌疾病等發(fā)病機(jī)制中起重要作用[4]。研究顯示，hsa-miR-20a-3p在皮膚癌、胃癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程起重要作用[5-6]。目前對(duì)miR-20a-3p的致病分子機(jī)制仍有待研究，因此，本研究擬通過(guò)對(duì)hsa-miR-20a-3p進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為其靶點(diǎn)及相關(guān)疾病的致病機(jī)理的后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 hsa-miR-20a-3p保守性分析 在miRbase(http://www.mirbase.org)和UCSC(http://genome.ucsc.ed)等在線數(shù)據(jù)庫(kù)查找miR-20a-3p的染色體定位信息及堿基序列，并采用MEGA 7.0軟件對(duì)比分析各物種miR-20a-3p序列間的保守性。

1.2 hsa-miR-20a-3p靶基因預(yù)測(cè) 利用Targetscan(http://www.Targetscan.org)、TarBase(http://microrna.gr/tarbase)、miRDB(http://www.mirdb.org)、miRTarBase(http://www.mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw)四大數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)hsa-miR-20a-3p的靶基因。用Venny圖法先對(duì)miRDB、Targetscan和TarBase 3者預(yù)測(cè)的靶基因求交集，此外合并miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的hsa-miR-20a-3p靶基因形成靶基因集合用于后續(xù)分析[7]。

1.3 hsa-miR-20a-3p靶基因的GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路分析 應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 6.8(http://david.abcc.ncifcrf.gov)對(duì)hsa-miR-20a-3p的靶基因集合進(jìn)行GO功能(Gene ontology)注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。GO功能注釋包括細(xì)胞組分、分子功能、生物功能3大應(yīng)用部分[8]。用Fisher確切概率法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各物種成熟miR-20a-3p序列的保守性分析 結(jié)果顯示hsa-miR-20a-3p基因序列號(hào)為MIMAT0004493，聚集于13q31.3染色體區(qū)域中的一個(gè)簇內(nèi)，其基因位點(diǎn)在染色體的具體位置為chr13:91351108-91351129。利用數(shù)據(jù)庫(kù)miRbase下載Homo sapiens(人)、Capra hircus(山羊)、pteropus alecto(狐蝠)、Cavia porcellus(豚鼠)等10個(gè)物種的miR-20a-3p的成熟序列。對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)miR-20a-3p成熟堿基序列中“acugcauuaugagcacuuaaag”22個(gè)堿基在各物種間高度保守，結(jié)果見表1。

表1 不同物種miR-20a-3p成熟序列

2.2 hsa-miR-20a-3p的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果 利用Targetscan、miRDB和TarBase 3個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)得到靶基因個(gè)數(shù)分別為4 387、716和699，通過(guò)取交集得到66個(gè)靶基因，結(jié)果見圖1a。另外，在miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)中查找經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的靶基因共92個(gè)，其中有ADSS和YWHAQ兩個(gè)靶基因與上述交集重合，因此得到156個(gè)無(wú)重復(fù)的靶基因集合作為后續(xù)生物分析，結(jié)果見圖1b。

圖1 hsa-miR-20a-3p的預(yù)測(cè)靶基因個(gè)數(shù)

2.3 hsa-miR-20a-3p預(yù)測(cè)靶基因的GO功能注釋描述 GO功能注釋發(fā)現(xiàn)hsa-miR-20a-3p靶基因集合富集在核漿、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等9個(gè)細(xì)胞組分(P<0.05)；富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合等11個(gè)分子功能(P<0.05)；富集在前腦形態(tài)發(fā)生、學(xué)習(xí)或記憶、器官誘導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控等15個(gè)生物學(xué)過(guò)程(P<0.05)，結(jié)果分別見表2～4。

表2 hsa-miR-20a-3p預(yù)測(cè)靶基因的細(xì)胞組分

表3 hsa-miR-20a-3p預(yù)測(cè)靶基因分子功能

表4 hsa-miR-20a-3p預(yù)測(cè)靶基因生物學(xué)功能

2.4 hsa-miR-20-3p預(yù)測(cè)靶基因的KEGG信號(hào)通路富集分析 KEGG富集分析結(jié)果顯示hsa-miR-20a-3p的靶基因顯著富集在病毒致癌、乙型肝炎、HTLV-Ⅰ(人類T細(xì)胞白血病病毒)感染等信號(hào)通路中(P<0.05)，結(jié)果見表5。

表5 hsa-miR-20-3p靶基因KEGG信號(hào)通路富集分析

3 討論

近年來(lái)，hsa-miR-20a-3p在癌癥等多種疾病中的差異表達(dá)已得到廣泛研究，miRNA已成為一種多效的致癌或抑癌調(diào)節(jié)因子，作用尚未完全被了解[5-6]。目前也缺乏其潛在靶點(diǎn)和相關(guān)功能通路的全面分析，生物信息學(xué)能快速預(yù)測(cè)miRNA靶基因集合和相關(guān)的生物功能，具有一定的可靠性。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)miR-20a-3p已知的成熟序列在人、獼猴、野豬、錦龜和豚鼠等多個(gè)物種間高度保守，表明其可能編碼了與生命活動(dòng)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，且可利用在豚鼠等其物種間的保守性序列，將常見的模式生物作為研究miR-20a-3p生物學(xué)作用的實(shí)驗(yàn)支持工具；采用目前常用的miRNA靶基因預(yù)測(cè)方法為使用多種靶基因預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，為了提高預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，利用數(shù)據(jù)庫(kù)靶基因交并集來(lái)獲取所需研究的靶基因集合，本研究所得無(wú)重復(fù)hsa-miR-20a-3p靶基因共156個(gè)，GO功能分析結(jié)果顯示靶基因主要富集在核漿、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等9個(gè)細(xì)胞組分，富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合和損傷DNA結(jié)合等11個(gè)分子功能，富集在前腦形態(tài)發(fā)生、學(xué)習(xí)或記憶、器官誘導(dǎo)、代謝過(guò)程調(diào)節(jié)和基因表達(dá)調(diào)控等15個(gè)生物學(xué)過(guò)程，KEGG分析結(jié)果顯示hsa-miR-20a-3p的靶基因顯著富集在病毒致癌信號(hào)通路、乙型肝炎信號(hào)通路和HTLV-Ⅰ感染信號(hào)通路中。

已有研究表明miR-20-3p與癌癥具有密切關(guān)系，如miR-20-3p的過(guò)表達(dá)可調(diào)控靶基因CSNK2A1來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖誘發(fā)結(jié)腸癌[9]，通過(guò)調(diào)控CADM1來(lái)抑制部分抑癌基因的正常表達(dá)來(lái)誘發(fā)肺腺癌[10]等來(lái)發(fā)揮致癌作用，已成為多種癌癥早期篩查及預(yù)后的標(biāo)志物，并成為癌癥的治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者的促血管生成和抗血管生成hsa-miR-20a-3p豐度存在差異，這些患者血管生成受損導(dǎo)致血管并發(fā)癥發(fā)生的潛在機(jī)制與其靶向調(diào)控血管生成和脈管系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)，且與其他miRNA產(chǎn)生協(xié)同調(diào)節(jié)T2DM病患者中與血管生成有關(guān)的MTDH和PDCD10的兩個(gè)基因，參與促血管生成和抗血管生成等不同的生理過(guò)程[11]。肝臟中miR-20a-3p表達(dá)顯著下調(diào)，可能因?yàn)槠渑cc-Myc基因的激活有關(guān)，使其參與了急性缺氧應(yīng)激調(diào)節(jié)[12]。研究表明miR-20a-3p在胃癌患者機(jī)體通常下調(diào)，可與β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路之間相互作用，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的異常激活在許多惡性腫瘤尤其是胃癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[13]。miR-20a-3p、miR-21等在研究中被報(bào)道與健康長(zhǎng)壽相關(guān)，細(xì)胞衰老是體內(nèi)固有的腫瘤抑制機(jī)制，同時(shí)也是與年齡相關(guān)的組織退化和功能障礙的主要驅(qū)動(dòng)力，相關(guān)的miRNA可能會(huì)成為衰老的標(biāo)志物[14]。還有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)核分枝桿菌感染期間，miR-20a-3p呈劑量和時(shí)間依賴性增加，其上調(diào)促進(jìn)了細(xì)菌的胞內(nèi)生長(zhǎng)，并抑制了結(jié)核分枝桿菌感染的RAW264.7和BMDM細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的釋放，而miR-20a-3p的下調(diào)具有相反的效果。此外，miR-20a-3p通過(guò)直接靶向IKKβ抑制NF-κB通路的活性，從而抑制促炎細(xì)胞因子和減弱機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌的存活致病[15]。

綜上所述，研究顯示hsa-miR-20-3p所調(diào)控的部分靶基因在生命過(guò)程及疾病中的作用是值得進(jìn)一步的研究和探索，本文預(yù)測(cè)與其他相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道是基本相符的，尤其是病毒致癌過(guò)程是值得進(jìn)一步研究的方向，對(duì)臨床治療的新靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)，靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。