杜晶，游國(guó)葉，樊輕亞

（信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000）

鮮魚(yú)腥草為三白草科植物蕺菜屬蕺菜的新鮮全草或干枯的地上部分[1]，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效，可治療肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱淋、熱痢、癰腫瘡毒等癥[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明魚(yú)腥草具有抗腫瘤、抗病毒和抗炎等作用[3]。其水溶性多糖具有抗菌、抗病毒、提高機(jī)體免疫力和利尿等作用[4]。

目前魚(yú)腥草多糖未見(jiàn)CCD優(yōu)化胰蛋白酶提取魚(yú)腥草多糖的方法，本課題組以魚(yú)腥草為研究對(duì)象，采用星點(diǎn)-效應(yīng)面優(yōu)化胰蛋白酶多糖提取工藝，旨在為魚(yú)腥草多糖相關(guān)產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)提供一定的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV2000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫水浴鍋，江蘇金壇市宏華儀器廠；天平，JYT-10型，上海醫(yī)用激光儀器廠；循環(huán)水真空泵，SHB3，上海申生科技有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，GZX-9240MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子天平，AY120，日本島津株式會(huì)社。

1.2 試劑與藥品

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)080621，Sigma公司；胰蛋白酶，批號(hào)081105，廣州市齊云生物生產(chǎn)；苯酚、濃硫酸、氨水、95%乙醇，均為分析純，苯酚試液參考文獻(xiàn)[5-7]配制。魚(yú)腥草全草購(gòu)于河南藥材公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 魚(yú)腥草多糖提取方法的建立

精密稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.099 g，加水溶解并定容至 100 mL，配制得質(zhì)量濃度為0.99 mg·mL-1的葡萄糖對(duì)照品貯備液。分別精密稱(chēng)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置10 mL容量瓶中加水至刻度線，搖勻，再分別取1 mL，加1 mL 5%苯酚溶液、5 mL濃硫酸顯色40 min以上。另取1 mL蒸餾水，加同量苯酚和濃硫酸，同法操作，作為空白對(duì)照。置UV2000型分光光度計(jì)中，于490 nm測(cè)定吸收度，以吸收度（Y）對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=8.428 6X-0.025 8，相關(guān)系數(shù)為0.995 9。結(jié)果表明葡萄糖在0.019 7～0.058 9 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

分別稱(chēng)取魚(yú)腥草藥材5.0 g，按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行提取粗多糖，精密稱(chēng)取于50 ℃烘干至衡重的粗多糖0.100 0 g，加水溶解并定容至50 mL，搖勻，再取1 mL定容至10 mL容量瓶中，得供試品，分別取供試品1 mL，置于試管中，加1 mL苯酚、5 mL濃硫酸，振搖均勻，顯色40 min以上。另取1 mL 蒸餾水，加同量苯酚和濃硫酸，同法操作嗎，作為空白對(duì)照。置UV2000型分光光度計(jì)中，于490 nm測(cè)定吸收度，求得多糖含量。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.8 mL，定容到10 mL容量瓶中，再取1 mL，苯酚-硫酸法顯色，每隔20 min測(cè)定一次吸收度，連續(xù)2 h考察其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明供試液在2 h顯色穩(wěn)定，RSD=0.30%

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL，定容至10 mL容量瓶中，再取1 mL，苯酚-硫酸法顯色，連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，RSD=1.4%，表明精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取50 ℃干燥至恒重的魚(yú)腥草粗多糖6份，分別置于100 mL的容量瓶中復(fù)溶，再取2 mL定容至10 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

從表3結(jié)果可以看出，用苯酚-硫酸法進(jìn)行魚(yú)腥草多糖的分析，重現(xiàn)性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.2.4 加樣回收率測(cè)定

精密稱(chēng)取樣品5 g，加入精制多糖600 mg，精密稱(chēng)定，按樣品制備方法操作，精密量取1.0 mL，苯酚-硫酸法顯色，于490 nm波長(zhǎng)處用可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收率測(cè)定

2.3 胰蛋白酶提取魚(yú)腥草多糖最佳條件的優(yōu)選

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]并結(jié)合實(shí)際，確定影響酶法提取多糖的因素主要有酶添加量、pH值、溫度、時(shí)間等，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上以pH＝7和40倍魚(yú)腥草藥材體積水提取多糖，根據(jù)筆者單因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶的量、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)腥草多糖的得率有顯著影響，故采取星點(diǎn)-效應(yīng)面法[11-12]對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理對(duì)各因素進(jìn)行了5水平設(shè)計(jì)，開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，各因素水平分布見(jiàn)表5。

表5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表

使用Design Expert8.0.6版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得多元線性回歸擬合方程Y=21.48+0.66A-0.055B+2.71C，P=0.085 9，r=0.574 5。二項(xiàng)式擬合方程Y=21.48+0.66A-0.055B+2.71C-0.25AB+0.27AC+0.87BC-2.59A2-1.61B2-2.40C2，P=0.000 2，r=0.9612。二項(xiàng)式擬合方程的相關(guān)系數(shù)較高，表明該模型的擬合程度高，預(yù)測(cè)性好，因此選用二項(xiàng)式擬合模型來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。

表6 效應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果顯示，該二項(xiàng)式擬合模型F=13.50，P＜0.01，表明該模型具有顯著性，=0.855 5，說(shuō)明因變量和自變量之間有顯著的線性關(guān)系，由R2=0.923 9可知預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間有較高的相關(guān)性，綜上所述，該模型與實(shí)際情況的擬合程度較好，可用于評(píng)價(jià)魚(yú)腥草多糖的提取量的實(shí)際情況。

根據(jù)所擬合的二項(xiàng)式，應(yīng)用CCD繪制各因素對(duì)多糖含量影響的三維效應(yīng)面圖，見(jiàn)圖1。在酶添加量和酶解溫度交互三維圖中，當(dāng)溫度一定，魚(yú)腥草多糖提取量隨著酶量的增加先增加后下降，當(dāng)酶量不變時(shí)，隨著溫度的提升，多糖的提取量也是先升高再降低，多糖提取量比較高的范圍為，酶添加量（2.0，2.3），酶解溫度（43，45）；由酶加量和酶解時(shí)間交互圖可知，酶添加量（1.5，2.5）、酶解時(shí)間（144,180）的時(shí)候，魚(yú)腥草多糖的提取量高；由酶解溫度和酶解時(shí)間的交互圖可知，酶解溫度（42，48）、酶解時(shí)間（144，188）。再結(jié)合二次多項(xiàng)式擬合方程求偏導(dǎo)得到最佳提取條件為酶添加量為2%，酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為150 min，多糖的理論提取量為25.99，與實(shí)測(cè)值25.93基本相符，因此采用星點(diǎn)-效應(yīng)面法得到的胰蛋白酶提取魚(yú)腥草多糖的提取工藝具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖1 酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)胰蛋白酶提取多糖含量的影響

3 結(jié) 論

將星點(diǎn)-效應(yīng)面法應(yīng)用于胰蛋白酶提取魚(yú)腥草多糖提取工藝的優(yōu)化，結(jié)合單因素試驗(yàn)，確定酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度3個(gè)影響因素，然后采用星點(diǎn)-效應(yīng)面對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，運(yùn)用Design-expert 8.0.6軟件安排試驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所得提取條件（酶添加量為2%、酶解時(shí)間為150 min、酶解溫度為45 ℃）穩(wěn)定可控，工藝簡(jiǎn)便，便于工業(yè)化操作，可謂魚(yú)腥草多糖的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。