王凱，李衛(wèi)，李志芳，紀會瓊，郭志偉，曹俊秋

（1.達州中醫(yī)藥職業(yè)學院公共基礎(chǔ)部，四川達州 635000；2.達州市疾病預防控制中心附屬醫(yī)院，四川達州 635000；3.南充市中心醫(yī)院影像科，四川南充 637000；4.四川大學華西醫(yī)院肝膽外科，四川成都 610000）

肝癌是發(fā)生在肝臟的惡性實體瘤，肝癌發(fā)病早期無典型癥狀，晚期可表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力和肝臟區(qū)域疼痛等癥狀，肝癌早期治愈幾率較高，晚期治療方案復雜且患者預后差異較大［1］。肝癌發(fā)病率位居惡性腫瘤第4位，致死率位居第2位，男性發(fā)病率高于女性，肝癌發(fā)病具體作用機制和誘發(fā)因素尚未闡明，普遍認為肝癌發(fā)病與飲酒、食用霉變食物、病毒性肝炎、寄生蟲和遺傳等因素有關(guān)［2］，肝癌基因組學研究［3］顯示肝癌發(fā)病或進展和轉(zhuǎn)移與多種基因突變、表觀遺傳修飾有關(guān)，肝細胞癌變后會重新激活端粒酶，導致癌變細胞增殖失控。細胞分裂周期25B（cell division cyclin 25B，CDC25B）是調(diào)控細胞周期的蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員CDC25 的異構(gòu)體之一，在細胞周期的特定階段發(fā)揮作用［4］，有研究［5-6］顯示CDC25B可參與乳腺癌、黑色素瘤等疾病的調(diào)節(jié)過程。多種植物中的天然成分表現(xiàn)明顯的抗腫瘤活性，其中包括紫杉醇、姜黃素、長春花素等，β-谷甾醇是廣泛分布于植物中的甾醇類物質(zhì)，我國杜仲、玄參和天冬等傳統(tǒng)中草藥的藥用成分中也含有大量的植物甾醇類物質(zhì)。已有研究表明［7］紅豆杉中的β-谷甾醇和β-谷甾醇-葡萄糖苷對肝癌細胞表現(xiàn)毒性作用，但其具體作用機制尚不明確，故本研究通過肝癌數(shù)據(jù)庫平臺聯(lián)合分子生物學技術(shù)探討黃β-谷甾醇對肝癌細胞增殖的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞和主要試劑

HepG2細胞系和Hep3B細胞系（中科院上海細胞庫），6 周齡BALB∕C Nude 裸小鼠【成都達碩實驗動物有限公司SCXK（川）2020-030】，動物實驗遵守3R 原則并通過達州中醫(yī)藥職業(yè)學院實驗動物倫理委員會批準（審批號20210309A）；β-谷甾醇（貨號CFN99916，純度＞95%，武漢中標科技有限公司），CCK-8試劑盒（貨號CK04，深圳市紐邦生物技術(shù)有限公司），細胞凋亡和細胞周期試劑盒（貨號A025、F10797，艾美捷科技有限公司），CDC25B 抗體（貨號FNab01522，武漢菲恩生物科技有限公司），Ki67 抗體（貨號AD80028，上海研卉生物科技有限公司），PVDF 膜（貨號ISEQ00010，美國Milipore公司），蛋白提取試劑盒（貨號SD-001，美國Invent Biotechnologies 公司），LipofectamineTM2000（貨號11668019，美國Invitrogen公司）。

1.2 主要儀器

流式細胞儀（Aurora 3L-5L，美國Cytek Biosciences 公司），顯微鏡（X-Cite? 120PC Q，武漢提沃克科技有限公司），酶標儀（SpectraMax iD3，美國Molecular Devices 公司），冷凍離心機（Selectspin?17R，美國Select BioProducts 公司），細胞培養(yǎng)箱（Galaxy 48 R，德國Eppendorf公司）。

1.3 生物信息學分析

通過SwissTarget 和TargetNet 數(shù)據(jù)平臺預測β-谷甾醇的靶點基因37 個，GEO2R 分析GSE101728肝癌數(shù)據(jù)集中表達上調(diào)基因并與37 個靶點的交集基因5 個，然后通過下載TCGA_LIHC 數(shù)據(jù)矩陣分析得到5 個基因中只有CDC25B 與肝癌TNM 分期（T1、T2-4）、臨床分期（I 期、Ⅱ-Ⅳ期）、癌癥組織分化（G1-2 分化、G3-4 分化）、復發(fā)情況（復發(fā)、未復發(fā)）和患者生存預后（預后良好、預后不良）存在關(guān)系。

1.4 細胞培養(yǎng)和β-谷甾醇處理

將HepG2 細胞系和Hep3B 細胞系置于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中培養(yǎng)的96 孔板培養(yǎng)（每孔3×105個），培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2加濕培養(yǎng)箱，孵育12 h 后，HepG2 細胞系給予β-谷甾醇（0、5、10、15、20μmol∕L）處理48 h，Hep3B 細胞系給予β-谷甾醇（0、6、12、18、24 μmol∕L）處理48 h，加入10μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h，在波長450 nm處檢測光密度（OD），計算細胞活力相對活力=（實驗組OD∕空白組OD）×100%。根據(jù)兩種細胞系的細胞相對活力情況，Hep3B 細胞系以15 μmol∕L 作為β-谷甾醇處理濃度，HepG2 細胞系以18μmol∕L 作為β-谷甾醇處理濃度，分別作用于0、1、2、3、4、5 d時使用CCK-8 法檢測在450 nm 處OD，并設(shè)置不用β-谷甾醇處理的細胞作為Control 組，并繪制生長曲線。

1.5 細胞集落形成實驗檢測細胞增殖情況

將HepG2 細胞和Hep3B 細胞接種至6 孔板（每孔1 000 個），孵育12 h 后，Hep3B 細胞加入β-谷甾醇至終濃度為18μmol∕L，HepG2 細胞加入β-谷甾醇至終濃度為15μmol∕L，繼續(xù)培養(yǎng)2 周，使用多聚甲醛固定15 min、1%結(jié)晶紫染色30 min，沖洗，統(tǒng)計細胞集落形成數(shù)目，計算相對集落形成率=（實驗組集落形成數(shù)目∕對照組集落形成數(shù)目）×100%

1.6 流式細胞法檢測細胞周期分布和細胞凋亡情況

收集Hep3B 細胞系（15μmol∕L β-谷甾醇處理48 h）和HepG2 細胞系（18 μmol∕L β-谷甾醇處理48 h），2 000g離心5 min 收集細胞沉淀。一部分細胞沉淀中經(jīng)磷酸緩沖液洗滌2 次，75%乙醇-20℃固定24 h，0.4μL PI 避光孵育0.5 h，上樣流式細胞儀檢測處于不同細胞周期的細胞分布情況。一部分細胞沉淀中加入300μL 1×Binding Buffer 使細胞重懸，然后加入5 μL Annexin V∕FITC、10 μL PI 避光孵育15 min上樣流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 裸鼠移植瘤模型實驗

取18 只BALB∕C Nude 裸小鼠均分為Control 組和β-谷甾醇組，分別于皮下注射HepG2 細胞（8×106個細胞），同時β-谷甾醇組裸鼠腹腔注射β-谷甾醇50 mg∕kg·d，Control組裸鼠注射等體積DMSO，每2 d 測量1 次腫瘤的體積（1∕2×腫瘤長軸×腫瘤短軸2），連續(xù)14 d，處死裸鼠稱量移植瘤質(zhì)量和測量移植瘤體積，使用免疫組化檢測移植瘤中Ki67 蛋白表達水平。

1.8 免疫組化

參考文獻報道的方法［8］進行免疫組化檢測蛋白表達，將移植瘤固定于40 g∕L 多聚甲醛溶液中并進行常規(guī)石蠟包埋、切片，枸櫞酸抗原修復液微波修復10 min，磷酸緩沖液沖洗2 次，加入3%過氧化物酶阻斷液封閉30 min，加入Ki67 抗體（1：500）37 ℃反應45 min，加入生物素標記的二抗繼續(xù)孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗×2 次，DAB 顯色5 min，蒸餾水沖洗，蘇木素染色20 s，乙醇濃度梯度脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡（×200）下觀察Ki67 表達水平，呈棕褐色顆粒即為Ki67 表達陽性。

1.9 Western blot檢測蛋白表達

提取細胞總蛋白，調(diào)整蛋白濃度一致，經(jīng)SDSPAGE 凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，5%脫脂奶粉密封2 h，加入兔抗人CDC25B、β-actin 一抗（1：500）4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗，加入HRP 標記的二抗（1：500）孵育1 h，TBST 漂洗，顯色、定影，使用凝膠成像儀自帶系統(tǒng)分析蛋白條帶相對灰度值。

1.10 細胞轉(zhuǎn)染

參照LipofectamineTM2000 說明書進行細胞轉(zhuǎn)染，細胞轉(zhuǎn)染前24 h 將細胞提前接種于24 孔板，當細胞生長至融合30%～50%時，將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基，加入CDC25B 過表達質(zhì)粒和空質(zhì)粒，同時每孔細胞中加入200μL 轉(zhuǎn)染液繼續(xù)孵育6 h，然后將無血清培養(yǎng)基更換為含有血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，用G418 篩選出穩(wěn)定過表達CDC25B 的HepG2 和Hep3B 細胞系。使用Western blot驗證細胞中CDC25B蛋白表達水平。β-谷甾醇處理穩(wěn)定過表達CDC25B 的HepG2 和Hep3B 細胞（作用濃度同1.5；記為β-谷甾醇+CDC25B 組），空載對照組且進行β-谷甾醇處理的細胞記為β-谷甾醇組，不做處理的細胞記為Control 組，使用CCK-8、細胞集落形成實驗、流式細胞法檢測細胞活力、細胞增殖、細胞周期分布和細胞凋亡情況。

1.11 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 22.0軟件、Graph pad 5.0軟件，數(shù)據(jù)以（）表示；二組計量資料的均數(shù)比較，如果每一組資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性，組間比較采用t檢驗，反之用校正t檢驗或秩和檢驗；多組間計量資料的均數(shù)比較，如果每一組資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性，組間比較采用方差分析，方差分析差異有統(tǒng)計學意義時采用Bonferroni 法進行兩兩比較；二組生存分析使用Log-rankt檢驗。α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CDC25B與β-谷甾醇和肝癌臨床關(guān)系分析

SwissTarget 和TargetNet 預測β-谷甾醇的靶點，共有37 個靶點。37 個靶點與GEO2R 分析GSE101728 肝癌數(shù)據(jù)集所得上調(diào)基因的交集基因有5個，其中包括CDC25B基因（圖1A）。TCGA_LIHC 表達數(shù)據(jù)和臨床信息比對發(fā)現(xiàn)只有CDC25B 的表達水平與肝癌患者總生存期相關(guān)，因此選擇CDC25B 進一步研究。TCGA_LIHC 表達數(shù)據(jù)和臨床對應信息分析顯示CDC25B 在肝癌組織表達水平顯著高于其癌旁組織（t=90.414，P＜0.001；圖1B），肝癌不同TNM 分期（T2-4）的CDC25B 表達水平顯著高于TNM 分期（T1）（F=3635.158，P＜0.001；P＜0.001；圖1C），肝癌臨床分期（Ⅱ-Ⅳ）的CDC25B表達水平顯著高于臨床分期（I）（F=3136.663，P＜0.001；P＜0.001；圖1D），肝癌G3-4 患者的CDC25B表達水平顯著高于G1-2 患者（t=38.728，P＜0.001；圖1E），肝癌復發(fā)患者的CDC25B 表達水平顯著高于未復發(fā)肝癌患者（t=29.710，P＜0.001；圖1F），預后不良肝癌患者的CDC25B 表達水平顯著高于預后良好肝癌患者（t=27.006，P＜0.001；圖1G），以CDC25B 表達水平的中位數(shù)將患者分為CDC25B 低表達組和CDC25B 高表達組，CDC25B 高表達組肝癌患者的總生存率顯著低于CDC25B 低表達組（Log-rankt=7.509，P=0.006；圖1H）。

圖1 CDC25B與β-谷甾醇和肝癌臨床關(guān)系Fig.1 Clinical relationship among CDC25B，β-sitosterol and HCC

2.2 β-谷甾醇對肝癌細胞增殖和凋亡的影響

Hep3B 和HepG2 的細胞活力隨著β-谷甾醇劑量增加而逐漸降低（F=108.400，P＜0.001，圖2A；F=95.180，P＜0.001，圖2B），Hep3B（β-谷甾醇15μmol∕L）和HepG2（β-谷甾醇18μmol∕L）的細胞生存率約為50%，因此選擇此濃度做后續(xù)實驗（圖2A～D）；Hep3B（β-谷甾醇15 μmol∕L）和HepG2（β-谷甾醇18μmol∕L）的相對克隆數(shù)目顯著低于Control 組（t=16.515，P＜0.001；t=22.517，P＜0.001），S 期細胞百分比均顯著低于Control 組（t=4.906，P=0.008；t=4.359，P=0.0125），G0∕G1期細胞百分比高于Control組（t=4.109，P=0.015；t=3.618，P=0.022），細胞凋亡率均高于Control 組（t=23.674，P＜0.001；t=20.577，P＜0.001；圖2E～H）。

圖2 β-谷甾醇對肝癌細胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effects of β-sitosterol on the proliferation and apoptosis of HCC cells

2.3 β-谷甾醇對體內(nèi)移植瘤生長的影響

β -谷甾醇組移植瘤的體積顯著低于Control 組（F=214.114，P＜0.001，圖 3A；t=2.240，P=0.040，圖3B），移植瘤質(zhì)量低于Control 組（t=2.475，P=0.025；圖3C），Ki67 相對表達水平均顯著低于Control 組（t=26.163，P＜0.001；圖3D）。

圖3 β-谷甾醇對體內(nèi)移植瘤生長的影響Fig.3 Effects of β-sitosterol on the growth of xenografted tumors in vivo

2.4 β-谷甾醇對肝癌細胞CDC25B 蛋白表達的影響

Hep3B 和HepG2 細胞中的CDC25B 蛋白水平隨著β-谷甾醇濃度增加而逐漸降低，Hep3B（β-谷甾醇15μmol∕L）和HepG2（β-谷甾醇18μmol∕L）中的CDC25B 蛋白水平均隨著β-谷甾醇作用時間延長而逐漸降低（圖4）。

圖4 β-谷甾醇對肝癌細胞CDC25B蛋白表達的影響Fig.4 Effects of β-sitosterol on the expression of CDC25B protein in HCC cells

2.5 β-谷甾醇通過CDC25B抑制肝癌細胞增殖

β-谷甾醇作用下Hep3B和HepG2細胞CDC25B蛋白表達降低（t=25.351，P＜0.001；t=31.859，P＜0.001；圖5A），給予CDC25穩(wěn)定過表達細胞系可以恢復細胞中CDC25蛋白表達（F=149.686，P＜0.001；F=182.844，P＜0.001；圖5B）。Hep3B細胞的β-谷甾醇+CDC25B組的細胞生長、相對克隆數(shù)目、S期細胞百分比均顯著高于β-谷甾醇組（F=176.247，P＜0.001；F=168.153，P＜0.001；F=25.052，P=0.001），而G0∕G1期細胞百分比、細胞凋亡率均顯著低于β-谷甾醇組（F=15.490，P=0.004；F=222.843，P＜0.001）（圖5C、E、F、H）。HepG2 細胞的β-谷甾醇+CDC25B 組的細胞生長、相對克隆數(shù)目、S期細胞百分比均顯著高于β-谷甾醇組（F=186.723，P＜0.001；F=253.500，P＜0.001；F=18.138，P=0.003），而G0∕G1 期細胞百分比、細胞凋亡率均顯著低于β-谷甾醇組（F=17.138，P=0.003；F=413.382，P＜0.001；圖5D、E、G、H）。

圖5 β-谷甾醇通過CDC25B抑制肝癌細胞增殖Fig.5 β-Sitosterol inhibited the proliferation of HCC cells by CDC25B

3 討論

肝癌的臨床治療方案確定主要依賴于患者的肝功能、腫瘤侵犯程度和轉(zhuǎn)移情況，目前普遍認為手術(shù)切除治療或肝移植治療是可能根治肝癌的重要方式，但術(shù)后復發(fā)和手術(shù)切除率低仍舊是肝癌的治療難點［9］。非手術(shù)治療在控制肝癌病情、輔助術(shù)前和術(shù)后治療具有重要意義，其中包括消融治療、化療、放射治療和分子靶向治療等［10］。β-谷甾醇是植物中廣泛存在的多酚羥酸類化合物，同時也是構(gòu)成真核生物細胞膜的主要成分之一，目前已經(jīng)鑒定植物甾醇約200 種，β-谷甾醇在植物油、種子和果蔬中含量較高，具有抗氧化［11］、抗衰老［12］、降低膽固醇［13］和神經(jīng)保護作用［14］。國外有研究［15］表明β-谷甾醇介導的銀納米粒子在人結(jié)腸癌HT-29 細胞中呈現(xiàn)出細胞毒性作用，可促進結(jié)腸癌細胞發(fā)生凋亡。本研究通過分析β-谷甾醇不同作用濃度和不同作用時間的Hep3B、HepG2 細胞活性和細胞增殖趨勢發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可以顯著抑制肝癌Hep3B 和HepG2細胞增殖，此結(jié)果在裸鼠移植瘤實驗中也得到證實。

腫瘤增殖抑制受到多方面因素影響，其中包括細胞增殖和細胞凋亡［16-17］，本研究結(jié)果顯示β-谷甾醇作用下的Hep3B、HepG2 細胞相對克隆數(shù)目和S期細胞百分比顯著降低，而細胞凋亡率和G0∕G1期細胞百分比顯著升高，同時體內(nèi)移植瘤中的Ki67表達水平顯著降低，說明β-谷甾醇對肝癌細胞抑制作用可能是通過抑制癌細胞增殖和促進癌細胞凋亡實現(xiàn)。細胞增殖速率與細胞周期正常運轉(zhuǎn)具有密切關(guān)系，一個完整的細胞周期包括有絲分裂和分裂間期，分裂間期包括G1 期、S 期和G2 期，任何一個時期出現(xiàn)問題均會影響細胞周期的正常運轉(zhuǎn)［18］。G1 期主要是RNA 和蛋白質(zhì)的合成，S 期是DNA 的復制［19］，Ki67 是與核糖體RNA 轉(zhuǎn)錄有關(guān)的核蛋白，與細胞的有絲分裂具有密切關(guān)系，Ki67 常用于臨床腫瘤惡性程度的判斷，其表達水平越高表示細胞增殖越活躍［20］。本研究結(jié)果說明β-谷甾醇可阻礙使肝癌細胞周期運行，對細胞增殖有抑制作用，關(guān)于β-谷甾醇對肝癌細胞凋亡的促進作用可能與通過核因子相關(guān)因子2、氧化應激激活人肝癌細胞線粒體凋亡有關(guān)［21］。

本研究通過數(shù)據(jù)庫分析顯示CDC25B 是β-谷甾醇靶點之一，還發(fā)現(xiàn)CDC25B 在肝癌組織、高臨床分期、復發(fā)和不良預后患者中呈高表達，并且還會影響患者的生存時間。CDC25B 為半衰期磷酸化蛋白，與細胞分裂有關(guān)的紡錘體前期的形成關(guān)系密切，是細胞早期有絲分裂的啟動因子，目前普遍認為CDC25B 過量表達會促進腫瘤增殖和細胞惡性轉(zhuǎn)化［22-23］。本研究結(jié)果顯示β-谷甾醇可降低Hep3B、HepG2 細胞中CDC25B 表達水平，推測β-谷甾醇對肝癌增殖的抑制作用可能是通過降低CDC25B 表達實現(xiàn)，本研究通過構(gòu)建CDC25B 穩(wěn)定過表達細胞系并給予β-谷甾醇處理，發(fā)現(xiàn)CDC25B表達水平升高可以逆轉(zhuǎn)β-谷甾醇對肝癌細胞增殖抑制作用和促進細胞凋亡作用，說明β-谷甾醇對肝癌細胞的抑癌作用可能與抑制CDC25B 表達有關(guān)。

綜上所述，β-谷甾醇對肝癌細胞的凋亡有促進作用，從體外細胞實驗和體內(nèi)移植瘤實驗證實β-谷甾醇可抑制肝癌細胞的增殖，其作用機制可能是通過抑制CDC25B 蛋白表達使細胞周期運轉(zhuǎn)發(fā)生阻礙，從而抑制肝癌細胞增殖，但β-谷甾醇下調(diào)CDC25B 表達的具體機制尚需進一步探討。本研究主要發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇抑制肝癌細胞增殖的可能作用機制，而關(guān)于其對肝癌細胞凋亡的作用機制尚不清楚。