鐘 柯 黃 欽 方雅萱 倪清穎 何振洋 楊 波

糖尿病腎病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病患者最重要的微血管病變之一，是導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)的主要原因， 隨著糖尿病發(fā)生率的上升，由其引起的ESRD的發(fā)生率由2000年的22.1%升至2015 年的 31.3%[1]。目前通過控制血糖、調(diào)節(jié)血脂以及降低血壓等基礎(chǔ)治療難以阻止DKD的進(jìn)展，且針對DKD的特異治療手段亦不盡如人意。 因此，如何延緩DKD的進(jìn)展仍然是一個(gè)重要的臨床及社會(huì)難題[2]。而有效診斷并及時(shí)干預(yù)是解決此類問題的關(guān)鍵。臨床上，微量白蛋白尿是評(píng)估DKD進(jìn)展的重要指標(biāo)，然而僅依靠白蛋白尿評(píng)估DKD的嚴(yán)重程度或預(yù)后并不準(zhǔn)確[3]。再者，雖然腎活檢作為診斷DKD的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于腎穿刺存在腎周血腫、動(dòng)靜脈瘺、出血、感染等風(fēng)險(xiǎn)，以及給患者造成嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)和消耗過多的醫(yī)療資源等問題，難以在DKD患者中全面推廣[4，5]。因此探尋一種新的敏感、特異、快速診斷糖尿病腎病的方法是防止糖尿病腎病患者死亡的關(guān)鍵。

microRNAs (miRNAs)是一類長度為19～25個(gè)核苷酸(nucleotide，nt)，具有高度保守性的非編碼RNA分子，在動(dòng)物體內(nèi)通過部分互補(bǔ)結(jié)合到目的mRNA的3′非編碼區(qū)(3′untranslated regions, 3′UTRs)，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，抑制蛋白質(zhì)合成。由于其在體液中的穩(wěn)定性以及易于檢測性，miRNAs已經(jīng)成為診斷許多疾病的重要生物學(xué)標(biāo)志物[6]。已有研究表明，miRNA-21在多種糖尿病并發(fā)癥中升高，因此miRNA-21可能成為診斷糖尿病腎病的新的生物學(xué)標(biāo)志物[7]。但目前國內(nèi)外關(guān)于miRNA-21診斷糖尿病腎病的準(zhǔn)確性尚無定論，故本研究旨在通過Meta分析確定miRNA-21是否可作為糖尿病腎病的預(yù)測性生物學(xué)標(biāo)志物，以綜合客觀評(píng)價(jià)miRNA-21對糖尿病腎病的診斷價(jià)值。

資料與方法

1.資料來源：計(jì)算機(jī)檢索Embase、PubMed、Web of Science、中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫(VIP)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(CBM)搜集miRNA-21與糖尿病腎病的相關(guān)性研究，檢索時(shí)間從建庫至2021年4月。英文檢索詞為microRNA-21、miRNA-21、Mir21、miR-21、Diabetic Nephropathies、Nephropathy, Diabetic、Diabetic Kidney Disease、Diabetic Glomerulosclerosis、Kimmelstiel-Wilson Syndrome、Diagnosis、Sensitivity、Specificity，中文檢索詞為microRNA-21、微小RNA-21、miR-21、MIR21、糖尿病腎病、糖尿病性腎小球硬化癥、腎小球硬化癥、糖尿病性腎病、診斷、敏感性、特異性。

2.納入標(biāo)準(zhǔn):(1)研究類型：miRNA-21診斷糖尿病腎病的診斷性試驗(yàn)。(2)研究對象：為確診糖尿病腎病的患者，對照組為健康人或其他糖尿病患者；年齡>18歲，無性別、民族等要求。(3)標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷和(或)病理診斷為糖尿病腎病的患者。(4)結(jié)局指標(biāo)：合并敏感度(sensitivity，Sen)、合并特異性(specificity，Spe)、合并陽性似然比(positive likelihood ratio，PLR)、合并陰性似然比(negative likelihood ratio，NLR)、診斷比值比(diagnosis odds ratio，DOR)和合并受試者工作特征曲線(summary receiver operator characteristic curve，SROC)以及曲線下面積(area under curve, AUC)等。(5)文獻(xiàn)明確說明是研究miRNA-21與糖尿病腎病診斷的關(guān)系,并能完整提取四格表數(shù)據(jù)。

3.排除標(biāo)準(zhǔn):①重復(fù)發(fā)表文獻(xiàn)；②非miRNA-21及糖尿病腎病的文獻(xiàn);③研究對象為細(xì)胞系或動(dòng)物；④綜述、病例報(bào)告、會(huì)議記錄、畢業(yè)論文；⑤數(shù)據(jù)不可信或無法提取四格表的文獻(xiàn)。

4.資料提取、文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)：兩名研究者獨(dú)立進(jìn)行文獻(xiàn)檢索并根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，提取的數(shù)據(jù)包括第一作者、發(fā)表年份、地區(qū)、診斷標(biāo)準(zhǔn)、糖尿病腎病程度、年齡、檢測方法、樣本量、cut-off值，真陽性數(shù)(true positive, TP)、假陽性數(shù)(false positive, FP)、假陰性數(shù)(false negative, FN)、真陰性數(shù)(true negative, TN)、敏感度、特異性，如若納入研究原文中未出現(xiàn)TP、FP、FN、TN，僅有ROC曲線的試驗(yàn)，則通過Plot Digitizer軟件分析獲得。兩名研究者再根據(jù)Revman軟件中的Quadas-2量表對納入的文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，Quadas-2量表是一種診斷準(zhǔn)確性研究質(zhì)量評(píng)估工具，主要通過病例的選擇、待評(píng)價(jià)試驗(yàn)、金標(biāo)準(zhǔn)、病例流程和進(jìn)展情況評(píng)估每篇文章的偏倚風(fēng)險(xiǎn)[8]。在文獻(xiàn)提取和質(zhì)量評(píng)價(jià)過程中，兩名研究者如若遇到分歧、意見不一致則與第3各研究者協(xié)商解決。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：利用Stata15.1以及Meta-Disc1.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在診斷試驗(yàn)中引起異質(zhì)性的原因有閾值效應(yīng)和非閾值效應(yīng)。利用Meta-Disc1.4軟件計(jì)算出Spearman相關(guān)系數(shù)r, 分析是否存在閾值效應(yīng)，隨后通過診斷價(jià)值比(diagnostic odds ratio, DOR)的Cochran-Q檢驗(yàn)探討非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性，若異質(zhì)性檢驗(yàn)P>0.1 時(shí)，表明所納入研究無異質(zhì)性，用固定效應(yīng)模型。若異質(zhì)性檢驗(yàn)P≤0.1時(shí)，表明所納入研究存在異質(zhì)性，用隨機(jī)效應(yīng)模型，其中AUC值為≥0.5且≤0.7、>0.7且≤0.9、>0.9且≤1.0分別表示低、中、高診斷準(zhǔn)確率。隨后通過Meta分析中的回歸、亞組和敏感度分析探索與閾值效應(yīng)無關(guān)的異質(zhì)性來源。計(jì)算納入文獻(xiàn)的合并敏感度、合并特異性、陽性似然比、陰性似然比、DOR、SROC曲線以及曲線下面積等。

結(jié) 果

1.文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果：通過設(shè)定的檢索詞，共檢索出379篇文獻(xiàn)。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入7篇研究[9～15]。文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果詳見圖1A。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程及偏移分布A.文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果;B.Quadas-2納入文獻(xiàn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)及偏倚分布

2.納入研究的基本特征和質(zhì)量評(píng)價(jià)：本文共納入7項(xiàng)研究，共涉及882例樣本，其中糖尿病腎病患者525例，對照病例357例，納入研究的基本特征詳見表1。使用Quadas-2評(píng)價(jià)系統(tǒng)評(píng)價(jià)文獻(xiàn)發(fā)表質(zhì)量及偏倚風(fēng)險(xiǎn)(圖1B)。結(jié)果表明，所納入的7篇研究的文獻(xiàn)質(zhì)量屬于中高水平。從風(fēng)險(xiǎn)偏倚來說，可能對結(jié)果存在一定的偏倚影響。

表1 納入研究的基本特征

3.閾值效應(yīng)：利用Meta-Disc1.4軟件分析得出敏感度對數(shù)和(1-特異性)對數(shù)之間Spearman相關(guān)系數(shù)為0.143(P=0.760>0.05)，提示本次研究不存在閾值效應(yīng)異質(zhì)性。通過繪制對稱SROC曲線并沒有出現(xiàn)“肩臂狀”，更進(jìn)一步證明以上結(jié)論。

4.非閾值效應(yīng)異質(zhì)性：診斷價(jià)值比DOR的Cochran-Q檢驗(yàn)得出Cochran-Q=19.09，P=0.0040，因此本研究存在非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。結(jié)果為：合并敏感度為62%(95% CI:58%～68%)，見圖2A，合并特異性為73%(95% CI：68%～78%)，見圖2B。PLR為2.50(95% CI：1.79～3.50)，見圖2C，NLR為0.43(95% CI：0.31～0.60)，見圖2D。DOR為6.29(95% CI：3.36～11.79)，SROC曲線下AUC面積為0.7889(圖3A)，故表明miRNA-21對糖尿病腎病有中等的診斷率。且本次研究的敏感度、特異性、陽性似然比、陰性似然比、DOR的I2均>50%，表明異質(zhì)性較大，隨后尋找異質(zhì)性來源。

圖2 miRNA-21診斷糖尿病腎病森林圖A.miRNA-21診斷糖尿病腎病合并敏感度分析；B.miRNA-21診斷糖尿病腎病合并特異性分析；C.miRNA-21診斷糖尿病腎病合并陽性似然比；D.miRNA-21診斷糖尿病腎病合并陰性似然比

圖3 SROC曲線和敏感度分析A.miRNA-21診斷糖尿病腎病的SROC曲線；B. miRNA-21診斷糖尿病腎病的敏感度分析

5.敏感度分析：利用Stata15.1軟件對上述7項(xiàng)研究進(jìn)行敏感度分析， 結(jié)果如圖3B，發(fā)現(xiàn)王錢虎等[10]的研究對結(jié)果影響較大，隨后重新閱讀此項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)其選擇病例為早期糖尿病腎病，而其他研究的病例為非早期糖尿病腎病，所以可能結(jié)果產(chǎn)生較大影響，故剔除此項(xiàng)研究。

6.Meta回歸分析與亞組分析：通過單變量Meta回歸分析，納入文獻(xiàn)的異質(zhì)性可能來源于診斷標(biāo)準(zhǔn)(是否有腎活檢報(bào)告)、地區(qū)、樣本量、糖尿病腎病的年齡，見圖4A。隨后根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)(是否有腎活檢報(bào)告)進(jìn)行亞組分析，分析結(jié)果見表2。結(jié)果顯示miRNA-21在有腎活檢報(bào)告的研究與無腎活檢報(bào)告的研究相比有更高的敏感度(77.9% vs 62.9%)和特異性(83.6% vs 72.9%)以及有更低的異質(zhì)性(敏感度I20 vs 93.9%, 特異性I20 vs 87.5%)， 有腎活檢報(bào)告的研究與無腎活檢試驗(yàn)報(bào)告的研究相比有更高的DOR(17.986 vs 4.544)和更高的AUC(0.8802 vs 0.7516)。因此miRNA-21在糖尿病腎病中的診斷效價(jià)可能接近于腎活檢。

圖4 Meta回歸分析及發(fā)表偏倚A.miRNA-21診斷糖尿病腎病的Meta回歸分析；B.Deek′s漏斗圖評(píng)估m(xù)iRNA-21診斷糖尿病腎病的發(fā)表偏倚

表2 亞組分析計(jì)算結(jié)果

7.發(fā)表偏倚：使用 Stata 15.1制作 Deek′s漏斗圖，結(jié)果提示納入研究無明顯發(fā)表偏倚，見圖4B(Bias=17.42154，P=0.27)。

討 論

糖尿病進(jìn)展到后期，易誘發(fā)循環(huán)系統(tǒng)疾病，其中糖尿病腎病為其常見并發(fā)癥，不僅給患者及其家庭帶來了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)壓力，也成為社會(huì)的繁重負(fù)擔(dān)。因此，糖尿病腎病的早期診斷不僅是公共衛(wèi)生及臨床檢驗(yàn)的重大挑戰(zhàn)，而且對提高糖尿病患者的生存率和改善生活質(zhì)量具有重要意義[16]。近年來，miRNAs已經(jīng)被認(rèn)為是許多疾病完美的診斷、治療和預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物[17～20]。miRNA-21是最具代表性的miRNAs之一[21]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21可以通過調(diào)節(jié)Smad7的表達(dá)影響糖尿病腎病的進(jìn)展[22]。此外，Ahmed等[23]研究發(fā)現(xiàn)，抑制miRNA-21可以導(dǎo)致人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and rensin homolog，PTEN)的表達(dá)減少，從而通過影響腎小球系膜細(xì)胞中Akt/mTORC1信號(hào)通路，降低mTORC1的活性，導(dǎo)致腎小球系膜擴(kuò)張和細(xì)胞外基質(zhì)沉積減少，最終有效治療和預(yù)防糖尿病腎病。因此，miRNA-21有可能用作糖尿病腎病新興的生物學(xué)標(biāo)志物，以幫助DKD的早期診斷。然而，這些結(jié)果尚未得到證實(shí)，因此這項(xiàng)Meta分析對于確定miRNA-21對糖尿病腎病的診斷價(jià)值有重要意義。

本系統(tǒng)評(píng)價(jià)一共納入7項(xiàng)研究，共涉及882例樣本，累計(jì)糖尿病腎病患者病例525例，對照病例357例，系統(tǒng)地回顧了miRNA-21診斷糖尿病腎病的臨床研究。采用Meta分析的方法，客觀地評(píng)估了miRNA-21對糖尿病腎病的診斷價(jià)值， Meta分析結(jié)果顯示miRNA-21診斷糖尿病腎病的合并敏感度為62%，合并特異性為73%，說明miRNA-21對于診斷糖尿病腎病具有一定的價(jià)值。合并陽性似然比和陰性似然比分別為2.50和0.43，表明糖尿病腎病患者miRNA-21陽性的可能性是正常對照組的2.5倍，43%的個(gè)體結(jié)果為陰性，這進(jìn)一步證實(shí)了miRNA-21在糖尿病腎病中的診斷意義。合并的診斷價(jià)值比為6.29，SROC曲線下AUC面積為0.7889，則表明miRNA-21對糖尿病腎病診斷效果中等，能較好地診斷糖尿病腎病。

SROC曲線圖顯示各研究對應(yīng)的點(diǎn)散在分布，不呈“肩臂”狀分布，以DOR為效應(yīng)量，納入研究存在重度異質(zhì)性，其可能是由于納入研究的樣本主要來自于中國，因此miRNAs的表達(dá)可能存在地區(qū)差異。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)作為目前最準(zhǔn)確的miRNAs定量方法，其總RNA的提取過程以及標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參的選擇也可能是異質(zhì)性的潛在來源[24]。因此這些因素可能會(huì)影響miRNAs的表達(dá)水平的檢測值。本研究中Spearman相關(guān)系數(shù)為0.143，提示異質(zhì)性與閾值效應(yīng)無關(guān)，Deek′s漏斗圖未檢驗(yàn)到已發(fā)表的偏倚，因此異質(zhì)性的來源主要由非閾值效應(yīng)引起。隨后對診斷標(biāo)準(zhǔn)、地區(qū)、樣本量以及糖尿病腎病年齡進(jìn)行亞組分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-21在有腎活檢報(bào)告的研究中有更高的DOR(17.986 vs 4.544)和更高的診斷效能(AUC：0.8802 vs 0.7516)，這可能與沒做腎活檢的研究納入的糖尿病腎病患者可能存在假陽性有關(guān)。因此，miRNA-21在糖尿病腎病的診斷效價(jià)可能接近于腎活檢。眾所周知，腎組織病理活檢是糖尿病腎病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其檢測過程有創(chuàng)性，臨床應(yīng)用受到限制。此外，腎活檢有潛在的并發(fā)癥，如出血、肉眼血尿、動(dòng)靜脈內(nèi)瘺以及血管和周圍器官損傷等[25]。因此miRNA-21作為無侵入性的診斷手段，可以在糖尿病腎病的診斷中成為新的無創(chuàng)生物學(xué)標(biāo)志物。

糖尿病以及糖尿病并發(fā)癥已經(jīng)成為一個(gè)公共衛(wèi)生問題引起了人們的關(guān)注，并且由于它的流行，成為一個(gè)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而miRNAs由于其獨(dú)特的生理特性在診斷和治療糖尿病及糖尿病并發(fā)癥中顯示出巨大的潛力[26]。有研究表明，通過靶向miRNA142-3p/Tet2/Foxp3軸，有效干預(yù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的不穩(wěn)定性從而改善1型糖尿病中自身免疫的激活和進(jìn)展[27]。并且在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中，miRNA-126、miRNA-21、miRNA-181c、miRNA-1179 的血清表達(dá)水平和miRNA-21、miRNA-155 的血漿表達(dá)水平的失調(diào)，可作為該疾病的標(biāo)志物并且監(jiān)測該疾病進(jìn)展[28]。尤其是近年來許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腎組織、外周血和尿液中 miRNA-21 的特異性變化通過不同的信號(hào)通路和靶點(diǎn)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、代謝異常、免疫反應(yīng)和纖維化，從而影響糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展[22,23,29]。這些研究都進(jìn)一步證明了miRNA-21在診斷和治療糖尿病腎病的巨大潛力，這可能是未來研究的領(lǐng)域。

本研究具有一定的局限性：①納入研究大多數(shù)為中國地區(qū)，無法代表其他地區(qū)，因此將該結(jié)果外推時(shí)需謹(jǐn)慎;②納入的文獻(xiàn)僅包含中英文，一定程度上存在語言上的偏倚;③納入文獻(xiàn)所含病例數(shù)較少， miRNAs研究在方法學(xué)差異和生物學(xué)效應(yīng)方面存在顯著的異質(zhì)性，因此需選擇更大樣本量，更高研究質(zhì)量的文獻(xiàn)進(jìn)行 Meta分析來驗(yàn)證、完善本研究的結(jié)果。

綜上所述，本研究認(rèn)為miRNA-21是一種快速的、無創(chuàng)的診斷糖尿病腎病的方法，其對糖尿病腎病的臨床診斷具有一定價(jià)值。但目前miRNA-21在臨床研究中缺乏大樣本的數(shù)據(jù)論證，因此納入文獻(xiàn)的質(zhì)量和數(shù)量等限制,還需要進(jìn)一步的高質(zhì)量的研究予以驗(yàn)證。但隨著研究的進(jìn)一步深入，miRNA-21在糖尿病腎病的臨床診斷中具有廣泛應(yīng)用前景。