周 歡 薛 征 劉亞尊 崔 雯 韓兆鵬 王雅娟 沈世平

哮喘是兒童肺部氣道常見的慢性炎癥性疾病，以氣道炎癥和氣道重塑為兩大病理學(xué)特征，其中氣道炎癥是哮喘發(fā)病的核心環(huán)節(jié)[1]。而氣道炎癥的發(fā)生主要在于Th1和Th2免疫細(xì)胞應(yīng)答的不平衡，改善哮喘Th1/Th2免疫失衡是治療哮喘的重要策略[2]。TSLP激活的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)過(guò)表達(dá)表面分子及共刺激分子，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞表現(xiàn)出Th2分化細(xì)胞的特征表型，并上調(diào)OX40L表達(dá)[3,4]。OX40L直接參與由TSLP介導(dǎo)的Th2細(xì)胞分化，且已有研究表明,TSLP和OX40L在氣道炎癥和高反應(yīng)性的發(fā)展中至關(guān)重要[5]?？嘈尤受?amygdalin, C10H27NO11)屬氫苷類化合物，廣泛存在于桃、杏、李子、蘋果、山楂等薔薇科植物種子中[6]。高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測(cè)定苦杏仁苷為苦杏仁的主要有效成分之一[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗纖維化、抗炎、免疫抑制、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤以及抗?jié)兊茸饔肹8]。目前苦杏仁苷研究多集中于抗腫瘤領(lǐng)域，對(duì)于干預(yù)哮喘研究較少。本研究通過(guò)分析苦杏仁苷通過(guò)TSLP-DC-OX40L信號(hào)通路干預(yù)支氣管哮喘氣道炎癥作用機(jī)制及作用環(huán)節(jié)，為臨床上治療兒童哮喘提供新的理論證據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑:動(dòng)物來(lái)源于南京生物醫(yī)藥研究所。雄性BALB/c小鼠，4～6周齡，體質(zhì)量18～22g，飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，環(huán)境控制在室溫24℃、濕度50%～70%環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水與進(jìn)食，1周后待4組小鼠適應(yīng)環(huán)境后開始造模。卵白蛋白(ovalbumin,OVA)、苦杏仁苷購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。醋酸地塞米松片購(gòu)自上海通用制藥有限公司(批號(hào)：061002)。TSLP、IL-4和IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司。蘇木精-伊紅染液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。anti-oX40L、anti-T-bet、anti-GATA-3均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

2.動(dòng)物分組、造模及藥物治療：將雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、地塞米松組、苦杏仁苷組，每組10只。除空白組外，其余組小鼠均建立OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型。將10mg OVA和1mg氫氧化鋁溶解于0.9%氯化鈉溶液中，制成濃度為10%的致敏液進(jìn)行腹腔注射兩次，每次間隔兩周。末次致敏7天后，將各組小鼠置于5L密閉容器中，用超聲霧化器吸入5% OVA 0.9%氯化鈉溶液30min，每天1次，持續(xù)1周?？嘈尤受战M按15mg/(kg·d)腹腔注射，空白組和模型組給予等量蒸餾水，地塞米松組將醋酸地塞米松片用蒸餾水配制成濃度為0.075mg/ml的溶液后灌胃。模型組和空白組均吸入等量的0.9%氯化鈉溶液，均連續(xù)給藥7天。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：頸椎脫臼處死各組小鼠，取其股骨和脛骨、RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗、分離、用RPMI 1640完全培養(yǎng)液配成2.5×104/ml的細(xì)胞懸液，加入GM-CSF(20ng/ml)+IL-4(10ng/ml)誘導(dǎo)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至第72h起，每隔2天半換液，并加入全量細(xì)胞因子，收獲DC。培養(yǎng)至第9天時(shí)，輕輕吹打培養(yǎng)基，然后吸出培養(yǎng)基，放入50ml離心管，用10ml新鮮培養(yǎng)基再洗下培養(yǎng)瓶，吸出再放入50ml離心管，兩次合并一起離心(300r/min,5min)，棄上清，沉淀用完全培養(yǎng)基重懸，進(jìn)行觀察。

4.肺組織病理學(xué)分析:取小鼠右肺支氣管組織，用10%甲醛溶液固定后，蘇木精-伊紅染色制備切片。在光鏡下觀察各組肺主支氣管及周圍組織形態(tài)學(xué)改變。

5.ELISA 分析：收集小鼠左肺支氣管肺泡灌洗液，1000r/min,離心20min后取上清液；將上清液參照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，在450nm處測(cè)吸光度值(A值)以測(cè)定標(biāo)本中TLSP、IL-4、IFN-γ的實(shí)際濃度。

6.Western blot法檢測(cè)：將肺組織剪成細(xì)小的碎片，按每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃ 12000×g離心15min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80℃冰箱。通過(guò)10% SDS-PAGE電泳分離蛋白(20μg)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉(檢測(cè)磷酸化蛋白用BSA)室溫封閉2h。根據(jù)說(shuō)明書 OX40L(1∶300)、T-bet(1∶500)、GATA-3(1∶1000)、GAPDH(1∶2000)稀釋抗體，和膜4℃孵育過(guò)夜。隨后根據(jù)用量，按照1∶1000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1h。取ECL發(fā)光顯色液進(jìn)行顯影。

結(jié) 果

1.一般情況:哮喘模型小鼠治療前表現(xiàn)為毛發(fā)豎立、煩躁不安、易受驚嚇、氣促、大小便失禁、用前肢抓撓口鼻等。空白組小鼠皮毛光亮，活動(dòng)正常，無(wú)明顯氣短和大小便失禁。治療7天后，空白組和模型組小鼠狀態(tài)無(wú)明顯變化，地塞米松組、苦杏仁苷組小鼠癥狀有所改善，但與空白組在精神狀態(tài)、毛色和一般活動(dòng)方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.肺組織病理學(xué)：經(jīng)過(guò)7天的藥物干預(yù)，空白組小鼠肺內(nèi)細(xì)支氣管壁及肺泡結(jié)構(gòu)正常，氣管黏膜上皮完整，管腔內(nèi)無(wú)黏液滲出及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管壁肌層及管周結(jié)構(gòu)為正常肺組織。模型組肺內(nèi)細(xì)支氣管黏膜上皮受損，部分脫落，管腔內(nèi)可見大量炎性滲出物，伴脫落上皮細(xì)胞充塞，管周充血水腫，細(xì)胞排列紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管壁平滑肌較空白組增厚；地塞米松組、苦杏仁苷組小鼠管周組織存在不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管管壁結(jié)構(gòu)完整，增厚不明顯，其中地塞米松組浸潤(rùn)程度最輕，其次為苦杏仁苷組(圖1)。

圖1 苦杏仁苷對(duì)哮喘模型小鼠肺組織病理改變的影響(HE，×200)A.空白組;B.模型組;C.地塞米松組;D.苦杏仁苷組

3.ELISA分析:對(duì)BALF上清液中TSLP、INF-γ、IL-4水平的影響，與空白組比較，模型組、地塞米松組、苦杏仁苷組TSLP、IL-4水平明顯升高(P均<0.05)，INF-γ水平明顯降低(P均<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、苦杏仁苷組TSLP、IL-4水平明顯降低(P均<0.05)，INF-γ水平均明顯升高(P均<0．05)；與地塞米松組比較，苦杏仁苷組TSLP、INF-γ、IL-4水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 各組小鼠BALF中IL-4、IFN-γ、TSLP水平比較

4.Western blot法檢測(cè):與空白組比較，模型組、地塞米松組、苦杏仁苷組OX40L、GATA-3蛋白的表達(dá)有明顯升高(P<0.05)，T-bet蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、苦杏仁苷組OX40L蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，T-bet蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與地塞米松組比較，苦杏仁苷組OX40L、GATA-3、T-bet 蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

圖2 各組小鼠肺組織中OX40L、GATA-3、T-bet蛋白水平與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

5.細(xì)胞培養(yǎng):干預(yù)7天后體外培養(yǎng)DC1、2、3、6、9天，觀察其細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)24h后，于培養(yǎng)瓶底部可見體積較小的貼壁、半貼壁細(xì)胞，以圓形為主、呈均勻分布狀態(tài)；培養(yǎng)48h后，細(xì)胞由均勻分布轉(zhuǎn)為點(diǎn)狀聚集，集落細(xì)胞數(shù)量不等，同時(shí)少量細(xì)胞出現(xiàn)懸浮狀態(tài)；培養(yǎng)3天后，細(xì)胞體積較前增大，形態(tài)不規(guī)則，可見偽足樣突起，部分細(xì)胞單個(gè)存在，并疏松黏附于瓶壁，少數(shù)細(xì)胞成簇抱團(tuán)；培養(yǎng)6天后，大部分細(xì)胞體積繼續(xù)增大，呈半懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞表面突起增多、增粗，呈現(xiàn)典型的樹突狀或分支為星狀，部分呈現(xiàn)梭形；培養(yǎng)9天后，樹突狀細(xì)胞基本脫壁生長(zhǎng)，體積又繼續(xù)變大，細(xì)胞刺突明顯，且繼續(xù)增長(zhǎng)增粗，部分細(xì)胞可見細(xì)胞核，從形態(tài)學(xué)上看，此時(shí)DC基本培養(yǎng)成熟。與空白組比較，模型組、地塞米松組、苦杏仁苷組出現(xiàn)偽足樣突起的時(shí)間較早且明顯，細(xì)胞體積增大，集落細(xì)胞團(tuán)形成增多；與模型組比較，地塞米松組、苦杏仁苷組偽足樣突起少，體積較小，集落細(xì)胞團(tuán)形成減少；與地塞米松組比較，苦杏仁苷組偽足樣突起、體積和細(xì)胞團(tuán)無(wú)明顯差異(圖3～圖7)。

圖3 體外培養(yǎng)DC光鏡觀察圖(1天后)A.空白組；B.模型組；C.地塞米松組；D.苦杏仁苷組

圖4 體外培養(yǎng)DC光鏡觀察圖(2天后)A.空白組；B.模型組；C.地塞米松組；D.苦杏仁苷組

圖5 體外培養(yǎng)DC光鏡觀察圖(3天后)A.空白組；B.模型組；C.地塞米松組；D.苦杏仁苷組

圖6 體外培養(yǎng)DC光鏡觀察圖(6天后)A.空白組；B.模型組；C.地塞米松組；D.苦杏仁苷組

圖7 體外培養(yǎng)DC光鏡觀察圖(9天后)A.空白組;B.模型組;C.地塞米松組；D.苦杏仁苷組

討 論

哮喘是一種異質(zhì)性的慢性氣道炎癥疾病，常伴有氣道高反應(yīng)性與氣道重塑，臨床主要表現(xiàn)為喘息、呼吸急促、胸悶或咳嗽等癥狀[9]。根據(jù)國(guó)內(nèi)研究者的大樣本量調(diào)查顯示，我國(guó)大部分城市兒童哮喘發(fā)生率明顯上升，在過(guò)去的10年和20年，0～14歲兒童哮喘發(fā)生率分別增加了43.4%和147.9%[10]。

苦杏仁為中醫(yī)經(jīng)典名方中的常用藥味，常常聯(lián)用以發(fā)揮止咳平喘的作用。苦杏仁為薔薇科植物杏的干燥成熟種子，味苦，性微溫，歸肺、大腸經(jīng)，具有降氣止咳平喘、潤(rùn)腸通便的功效，常用于咳嗽氣喘，胸滿痰多，腸燥便秘等癥[11]。苦杏仁在常用方劑如麻黃湯、大青龍湯、麻杏石甘湯、厚樸麻黃湯、冷哮丸、蛤蚧定喘丸等作為君藥或者臣藥使用，對(duì)治療哮喘起到了一定的作用[12]?；跀?shù)據(jù)挖掘技術(shù)研究中醫(yī)藥治療兒童哮喘用藥規(guī)律，最終檢索文獻(xiàn)數(shù)據(jù)3030篇，結(jié)果共納入1040首方藥，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)共涉及藥物292味，高頻藥物50味，其中苦杏仁使用頻次位于第2位[13]。同時(shí)有研究結(jié)果表明，苦杏仁苷可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子的合成，減輕LPS所致的肺損傷，此外苦杏仁苷還能顯著抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的激活，證明苦杏仁苷具有抗炎作用[14]。

樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是哮喘發(fā)病的啟動(dòng)者，能促使CD4+幼稚T細(xì)胞活化并干預(yù)其分化方向，在啟動(dòng)免疫反應(yīng)和維持免疫耐受方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。DC在決定Th0 細(xì)胞向Th1或Th2細(xì)胞方向分化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，是控制Th細(xì)胞應(yīng)答方向(Th1或者Th2)的基礎(chǔ)。Th1和Th2淋巴細(xì)胞是CD4+T輔助細(xì)胞的兩個(gè)主要亞群，在小鼠和人類中均有發(fā)現(xiàn)，其具有不同的功能，且分泌特征性的細(xì)胞因子。Th1和Th2處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持機(jī)體正常免疫功能[18]。TSLP是一種強(qiáng)烈激活樹突狀細(xì)胞的上皮細(xì)胞源性細(xì)胞因子，在肺、皮膚和腸道中表達(dá)最多。一項(xiàng)研究表明，在哮喘氣道中TSLP的表達(dá)增加，并且與Th2的趨化因子的分泌和疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[19]。TSLP通過(guò)上調(diào)MHC Ⅱ類分子和共刺激分子直接激活DC，提高OX40L的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞存活，誘導(dǎo)趨化因子分泌[20]。

在本研究哮喘模型中，地塞米松組、苦杏仁苷組小鼠肺泡灌洗液中INF-γ水平顯著提高，TSLP、IL-4水平降低，肺組織中T-bet的蛋白表達(dá)增加，OX40L、GATA-3的蛋白表達(dá)減少，其中INF-γ與IL-4、T-bet與GATA-3值差異減小，Th1/Th2恢復(fù)平衡，本研究結(jié)果表明，苦杏仁苷可促進(jìn)DC細(xì)胞成熟，降低OX40L的表達(dá)，促使Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，影響TSLP介導(dǎo)DC對(duì)淋巴細(xì)胞的極化。結(jié)果提示苦杏仁苷可能通過(guò)TSLP-DC-OX40L通路調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡參與哮喘發(fā)病和氣道炎癥，為苦杏仁苷防治哮喘提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，靶向TSLP通路改善哮喘氣道炎癥，為臨床治療哮喘提供了新的策略和理想藥物的新靶點(diǎn)。