姚 靚 宋延平 陳信義 田劭丹

血小板減少癥在臨床中較為常見，血小板計(jì)數(shù)輕度減少時(shí)患者常無明顯臨床癥狀，血小板計(jì)數(shù)中度減少時(shí)可見出血現(xiàn)象，如皮膚紫癜、牙齦出血，口腔黏膜出血等。血小板計(jì)數(shù)重度減少時(shí)則可能出現(xiàn)臟器出血，特別是致命的顱內(nèi)出血[1]。導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)減少最常見的是血液系統(tǒng)疾病，其次是風(fēng)濕免疫病、惡性腫瘤放化療及其他藥物相關(guān)性血小板減少癥等[2～7]。具有益氣養(yǎng)陰活血功效的益髓方為北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院院內(nèi)制劑，已在臨床應(yīng)用近30年，對(duì)骨髓增生異常綜合征低?；颊咄庵苎缶哂忻黠@改善效果[8～10]。同時(shí)，通過長期臨床應(yīng)用觀察，益髓方對(duì)血小板計(jì)數(shù)減少亦有較好提升效果[11]。筆者所在課題組在承擔(dān)國家“十一五重大新藥創(chuàng)制科技專項(xiàng)”研究過程中，選取環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)致血小板計(jì)數(shù)減少小鼠模型為研究對(duì)象，采用不同劑量益髓方進(jìn)行干預(yù)，觀察模型小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)變化，以期為將益髓方拓展應(yīng)用于治療血小板減少癥提供客觀依據(jù)。

材料與方法

1.動(dòng)物：KM小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：0001303，許可證號(hào)：SCXK(陜)2007-001]，室溫20～24℃，相對(duì)濕度為40%～70%，光照8h/d，排風(fēng)扇通風(fēng)2次/天，每次1h，雌雄分籠飼養(yǎng)，自來水自由攝取，飼料為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全價(jià)營養(yǎng)飼料，適應(yīng)性觀察1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.藥物與試劑：益髓方由陜西星華研究所按照中藥新藥研究工藝制備并提供。按照醫(yī)院制劑成人每日45g成藥處方量，體重按60kg計(jì)，服藥量為0.75g/kg體重。陽性藥物益血生膠囊，生產(chǎn)批號(hào)：110915，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z19983056，成人每粒0.25g?？诜?，每次4粒，每日3次。體重按60kg計(jì)，服藥量為0.05g/kg體重。浙江天杭生物科技有限公司生產(chǎn)的出生2h內(nèi)的健康新生牛無支原體血清，質(zhì)量級(jí)別：超級(jí)，裝量：200ml，最終過濾孔徑：0.1μm(生產(chǎn)批號(hào)：100701)；瑞氏色素(批號(hào)：20100422)購自天津傲然精細(xì)化工研究所；甲醇(批號(hào)：110416)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

3.儀器：電子天平(型號(hào)：BS210S)，精確度0.1mg，購自北京賽多利斯天平廠；XSZ-H型彩色攝像機(jī)由北京杰偉世視音頻設(shè)備有限公司組裝。Exigo Vet 動(dòng)物血細(xì)胞分析儀從瑞典EXIGO公司進(jìn)口。

4.造模：參照參考文獻(xiàn)[12]方法，先取16只健康KM小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為兩組，模型組和正常對(duì)照組。模型組按體質(zhì)量腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液首劑量200mg/kg，0.1ml/10g，1次/天。次日起給予維持劑量30mg/kg，0.1ml/10g，1次/天，連續(xù)6天。正常對(duì)照組按體質(zhì)量腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，0.1ml/10g，1次/天，連續(xù)7天。末次給藥24h后，摘眼球取血，檢測模型小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)，進(jìn)行t檢驗(yàn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)模型組外周血血小板計(jì)數(shù)明顯低于正常對(duì)照組時(shí)(P<0.05)，表明預(yù)實(shí)驗(yàn)成功，再按照此造模方法進(jìn)行正式試驗(yàn)。

5.分組：取健康KM小鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、益血生膠囊對(duì)照組與益髓方大、中、小劑量組。

6.給藥：除正常對(duì)照組之外，其余各組小鼠按體質(zhì)量腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液首劑200mg/kg，0.1ml/10g，1次/天。次日起給予維持劑量30mg/kg，0.1ml/10g，1次/天，連續(xù)6天；正常對(duì)照組按體質(zhì)量腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.1ml/10g，1次/天，連續(xù)7天。益髓方按臨床每公斤體質(zhì)量服藥量0.75g/kg，小鼠給藥大、中、小劑量分別為15g/kg、7.5g/kg、3.75g/kg，分別為臨床擬用劑量的20、10、5倍；益血生劑量1g/kg為臨床擬用劑量的20倍。于造模當(dāng)天起，灌胃給藥，1次/天，連續(xù)7天。

7.檢測指標(biāo)：末次給藥后24h，各組小鼠分別摘眼球采血，用動(dòng)物血球計(jì)數(shù)儀檢測各組小鼠外周血小板(platelet，PLT)、白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計(jì)數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，取股骨，除凈軟組織，用6號(hào)針頭以1ml小牛血清沖出骨髓細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過濾制成單個(gè)骨髓細(xì)胞懸液。將單個(gè)骨髓細(xì)胞懸液以1000r/min離心5min，去上清，洗滌2次，棄上清，小牛血清定容至5ml。制備骨髓涂片，瑞氏染液染色。由陜西省中醫(yī)學(xué)院藥物研究所血液實(shí)驗(yàn)室專科實(shí)驗(yàn)師按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，并進(jìn)行評(píng)分。骨髓增生程度判定標(biāo)準(zhǔn)：①骨髓增生極度活躍：有核細(xì)胞占全部細(xì)胞(包括無核紅細(xì)胞)的比例≥50%或有核細(xì)胞≥100個(gè)，評(píng)4分；②骨髓增生明顯活躍：有核細(xì)胞占全部細(xì)胞(包括無核紅細(xì)胞)的比例>10%且<50%或有核細(xì)胞>50個(gè)且<100個(gè)，評(píng)3分;③骨髓增生活躍：有核細(xì)胞占全部細(xì)胞(包括無核紅細(xì)胞)的比例≤10%且>1%或有核細(xì)胞>10個(gè)且≤50個(gè)，評(píng)2分;④骨髓增生減低：有核細(xì)胞占全部細(xì)胞(包括無核紅細(xì)胞)的比例≤1%或有核細(xì)胞≤10個(gè)，評(píng)1分;⑤骨髓增生極度減低：有核細(xì)胞占全部細(xì)胞(包括無核紅細(xì)胞)的比例≤0.5%或有核細(xì)胞≤5個(gè)，評(píng)0分。

結(jié) 果

1.對(duì)血小板計(jì)數(shù)的影響：實(shí)驗(yàn)各組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)檢測結(jié)果詳見表1。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)明顯減少(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，益髓方大、中、小劑量組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)明顯提升(P<0.05，P<0.01)。表明益髓方各劑量均有治療CTX致血小板減少作用。

表1 實(shí)驗(yàn)各組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)檢測結(jié)果

2.對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響：實(shí)驗(yàn)各組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測結(jié)果詳見表2。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、益血生膠囊對(duì)照組、益髓方各劑量組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯減少(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，益血生膠囊對(duì)照組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于模型對(duì)照組(P<0.05)；益髓方各劑量組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)與模型對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明對(duì)照藥益血生膠囊有治療CTX致白細(xì)胞減少作用。

表2 實(shí)驗(yàn)各組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測結(jié)果

3.對(duì)骨髓增殖的影響：按照骨髓增殖程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)各組小鼠骨髓增殖程度檢測結(jié)果詳見表3。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠骨髓增殖程度評(píng)分明顯升高(P<0.05)，可能與應(yīng)用CTX后骨髓反應(yīng)性增生有關(guān)。與正常對(duì)照組比較，用藥各組小鼠骨髓增殖程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明應(yīng)用益血生膠囊、益髓方各劑量干預(yù)后CTX模型小鼠沒有發(fā)生顯著骨髓抑制。

表3 實(shí)驗(yàn)各組小鼠骨髓增殖程度檢測結(jié)果

討 論

CTX屬廣譜抗腫瘤藥物，常與其他抗腫瘤藥物組成聯(lián)合化療方案，對(duì)各種類型的白血病和實(shí)體瘤均有治療效果[13]。CTX作為免疫抑制劑，還可用于治療各種自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、多發(fā)性肉芽腫、天皰瘡以及潰瘍性結(jié)腸炎、原發(fā)免疫性血小板減少癥等，也是自體造血干細(xì)胞移植的干細(xì)胞動(dòng)員劑[14～17]。CTX在臨床應(yīng)用中可見不同類型及不同程度的不良反應(yīng)，其中對(duì)骨髓造血的影響使其成為制備骨髓抑制動(dòng)物模型的常用藥物[18，19]。

益髓方(原名益髓顆粒劑)由炙黃芪、黨參、生地、熟地、菟絲子、丹參、龜板膠、阿膠、桃仁、紅花、地龍、白花蛇舌草、雞血藤、蜈蚣等組成。炙黃芪為治諸氣虛之要藥；阿膠擅補(bǔ)血、止血、滋陰潤燥；兩藥合用可達(dá)益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)血生血之功效，在方中為君藥。熟地可滋陰補(bǔ)血、益精填髓；丹參能活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩、養(yǎng)血安神；雞血藤能補(bǔ)血、活血、通絡(luò)；三藥合用既能補(bǔ)益肝腎、填精生髓，又能活血通絡(luò)、祛瘀生新，輔助君藥加強(qiáng)益氣養(yǎng)陰，生血補(bǔ)血之效，在方中為臣藥。黨參能補(bǔ)中益氣、生津養(yǎng)血；紅花可活血化瘀；生地能清熱涼血、養(yǎng)陰生津；龜甲膠可滋陰潛陽、補(bǔ)腎填精；諸藥合用，即可強(qiáng)健脾胃，促進(jìn)水谷精微吸收，化營為血，又可補(bǔ)益肝腎，滋陰養(yǎng)血，在方中為佐藥。菟絲子功效補(bǔ)陽益陰，在諸多滋陰藥中加入補(bǔ)陽藥，取陽中求陰之意；又因肝腎同源，基于“腎主骨生髓”理論，取菟絲子能引諸藥走五臟、入骨髓、調(diào)和氣血陰陽之性，在方中為使藥。綜觀全方諸藥合用達(dá)“益氣養(yǎng)陰(血)、活血通絡(luò)、祛瘀生新”之功效[20]。

益髓方原意用于骨髓增生異常綜合征低?；颊咧委煟軌蚓徑饣蚍€(wěn)定患者外周血象，延緩急性白血病轉(zhuǎn)化速度，降低轉(zhuǎn)白率，并能夠降低患者感染概率[21,22]。在臨床應(yīng)用中，通過觀察發(fā)現(xiàn)，益髓方對(duì)免疫性血小板減少癥也具有較好療效，有促進(jìn)骨髓病態(tài)巨核細(xì)胞分化成熟等效果[23]。因此，課題組通過本次研究擬探索益髓方對(duì)化療所致血小板減少癥的療效。結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，益髓方大、中、小劑量組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)均明顯提升(P<0.05)，表明益髓方各劑量組均對(duì)CTX致血小板計(jì)數(shù)減少有治療作用。與模型對(duì)照組比較，益血生膠囊對(duì)照組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高(P<0.05)，而益髓方高、中、低劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明益髓方對(duì)CTX致白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少治療效果不明顯。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠骨髓增殖程度評(píng)分明顯升高(P<0.05)，可能與應(yīng)用CTX后骨髓應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，其結(jié)果與CTX聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子能夠動(dòng)員骨髓造血干細(xì)胞一致，相關(guān)機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。與正常對(duì)照組比較，用藥各組小鼠骨髓增殖程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明應(yīng)用益血生膠囊、益髓方各劑量干預(yù)后CTX模型小鼠未發(fā)生顯著骨髓抑制。

綜上所述，益髓方大、中、小劑量組對(duì)CTX致血小板計(jì)數(shù)減少模型小鼠有治療作用，且可能有降低化療致骨髓損傷作用，為益髓方治療化療相關(guān)血小板減少癥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。陽性對(duì)照藥益血生膠囊對(duì)CTX致模型小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少有治療作用，值得臨床推廣應(yīng)用。由于紅細(xì)胞壽命較長，在本實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到紅細(xì)胞與血紅蛋白減少情況，故未在文中列出。