王 盛 吳 耐 龔 帥 張蓬波 張 沖 張秀忠 任澤強

胰腺癌是一種起源于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞及腺泡細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的致命性腫瘤，多發(fā)于男性和40～85歲人群，在無癥狀癌癥中居首位，具有高侵襲性、高病死率、高發(fā)生率特點[1]。因此，積極尋找早期診斷胰腺癌的生物學(xué)標(biāo)志物，對于指導(dǎo)患者的臨床治療及改善預(yù)后具有重要意義。白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-38是新近發(fā)現(xiàn)的一類能夠抑制炎癥作用的細(xì)胞因子，其歸屬于IL-1家族成員，因其能夠影響腫瘤微環(huán)境進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃逸宿主免疫細(xì)胞對其殺傷作用，近年來其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的作用受到研究者廣泛關(guān)注[2～5]。既往研究表明，IL-38在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌等惡性腫瘤中表達(dá)異常,并與患者的臨床病理資料相關(guān)[6～9]。然而，迄今為止國內(nèi)外關(guān)于IL-38在胰腺癌中的研究目前尚無報道。本研究通過分析IL-38在胰腺癌中的表達(dá)水平以及與患者臨床病理資料的相關(guān)性，旨在評價IL-38是否可以作為胰腺癌篩查及評價腫瘤病期及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，為臨床診療提供新的思路。

對象與方法

1.一般資料:選取2019年9月～2021年9月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科限期行手術(shù)治療的胰腺癌患者(胰腺癌組)62例，收集其臨床病理資料、血液標(biāo)本,其中男性35例，女性27例，患者平均年齡為57.56±10.13歲。另取同期筆者醫(yī)院健康體檢的志愿者55例作為健康對照組，其中男性31例，女性24例，平均年齡為53.65±12.17歲。兩組受試者的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)后病理證實為胰腺癌;②均為首次治療;③術(shù)前均未行放療、化療及其他抗腫瘤治療;④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有自身免疫性疾病、免疫缺陷病或合并其他器官惡性腫瘤者;②存在全身感染性疾病者;③因其他因素使用免疫抑制和(或)調(diào)節(jié)劑者;④合并其他胰腺器質(zhì)性疾病者。對照組納入標(biāo)準(zhǔn):①各項體檢指標(biāo)無異常;②半年內(nèi)無外傷及其他疾病史;③無其他合并癥。本研究獲得徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會的批準(zhǔn),所有受試者均簽署知情同意書。

2.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中IL-38水平：使用人IL-38 ELISA試劑盒(美國ProteinTech Group公司)說明書操作來測定IL-38濃度。標(biāo)本在室溫下解凍，再次離心。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔(8個)和樣品孔，每個孔加100μl待測標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，在37℃孵育2h后，丟棄液體并甩干，向每個孔中加入抗生物素抗體100μl 在37℃孵育箱內(nèi)孵育50min，洗3次，甩干，加入100μl過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，孵育1h。棄液體，將其甩干，板洗5次，并向每個孔中添加90μl的底物溶液37℃孵育20min，然后加入50μl終止溶液終止反應(yīng)，在450nm處檢測每個孔的吸光度(A)值，并自動轉(zhuǎn)換為濃度值。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中Treg和Th17細(xì)胞的表達(dá):采集所有研究對象5ml抗凝靜脈血，采用人淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋生物公司)通過密度梯度離心法分離得到PBMC，一部分PBMC經(jīng)PBS洗滌離心后加入鼠抗人CD4-FITC抗體，鼠抗人CD25-PE抗體，鼠抗人CD127-Alexa Fluor 647抗體(美國BD公司)，同時設(shè)同型對照管，室溫避光孵育30min后，采用LSRF ortessa型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測Treg細(xì)胞，其表型為CD4+CD25+CD127-。另一部分PBMC加入2μl白細(xì)胞活化雞尾酒(leukocyte activation cocktail)和BD GolgiPlug刺激劑(美國BD公司)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6h；流式管收集細(xì)胞，加入鼠抗人CD4-BV421抗體(美國BD公司)，室溫避光孵育30min后加入固定破膜液固定細(xì)胞10min，洗滌離心后加入5μl鼠抗人IL-17A-PE抗體(美國BD公司)，室溫避光孵育30min后，采用LSRF ortessa型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測Th17細(xì)胞，其表型為CD4+IL-17A+。

結(jié) 果

1.兩組患者血清IL-38水平比較:胰腺癌組患者血清IL-38為111.97±35.03pg/ml，健康對照組血清IL-38為156.39±36.98pg/ml。兩組血清白細(xì)胞介素水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.668，P<0.001)，詳見圖1。

圖1 胰腺癌組及健康對照組血清中IL-38的表達(dá)水平

2.胰腺癌組患者血清IL-38水平與患者臨床病理資料的聯(lián)系：胰腺癌組患者IL-38水平與不同的腫瘤分期、不同的分化類型以及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與患者年齡、性別、腫瘤直徑及腫瘤部位無明顯相關(guān)性(P>0.05)，詳見表1。

表1 IL-38 表達(dá)量與胰腺癌組患者臨床病理資料的關(guān)系

3.兩組外周血Treg和Th17細(xì)胞表達(dá)水平比較:胰腺癌組外周血中Treg細(xì)胞表達(dá)水平為3.18%±1.36%，健康對照組為4.91%±1.15%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.396，P<0.001)，詳見圖2中A～E。胰腺癌組外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)水平為2.87%±1.08%，健康對照組為2.05%±0.70%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.934，P<0.001),詳見圖2中F～H。

圖2 兩組外周血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞百分率比較A～D.CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)設(shè)門圖；E.兩組外周血Treg細(xì)胞百分率柱狀圖；F～G.CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)設(shè)門圖；H.兩組外周血Th17細(xì)胞百分率柱狀圖

4.胰腺癌組血清IL-38水平與外周血Treg和Th17細(xì)胞表達(dá)水平相關(guān)性分析:Pearson相關(guān)性分析顯示胰腺癌患者血清IL-38水平與外周血Treg細(xì)胞表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.44，P<0.01)，詳見圖3A；胰腺癌患者血清IL-38水平與外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.45，P<0.01)，詳見圖3B。

圖3 胰腺癌患者血清IL-38表達(dá)水平與Treg和Th17細(xì)胞相關(guān)性分析

5.IL-38對胰腺癌的風(fēng)險預(yù)測價值 ROC曲線分析：血清IL-38為150.65pg/ml時，預(yù)測診斷胰腺癌的曲線下面積為0.807(P<0.05)，敏感度為63.6%，特異性為87.1%，詳見圖4。

圖4 ROC曲線結(jié)果

討 論

近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子IL-38位于于人類第2號染色體長臂1區(qū)4帶1亞帶，相對分子質(zhì)量為16.9kDa，由5個外顯子組成[10]。在序列上IL-38與IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)高度同源，能夠抑制IL-1α和IL-1β表達(dá)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IL-1α和IL-1β均可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成[12,13]。此外，另一項研究表明，外源性給予IL-1Ra可以抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲,并提高抗腫瘤藥物的輸送能力[14]。鑒于IL-38與IL-1Ra高度同源，其在功能上同樣發(fā)揮抑炎作用，那么IL-38是否也參與胰腺癌的發(fā)病引起筆者極大的興趣。本研究結(jié)果表明，胰腺癌患者血清IL-38水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這提示IL-38很可能在胰腺癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)IL-38在胰腺癌患者中的表達(dá)水平在較晚的腫瘤分期、較差的分化類型以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)水平進(jìn)一步降低，而腫瘤分期、分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是評估胰腺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，所以本研究結(jié)果也間接提示胰腺癌患者血清中IL-38水平可以在一定程度反映患者的預(yù)后。

免疫應(yīng)答反應(yīng)一直以來是腫瘤學(xué)研究的中心問題，腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的平衡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞一直以來是研究腫瘤免疫的熱點，Th17細(xì)胞能夠促進(jìn)腫瘤免疫反應(yīng)，而Treg細(xì)胞能夠抑制腫瘤免疫反應(yīng)[15,16]。He等[15]研究發(fā)現(xiàn)，用抗體中和Th17細(xì)胞分泌的IL-17因子能夠抑制野生型小鼠的腫瘤生長，而過表達(dá)IL-17則促進(jìn)了腫瘤的生長。在胰腺癌模型中，Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，敲低模型鼠中Treg細(xì)胞能夠?qū)е履[瘤進(jìn)展加速。本研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平高于健康對照組，而Treg細(xì)胞在胰腺癌患者外周血中的表達(dá)水平低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，這提示Th17細(xì)胞很可能通過發(fā)揮促癌作用，而Treg細(xì)胞發(fā)揮抑癌作用參與胰腺癌的發(fā)病。因此，積極尋找調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡的因素顯得極為重要。

近年來越來越多的研究證據(jù)表明，IL-38是Th17/Treg細(xì)胞平衡的關(guān)鍵調(diào)控者[18]。IL-38能夠抑制NF-κB和MAPKs炎癥通路，進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞產(chǎn)生和分化[19]。此外，IL-38還能夠限制巨噬細(xì)胞的功能，進(jìn)而打破巨噬細(xì)胞維持Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡的作用，參與腫瘤、炎性疾病的發(fā)生[20]。本研究中胰腺癌患者血清中IL-38表達(dá)水平與外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與Treg細(xì)胞呈正相關(guān)，這間接提示IL-38很可能通過調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞平衡參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。鑒于IL-38在胰腺癌中的重要地位，進(jìn)一步繪制ROC曲線對胰腺癌的患病風(fēng)險進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血清中IL-38為最佳截點150.65pg/ml時，曲線下面積為0.807，在診斷方面，其敏感度為63.6%，特異性為87.1%，具有較好的敏感度和特異性。

然而，本研究還存在一定的不足，本研究沒有對癌組織中IL-38的mRNA水平進(jìn)行研究，將在未來的研究中進(jìn)行探討；此外本研究為前瞻性隊列研究，比較了胰腺癌患者外周血中IL-38水平，沒有進(jìn)一步深入研究IL-38在胰腺癌發(fā)病中發(fā)揮何種作用以及發(fā)病機制。

綜上所述，IL-38在胰腺癌患者血清中表達(dá)水平降低，并且表達(dá)水平與患者腫瘤分期、分化程度及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。另外，應(yīng)用外周血IL-38表達(dá)水平建立的胰腺癌風(fēng)險預(yù)測模型具有良好的應(yīng)用價值，有望成為新的生物學(xué)指標(biāo)。