潘 林， 李亞楠， 張 志， 朱蘊(yùn)蘭

（1. 齊齊哈爾大學(xué)生命與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161005；2. 徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221018）

0 引言

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、降血脂和增強(qiáng)免疫等多種生理活性功能的真菌[1]。樺褐孔菌主要生長(zhǎng)在樺樹(shù)、榆樹(shù)等樹(shù)皮或枯干上，其菌核外表為黑灰色或黃褐色至黑色，表面具有不規(guī)則裂痕，內(nèi)部為黃色，無(wú)柄，質(zhì)地堅(jiān)硬，大小通常在25～40 cm。樺褐孔菌主要分布于俄羅斯、加拿大、日本北海道，以及我國(guó)黑龍江省等地。由于樺褐孔菌生長(zhǎng)在寒冷地區(qū)，生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)量較低，是一種稀少真菌。樺褐孔菌有20 多種化學(xué)成分具有生物活性，主要是樺褐孔菌多糖、三萜、多酚等，其中多酚是樺褐孔菌抗氧化的主要成分之一。有關(guān)樺褐孔菌活性物質(zhì)提取純化方法的研究已有很多。朱金衛(wèi)等[2]對(duì)樺褐孔菌液體發(fā)酵液中多酚和菌絲體中多酚的制備方法進(jìn)行了研究。張梅梅等[3]利用正交試驗(yàn)法優(yōu)化了樺褐孔菌水-乙醇混合體系提取多酚的條件。潘春麗等[4]對(duì)樺褐孔菌三萜化合物提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。胡濤等[5]利用超聲波輔助方法提取樺褐孔菌子實(shí)體中多糖和三萜。徐曇燁等[6]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了樺褐孔菌超聲波輔助提取多糖工藝。王暢[7]和王箴言等[8]研究了樺褐孔菌的抗氧化功能。管玉艷等[9]研究了外源因子對(duì)樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)樺褐孔醇的影響。但利用超聲-微波協(xié)同方法提取樺褐孔菌多酚的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本研究探索用超聲-微波協(xié)同萃取法提取樺褐孔菌多酚的條件，并測(cè)定了多酚的體外抗氧化能力，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)樺褐孔菌資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）購(gòu)買(mǎi)于黑龍江大興安嶺森源山產(chǎn)品有限公司。

1.2 藥品與試劑

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）；乙醇、無(wú)水碳酸鈉、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；福林酚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 儀器

800Y 型高速多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；FA2104N 型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；XO-SM100 型超聲波微波協(xié)同反應(yīng)工作站（南京先歐儀器制造公司）；101-1ES 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取0.5 g 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋到500 mL 容量瓶中，加水定容配制為1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)液。再?gòu)呐渲坪玫脑褐形? mL，加入到100 mL 容量瓶，加蒸餾水定容，得到0.08 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)液。

準(zhǔn)確稱取10 g Na2CO3樣品，加水進(jìn)行稀釋處理，置于100 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到質(zhì)量濃度10%的Na2CO3。

分別吸取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 和8.00 mL 配制好的0.08 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL 容量瓶中，用去離子水補(bǔ)充至8.00 mL，加入3.00 mL 冰箱保存的福林酚試劑，振蕩混勻，在室溫條件下暗處反應(yīng)6～8 min。再在每個(gè)容量瓶加入3 mL 配好的Na2CO3溶液，振蕩使其混合，暗處理30 min。最后，加水定容至25 mL。在750 nm 波長(zhǎng)處，測(cè)定樣品溶液吸光值。記錄不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)的吸光度，以橫坐標(biāo)為樣液濃度，縱坐標(biāo)為吸光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

1.4.2 多酚含量的測(cè)定

將樺褐孔菌菌核破碎成小塊后于40 °C 鼓風(fēng)干燥箱中風(fēng)干，然后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40 目篩子備用。

稱取一定質(zhì)量的樺褐孔菌粉末樣品，加入設(shè)定好的相應(yīng)濃度的乙醇作為提取溶劑，設(shè)定一定料液比、超聲波功率參數(shù)、微波功率參數(shù)，進(jìn)行提取，時(shí)間間隔為10 s，將提取料液進(jìn)行抽濾得到提取液，每個(gè)樣品處理3 次，合并提取液備用。

樣品測(cè)定：取提取液8 mL，然后吸取 1 mol/L Folin-Ciocalteu 溶劑3 mL，滴加至每個(gè)待測(cè)樣中，充分振蕩混勻，在室溫條件下置暗處反應(yīng)6～8 min，然后在每個(gè)待測(cè)液中加入6 mL 配好的Na2CO3溶液，在室溫條件下暗處理30 min，加水定容至100 mL，混勻后在750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程進(jìn)行多酚含量的計(jì)算，再根據(jù)式（1）計(jì)算出不同條件下的提取率。

1.4.3 多酚提取條件的單因素試驗(yàn)

分別稱取2.0 g 干燥后的樣品粉末，測(cè)定不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（v/v）30%、40%、50%、60 %和70%，不同料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 和1∶80，不同微波功率150、200、250、300、350 和400 W，不同超聲波功率70、210、350、560 和700 W，不同提取時(shí)間60、120、180、240 和300 s 情況下多酚提取率。在測(cè)定時(shí)變化一個(gè)條件參數(shù)，其他參數(shù)選定一個(gè)值不變。試驗(yàn)基本參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)50 %、料液比1∶50（g∶mL）、超聲波功率350 W、微波功率350 W、提取時(shí)間120 s。

1.4.4 樺褐孔菌多酚提取工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率、超聲波功率、運(yùn)行時(shí)間這5 個(gè)條件為多因素指標(biāo)，各個(gè)因素指標(biāo)選取4 個(gè)水平，如表1 所示。

表1 因素水平Tab. 1 Factor and level

以相應(yīng)條件下計(jì)算所得出的樣品多酚提取率為指標(biāo)，按L16（45）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取多酚的工藝參數(shù)。

1.4.5 多酚抗氧化活性測(cè)定

（1）多酚對(duì)DPPH 自由基清除能力的測(cè)定。

稱取0.039 4 g DPPH 樣品，加乙醇定容至1 000 mL，配置0.1 mmol/L 的DPPH 溶液。精確吸取2.0 mL 濃度分別為2、4、6、8、10、12 和14 μg/mL 樣品多酚提取液于小試管中，吸取2.0 mL 配制好的0.1 mmol/L 的DPPH 溶液，加入相應(yīng)的待測(cè)組中。搖晃使反應(yīng)混合均勻，暗處理，在室溫條件下反應(yīng)30 min?？瞻讓?duì)照用2.0 mL 蒸餾水加2.0 mL 體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液，測(cè)定樣液在517 nm 波長(zhǎng)處的吸光值，根據(jù)測(cè)定的吸光值以縱坐標(biāo)為多酚對(duì)DPPH 清除率，橫坐標(biāo)為不同濃度參數(shù)做圖，并求回歸方程。按式（2）計(jì)算對(duì)DPPH 自由基的清除率并計(jì)算清除DPPH 的IC50值。

式中R1?DPPH 自由基清除率，%

X?DPPH 溶液加2.0 mL 蒸餾水的吸光度

X1?待測(cè)樣品加2.0 mL DPPH 的吸光度

X2?樣品加2.0 mL 95%乙醇所測(cè)的吸光度

（2）多酚對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定。

稱取質(zhì)量為0.273 6 g 的硫酸鐵，用去離子水進(jìn)行稀釋處理，定容于至100 mL 容量瓶，制成1.8 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液。

吸取1.00 mL 30 %雙氧水溶液，用去離子水進(jìn)行稀釋處理，定容至1 000 mL 容量瓶，制成0.03%雙氧水溶液。

準(zhǔn)確稱取水楊酸樣品0.248 6 g，用無(wú)水乙醇進(jìn)行相應(yīng)稀釋處理，定容至100 mL 容量瓶，搖勻得到1.8 mmol/L水楊酸乙醇溶液。

精確吸取1.0 mL 濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 和l.0 mg/ mL 的多酚提取物于小試管中，分別加入2.0 mL濃度為1.8 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液，1.5 mL 濃度為1.8 mmol/L 配制好的水楊酸樣液，再加入0.1 mL 濃度為0.03%配制好的雙氧水溶液，將混合好的試驗(yàn)樣品放在水浴鍋中，溫度參數(shù)設(shè)定為37 °C，讓樣品反應(yīng)30 min。將待測(cè)液換成去離子水，作為試驗(yàn)的空白對(duì)照，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)其吸光值，按式（3）計(jì)算清除率并計(jì)算清除羥自由基的IC50值。

式中R2?羥基自由基清除率，%

Y?不加相應(yīng)樣品的溶液所測(cè)得的吸光值

Y1?加入待測(cè)樣品反應(yīng)后的吸光值

Y2?加入蒸餾水的試驗(yàn)組所測(cè)出的吸光值

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品與吸光值的線性關(guān)系良好，回歸方程為y=104.34x-0.024 3，R2=0.997 4，多酚提取率為

式中h?提取率，%（g/g）

y?750 nm 處測(cè)得的吸光值

N?稀釋倍數(shù)

m?樺褐孔菌樣品質(zhì)量，g

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樺褐孔菌多酚提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)超聲-微波協(xié)同萃取法提取樺褐孔菌多酚提取率影響的試驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示。當(dāng)提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，樺褐孔菌多酚提取率較低。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚提取率不斷增加。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，多酚的提取率最佳。隨后乙醇體積分?jǐn)?shù)再增加，多酚的提取率卻出現(xiàn)了略微降低。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樺褐孔菌多酚提取率的影響Fig. 1 Effects of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphenols from Inonotus obliquus

2.2.2 料液比對(duì)樺褐孔菌多酚提取率的影響

不同料液比對(duì)超聲-微波協(xié)同萃取法提取樺褐孔菌多酚提取率影響的試驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。當(dāng)料液比增加時(shí)，多酚的提取率增加，在物料與溶劑為1∶60（g∶mL）時(shí)，多酚提取率達(dá)到最高，然后隨著料液比增加，多酚提取率降低。

圖2 料液比對(duì)樺褐孔菌多酚提取率的影響Fig. 2 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphenols from Inonotus obliquus

2.2.3 微波功率對(duì)樺褐孔菌多酚提取率的影響

微波功率對(duì)超聲-微波協(xié)同萃取法提取樺褐孔菌多酚提取率影響的試驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)微波功率由150 W 逐步增大到350 W 時(shí)，多酚的提取率逐漸增加，350 W 時(shí)達(dá)到最大。

圖3 微波功率對(duì)樺褐孔菌多酚提取率的影響Fig. 3 Effect of microwave power on extraction rate of polyphenols from Inonotus obliquus

2.2.4 超聲波功率對(duì)樺褐孔菌多酚提取率的影響

超聲波功率對(duì)超聲-微波協(xié)同萃取法提取樺褐孔菌多酚提取率影響的試驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。使用較低功率的超聲波功率進(jìn)行提取時(shí)，多酚提取率較低。隨著超聲波提取功率的提高，多酚提取率逐漸增加，當(dāng)超聲波功率為350 W 時(shí)，多酚的提取率最高。之后，盡管提高超聲波功率，但是提取率不但沒(méi)有升高，反而逐漸下降。

圖4 超聲波功率對(duì)樺褐孔菌多酚提取率的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polyphenols from Inonotus obliquus

2.2.5 提取時(shí)間對(duì)樺褐孔菌多酚提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)超聲-微波協(xié)同萃取法提取樺褐孔菌多酚提取率影響的試驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示。當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，多酚提取率較低，逐漸延長(zhǎng)提取的時(shí)間，可以看出多酚提取率有所增加，當(dāng)提取時(shí)間為120 s 時(shí)，多酚的提取率最高。之后，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率逐漸下降。

圖5 提取時(shí)間對(duì)樺褐孔菌多酚提取率的影響Fig. 5 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols from Inonotus obliquus

2.3 樺褐孔菌多酚提取條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。正交試驗(yàn)最佳工藝條件組合為A1B2C2D2E2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶60、微波功率300 W、超聲波功率350 W、提取時(shí)間180 s，此條件下所得到的多酚提取率為2.486 %。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 Orthogonal test results

運(yùn)用正交試驗(yàn)中極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由表2 的相關(guān)數(shù)據(jù)可以看出，使用超聲-微波協(xié)同萃取法，進(jìn)行樺褐孔菌多酚成分提取的理論最佳工藝參數(shù)為A2B2C4D2E3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶60、微波功率400 W、超聲波功率350 W、提取時(shí)間240 s。由于試驗(yàn)最佳組合是A1B2C2D2E2，而理論分析最佳組合是A2B2C4D2E3，因此對(duì)理論分析最佳組合進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定得到多酚提取率為2.943 %。

此外，可以得出超聲波功率的極差最大，說(shuō)明超聲波功率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響效果最強(qiáng)。各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響力從大到小排列為D>C>E>B>A。

2.4 多酚抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 多酚對(duì)DPPH 自由基的清除能力

樺褐孔菌多酚對(duì)DPPH 自由基的清除率如圖6 所示，其具有一定的清除DPPH 自由基的能力，并且隨著試驗(yàn)樣品濃度的增加，DPPH 的清除率也增加。經(jīng)測(cè)定，樺褐孔菌多酚對(duì)DPPH 清除率的IC50值為9.03 μg/mL。

圖6 樺褐孔菌多酚對(duì)DPPH 自由基的清除能力Fig. 6 Scavenging activity of polyphenols from Inonotus obliquus on DPPH free radical

2.4.2 多酚對(duì)羥基自由基的清除能力

樺褐孔菌多酚對(duì)羥基自由基的清除率如圖7 所示，其具有一定的清除羥基自由基的能力，并且羥自由基清除率隨著樣品濃度的增加而增加。經(jīng)測(cè)定，樺褐孔菌多酚對(duì)羥自由基清除率的IC50值為2.03 mg/mL。

圖7 樺褐孔菌多酚對(duì)羥自由基的清除能力Fig. 7 Scavenging ability of polyphenols from Inonotus obliquus on hydroxyl radical

3 結(jié)論

（1）樺褐孔菌多酚的最佳超聲?微波協(xié)同萃取法提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)50 %、料液比1∶60、微波功率400 W、超聲波功率350 W、提取時(shí)間240 s，此時(shí)的樺褐孔菌多酚提取率最高為2.943%。

（2）超聲?微波協(xié)同萃取法獲得的樺褐孔菌多酚對(duì)DPPH 和羥自由基都有一定的清除能力，但樺褐孔菌多酚對(duì)DPPH 自由基的清除能力要好于羥基自由基。

（3）超聲?微波協(xié)同萃取法可以有效提取樺褐孔菌多酚，且多酚的抗氧化活性未被破壞，超聲-微波協(xié)同方法是一種實(shí)用、有效、快速的提取樺褐孔菌多酚的方法。