郭美霞 李敏利 吳曉尉 王 彬 張曉華

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是由多種病因?qū)е碌囊认倬植垦仔院蛪乃?，并且伴有全身性炎性反?yīng)和多器官功能損害的疾病，“炎癥瀑布”反應(yīng)學(xué)說是目前國際認可的發(fā)病機制之一。研究顯示， SAP早期釋放了大量炎性介質(zhì), 并且通過一系列生物級聯(lián)放大效應(yīng), 釋放促炎性細胞因子, 主要包括TNF-α、 IL-6等，這些炎性介質(zhì)在SAP 發(fā)生、發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用[1，2]。CCN1是一種分泌豐富的、富含半胱氨酸的、肝素結(jié)合的細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白，被認為具有介導(dǎo)細胞黏附和誘導(dǎo)細胞遷移的功能。研究發(fā)現(xiàn)，CCN1作為一種新的促炎性細胞因子參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機制，提示CCN1作為炎性介質(zhì)在炎癥性疾病中扮演著重要角色，但CCN1在急性胰腺炎中的作用尚未見報道[3～5]。本研究通過觀察CCN1信號通路與促炎性細胞因子在SAP早期炎性反應(yīng)過程中的變化，進一步闡明SAP炎癥發(fā)病機制。

材料與方法

1.材料和主要儀器:健康SPF級SD雄性大鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量250g左右，購自重慶恩斯維爾生物科技有限公司。牛磺膽酸鈉購自美國Sigma公司；CCN1shRNA質(zhì)粒由威斯騰生物構(gòu)建，腫瘤壞死因子α (TNF-α)和AMY的ELISA 試劑盒均購自中國北京麗科創(chuàng)欣生物科技有限公司；垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、Trans-Blot轉(zhuǎn)膜裝置、電泳儀購自美國Bio-Rad公司，多功能酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；一抗：CCN1(兔來源)，二抗：羊抗兔IgG均購自英國Abcam公司。

2.方法：(1)動物分組及SAP模型制備：SD大鼠隨機分為空白對照組(control組)、SAP模型組(SAP組)和SAP+CCN1干預(yù)組(CCN1治療組)，每組12只。術(shù)前12h禁食，飲水自由。實驗大鼠稱重，7%水合氯醛(5ml/kg)注射于腹腔進行麻醉，將大鼠仰臥位固定，取上腹正中切口，顯露胰腺，確認胰膽管，以無創(chuàng)動脈夾于近肝門處夾畢胰膽管(近端于左右肝管匯合處遠，端于近十二指腸處)；在貼近十二指腸開口處逆行穿刺胰管，以微量注射器注射4%?；悄懰徕c，給藥劑量1ml/kg，速度0.2ml/min；為保證?；悄懰徕c充分進入胰腺，注射完畢后繼續(xù)將胰膽管夾畢(約5min后胰腺組織出現(xiàn)肉眼可見的充血、水腫)；補充腹腔積液，確認腹腔內(nèi)無活動性出血后兩層關(guān)腹。對照組大鼠模擬胰膽管穿刺操作，但不予以注射任何藥物。(2)給藥方式：C組于造模前12h按照50微克/只的劑量尾靜脈注射CCN1shRNA質(zhì)粒，1次注射。A、B組于相同時間點注射等量0.9%氯化鈉溶液。CCN1shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建：在pLVX-shRNA2載體中構(gòu)建CCN1shRNA。目的核苷酸序列:5′-GTGGAGTTAACAAGAAACA-3′。按照制造商的說明，使用EntransterTM-in vivo轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，重組質(zhì)粒測序驗證并大量抽提。(3)取材時間點：SAP建模后6、12、18h。實驗鼠稱重并麻醉，開腹于腹主動脈取血，靜置血液1～2h后離心(3000r/min，20min，4℃)，取上層血清于-20℃保存用于ELISA檢測。取胰腺組織兩份，一份放入4%多聚甲醛中4℃保存用于HE檢測；另一份置于-80℃冰箱中保存用于Western blot法檢測。

結(jié) 果

1.SAP組大鼠血清AMY水平的變化:與control組比較，SAP組大鼠血清AMY水平均明顯升高，該效應(yīng)與時間呈正相關(guān)，3個時間點中18h達最高水平，各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，表1)；CCN1治療組大鼠血清AMY水平較SAP組明顯下降，各組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，表1)。

表1 control組、SAP組及CCN1治療組血清AMY水平變化

2.SAP組大鼠血清TNF-α表達情況:與對照組比較，SAP組血清TNF-α表達水平明顯上調(diào)，并隨著作用時間延長而逐漸升高，造模18h時升至3個時間點的最高值，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，表2)；CCN1治療組大鼠血清TNF-α表達較SAP組明顯下降，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，表2)。

表2 control組、SAP組及CCN1治療組血清TNF-α水平變化

3.胰腺組織病理學(xué)檢查:依據(jù)Kusske評分標準，從分別從水腫、炎癥、出血、壞死4個方面對各組病理進行評估比較，對照組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)未見明顯異常，腺泡結(jié)構(gòu)正常，排列整齊。SAP組6h胰腺小葉正常結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，間隙增寬，間質(zhì)充血水腫；SAP組12h胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞，可見少量片狀壞死，部分間質(zhì)血管破裂，并可見大量炎性細胞浸潤，胰周脂肪液化壞死；SAP 18h組胰腺組織見大量壞死區(qū)，壞死區(qū)腺泡正常結(jié)構(gòu)完全消失(圖1)。與control組比較，各時間點大鼠胰腺病理評分比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，表3)；CCN1治療組大鼠胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞、炎性細胞浸潤較SAP組明顯減輕，與SAP組比較，各時間點大鼠胰腺病理評分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，表3)。

圖1 大鼠胰腺組織病理切片(HE,×100)

表3 control組、SAP組及CCN1治療組Kusske評分(分,

4.SAP大鼠胰腺CCN1表達情況:Western blot法檢測結(jié)果顯示，CCN1在control組大鼠胰腺幾乎無表達，SAP組6h可見少量表達，隨時間延長，CCN1表達上調(diào)，SAP 12h組表達明顯增加，18h升至最高值，各時間點與control組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；CCN1治療組胰腺組織CCN1表達明顯減少，各時間點與SAP組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，圖2)。

圖2 CCN1蛋白表達檢測1～3.control組6、12、18h；4～6.SAP組6、12、18h；7～9.CCN1治療組6、12、18h；各組分別于6、12、18h檢測大鼠胰腺組織CCN1蛋白表達

討 論

重癥急性胰腺炎在發(fā)病早期，胰腺腺泡細胞受損后胰酶釋放、單核-吞噬細胞激活，大量的細胞因子釋放，從而觸發(fā)炎性介質(zhì)瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)(cascades)，迅速導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory reaction syndrome，SIRS)和多器官衰竭(multiple organ failure， MOF)。阻斷胰腺炎早期炎癥級聯(lián)反應(yīng)可作為突破口，尋找胰腺炎新的治療靶點。

本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1、IL-6是急性胰腺炎的主要促炎性細胞因子，且血清及胰腺組織中的濃度隨造模時間延長明顯升高, 西地那非作用于牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)的急性胰腺炎大鼠中，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6基因表達明顯被抑制后，胰腺炎癥較對照組明顯減輕[6～8]。本研究結(jié)果表明，TNF-α在SAP組大鼠血清濃度明顯升高，與之前的研究結(jié)果一致，且于造模前12h按照50微克/只的劑量尾靜脈注射CCN1shRNA質(zhì)粒后，發(fā)現(xiàn)血清TNF-α及AMY濃度較SAP組明顯降低，表明CCN1抑制劑可通過降低炎性介質(zhì)TNF-α濃度，從而達到減輕炎癥的目的。

既往研究發(fā)現(xiàn)CCN1可誘導(dǎo)炎性細胞因子單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)mRNA及蛋白水平表達增加，且呈劑量及時間依賴性；分別用CCN1受體阻斷劑即整合素αvβ3,FAK抑制劑，PI3K抑制劑及AKT抑制劑干預(yù)后發(fā)現(xiàn)NF-κB明顯抑制[9]，提示CCN1參與炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。CCN1因其在炎癥中的作用而受到特別關(guān)注，本研究旨在探討CCN1對?；悄懰徕c誘導(dǎo)的急性胰腺炎大鼠模型的影響，結(jié)果表明，SAP組大鼠血清及胰腺組織中CCN1較control組明顯增加，隨著造模時間延長，CCN1濃度呈上升趨勢，胰腺組織炎癥壞死評分較正常對照組明顯增加，說明CCN1在急性胰腺炎中呈時間依賴性，且與胰腺組織炎癥程度呈正相關(guān)；經(jīng)尾靜脈注射CCN1shRNA質(zhì)粒的急性胰腺炎大鼠，血清及胰腺組織中CCN1濃度明顯降低，胰腺組織的炎癥壞死較SAP組明顯減輕。該方法對大鼠SAP模型具有良好的治療效果，抑制CCN1可降低胰腺炎癥、炎性細胞因子表達，這些發(fā)現(xiàn)支持了CCN1抑制劑在動物模型中的抗炎作用，這為研發(fā)急性胰腺炎新的治療靶點提供依據(jù)。

綜上所述，本研究證實了CCN1和TNF-α在急性胰腺炎中扮演重要角色，與炎癥嚴重程度呈正相關(guān)，抑制了CCN1的表達，胰腺炎癥明顯減輕，但CCN1是否是這條信號通路的始動因素，是哪個信號因子激活了這條信號通路，是否還有其他炎性細胞因子參與其中，還需要開展進一步研究，這也是本課題組下一步的研究方向。