古力夏提·艾力 袁 芳 張 鵬 再娜甫古麗·買(mǎi)買(mǎi)提 肖 輝

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，已成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大問(wèn)題[1]。據(jù)2019年《世界阿爾茨海默病報(bào)告》顯示，全球AD患者人數(shù)已高達(dá)5000萬(wàn)，我國(guó)60歲以上人群中AD患病率達(dá)到5.5%[2]。AD以β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積形成的細(xì)胞外神經(jīng)炎性斑塊為主要病理特征，Aβ的生成與淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)密切相關(guān)[3，4]。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前，AD相關(guān)的藥物僅能緩解癥狀，無(wú)法完全治愈[5]。因此，越來(lái)越多的研究人員正在從中藥及其有效成分出發(fā)，尋求有效、安全、易于服用的天然藥物防治AD[6]。

瑣瑣葡萄既是食品又是被記載在《維吾爾藥志》、《神農(nóng)本草經(jīng)》等醫(yī)藥典籍中的傳統(tǒng)藥材，具有補(bǔ)氣血、利小便、強(qiáng)筋骨等功效，醫(yī)用于治療脾胃不和、頭暈腰酸、神志不安等[7]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)含黃酮類(lèi)化合物比較豐富的植物和水果具有修復(fù)損傷神經(jīng)元細(xì)胞、增強(qiáng)記憶等功能[8]。黃酮作為瑣瑣葡萄的主要有效成分之一，本實(shí)驗(yàn)用APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠研究瑣瑣葡萄總黃酮(flavones fromVitisviniferaL.，VTF)對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠行為學(xué)及海馬CA1區(qū) AD 相關(guān)性病理形態(tài)學(xué)變化，以期為臨床研究提供相關(guān)依據(jù)。

材料與方法

1.藥品和主要試劑：瑣瑣葡萄藥材購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)吐魯番維吾爾藥材市場(chǎng)，鹽酸多奈哌齊購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，兔抗APP、兔抗Aβ1～42購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，兔二步法試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2.主要儀器: 冷凍干燥箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津公司，Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司,NIKON正置研究級(jí)顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司。

3.瑣瑣葡萄黃酮的制備和測(cè)定: 瑣瑣葡萄95%乙醇回流提取，提取液減壓濃縮至浸膏，以水混懸萃取后，上 AB-8 大孔樹(shù)脂，洗脫餾分后減壓濃縮，冷凍干燥，得棕黃色粉末即VTF。參照文獻(xiàn)[9]方法制備標(biāo)曲，得回歸方程Y=9.4714X+0.0308，R2=0.999。精確稱(chēng)量VTF，平行制備5份，測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算平均百分含量。

4.動(dòng)物分組及給藥：6月齡SPF級(jí)雄性APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠75只，同齡SPF級(jí)雄性C57BL/6對(duì)照組15只，購(gòu)自啟動(dòng)子生物科技(北京)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0004，使用許可證：SYXK(新)2018-0003，倫理審批號(hào)：IACUC-20210507-07]。適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠75只，隨機(jī)分為5組，即模型組，陽(yáng)性對(duì)照組(多奈哌齊組，0.7mg/kg)，VTF低、中、高劑量組(70、210、420mg/kg)。另取6月齡同背景SPF級(jí)C57BL/6小鼠15只為空白對(duì)照組。空白對(duì)照組和模型組小鼠給予0.5%CMC-Na(0.1ml/10g)灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組給予多奈哌齊溶液(0.7mg/kg)進(jìn)行灌胃；VTF 高、中、低劑量組灌胃分別為 420、210、70mg/kg，連續(xù)給藥8周。

5.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：各組動(dòng)物在給藥 8周后，參照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行 Morris水迷宮訓(xùn)練，分析小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期以及穿越有效區(qū)域的次數(shù)。

6.HE染色：行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取6只小鼠，解剖取腦組織，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋后切片，染色，鏡下觀察腦組織切片。

7.免疫組化：切片脫蠟至水，抗原修復(fù)；山羊血清封閉20min；隨后滴加一抗(1∶500)，4℃過(guò)夜；滴加二抗工作液；DAB 顯色；蘇木精復(fù)染；封片，顯微鏡下觀察。

結(jié) 果

1.瑣瑣葡萄黃酮含量測(cè)定：得回歸方程Y=9.4714X+0.0308，R2=0.999(圖1)，測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算平均百分含量，RSD值為0.33%(表1)。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 瑣瑣葡萄總黃酮含量測(cè)定

2.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠逃逸潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01，圖2)；與模型組比較，VTF各劑量組逃逸潛伏期顯著縮短(P<0.05，圖2)。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)顯著減少(P<0.01，圖3)；與模型組比較，VTF低劑量和VTF中劑量有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)顯著增多(P<0.05，圖3)； 說(shuō)明VTF可以有效改善APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠認(rèn)知能力。

圖2 各組小鼠逃逸潛伏期的變化與空白對(duì)照組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.05, ##P<0.01

圖3 各組小鼠有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)與空白對(duì)照組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.05, ##P<0.01

3.VTF對(duì)小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)影響的組織病理學(xué)觀察：光鏡下可見(jiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型組有大量有凋亡傾向的神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量減少且松散不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)萎縮有間隙。與模型組比較，VTF各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組的海馬神經(jīng)元細(xì)胞大多較正常，排列較整齊緊密，著色均勻，核仁清晰，核固縮、染色減輕，可見(jiàn)損傷程度和范圍有所減輕，表明VTF可以有效保護(hù)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠大腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞(圖4)。

圖4 各組小鼠海馬CA1區(qū)染色結(jié)果(HE,×400)A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D.VTF低劑量組；E.VTF中劑量組；F.VTF高劑量組

4.VTF 對(duì)小鼠海馬組織CA1區(qū) APP 代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬組織APP蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多、染色較深；與模型組比較，VTF各劑量組小鼠海馬組織APP蛋白陽(yáng)性細(xì)胞均有所減少，染色減弱，陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞散在分布。表明VTF可以下調(diào)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬組織CA1區(qū) APP 的表達(dá)，進(jìn)而減少Aβ沉積，減緩AD的病程進(jìn)展(圖5)。

圖5 各組小鼠海馬組織CA1區(qū) APP 代謝相關(guān)蛋白表達(dá)(IHC,×400)A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D.VTF低劑量組；E.VTF中劑量組；F.VTF高劑量組

5.VTF 對(duì)小鼠海馬組織CA1區(qū) Aβ1～42蛋白表達(dá)的影響：與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬CA1區(qū)棕黃色陽(yáng)性產(chǎn)物明顯增多，提示小鼠腦內(nèi)Aβ1～42蛋白的表達(dá)量顯著增加。與模型組比較，VTF各劑量組Aβ1～42蛋白的表達(dá)量減少，但是仍然有棕黃色陽(yáng)性產(chǎn)物，表明VTF可以降低APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬組織CA1區(qū) Aβ1～42的過(guò)表達(dá)(圖6)。

圖6 各組小鼠海馬組織CA1區(qū) Aβ1～42 代謝相關(guān)蛋白表達(dá)(IHC,×400)A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D.VTF低劑量組；E.VTF中劑量組；F.VTF高劑量組

討 論

大量研究證實(shí)，大腦中Aβ的過(guò)度產(chǎn)生是AD的核心原因[11]。APP通過(guò)淀粉樣途徑水解產(chǎn)生多肽Aβ，當(dāng)Aβ產(chǎn)生與清除的平衡被打破時(shí)，大量Aβ在腦內(nèi)蓄積，清除減慢，最終在腦內(nèi)蓄積產(chǎn)生淀粉樣斑塊，引發(fā)AD[12]。研究表明，黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化、抗衰老、保護(hù)神經(jīng)、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等作用[13, 14]。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用黃酮類(lèi)化合物可以通過(guò)削弱淀粉樣蛋白生成途徑來(lái)減少Aβ40～42的生成，從而改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的記憶缺陷[15]。前期研究發(fā)現(xiàn)，VTF也可以保護(hù)PC12 細(xì)胞不受 Aβ25～35誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的影響[16]。

海馬體主要負(fù)責(zé)記憶和學(xué)習(xí)功能[17]。研究表明，其損傷可能導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降[18]。本研究行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，VTF各劑量組逃逸潛伏期時(shí)長(zhǎng)顯著減少，低劑量和中劑量組進(jìn)入有效區(qū)域次數(shù)顯著增多，提示VTF對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害有積極的改善作用，尤其是VTF低、中劑量組能顯著緩解，與既往報(bào)道黃酮類(lèi)化合物有改善記憶和學(xué)習(xí)能力結(jié)果一致[19, 20]。AD病理特征主要為Aβ沉積形成老年斑，APP的異常生成促使Aβ數(shù)量增加[21]。楚晉等[22]研究表明，淫羊藿黃酮能夠通過(guò)降低APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP和BACE的表達(dá)來(lái)減少Aβ的產(chǎn)生和聚集, 從而延緩APP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦病理進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VTF各劑量組海馬神經(jīng)元細(xì)胞大多數(shù)較正常，排列較規(guī)整緊密，胞核固縮濃染減輕；棕黃色陽(yáng)性產(chǎn)物APP和Aβ1～42蛋白表達(dá)趨于減少，染色減弱，陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞散在分布，說(shuō)明VTF能通過(guò)下調(diào)APP 蛋白表達(dá)水平從而減少 Aβ產(chǎn)生，改善神經(jīng)元損傷。

綜上所述，VTF可以有效改善APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠大腦的神經(jīng)元細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，可以減少APP和Aβ1～42在APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦內(nèi)的過(guò)表達(dá)，對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠具有較好的防治作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入探討VTF對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠神經(jīng)保護(hù)作用的研究奠定基礎(chǔ)，對(duì)于VTF活性成分改善神經(jīng)元損傷的途徑和機(jī)制，需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入探討。