文靜，李 智，張建武，吳小橋，朱澤超，徐海薏，牛 娜

（1.川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637100；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637100）

壁虎為壁虎科動(dòng)物無(wú)蹼壁虎Gekko swinhonis Guenther、多疣壁虎Gekko japonicus Dumeril et Bibron或蹼趾壁虎Gekko subpalmatus Guenther的干燥全體，別名守宮，其性寒、味咸，有小毒，入肝經(jīng)，具有祛風(fēng)定驚、散結(jié)解毒等功效[1]。古代醫(yī)學(xué)典籍中關(guān)于守宮的記載有很多，最早見于《本草綱目》[2]，主治“中風(fēng)癱瘓，手足不舉，或歷節(jié)風(fēng)痛，及風(fēng)驚癇，小兒疳痢，血積瘰，療蝎螫”；清·趙其光在《本草求原》中提到守宮入血分，可治血病，有滋陰降痰之功[3]；《四川中藥志》稱其能“驅(qū)風(fēng)、破血積包塊，治腫瘤”[4]。現(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)，守宮可治療乳癖、抗腫瘤[5-6]。守宮主要含有多肽類、核苷類和多糖類等成分?，F(xiàn)代藥理研究顯示，其具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化，抑制肝癌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[7]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，分子生物學(xué)研究領(lǐng)域不斷拓展，已有研究證實(shí)多糖類成分在抗癌、抗腫瘤及提高機(jī)體免疫力等方面發(fā)揮著重要作用。閆祝辰等[8]研究發(fā)現(xiàn)，守宮多糖可增強(qiáng)肝癌抗原活化的淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)淋巴細(xì)胞對(duì)肝癌的殺傷作用。巴一等[9]發(fā)現(xiàn)從守宮中提取分離出的守宮硫酸多糖可誘導(dǎo)人肝癌BEL-7402細(xì)胞凋亡。黃卉等[10]研究復(fù)方金龍膠囊（守宮為君藥）治療腦腫瘤的藥理機(jī)制，認(rèn)為守宮與金錢白花蛇、蘄蛇合用可干預(yù)多基因、多通路、多環(huán)節(jié)，發(fā)揮抗腦腫瘤的作用?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》中尚未收載守宮含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用苯酚-濃硫酸顯色法對(duì)其多糖類成分進(jìn)行測(cè)定。

1 研究材料

1.1 儀器與試劑 儀器:粉碎機(jī)（上?；垠w設(shè)備有限公司），Multiskan Skyhigh紫外分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司），RE5000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州英峪領(lǐng)科儀器設(shè)備有限公司），Secura-1CN電子分析天平（瑞士賽多利斯），LD4-2A離心機(jī)（湖南湘儀儀器有限公司）。試劑:葡萄糖（默克公司，貨號(hào)Y0001745，供含量測(cè)定用），濃硫酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度98.08%，批號(hào):20180507），苯酚（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào):P100765），無(wú)水乙醇（Sigma-Aldrich，含醇度≥99.5%，產(chǎn)品號(hào):459836），蒸餾水（MILL-Q純水儀制備）。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品 3種守宮均購(gòu)買于四川荷花池中藥材市場(chǎng)，分別來(lái)源于河北承德（生產(chǎn)批號(hào):A20200123），遼寧本溪（生產(chǎn)批號(hào):20200514），北京密云（生產(chǎn)批號(hào):20200328）。守宮購(gòu)回后用粉碎機(jī)粉碎后過篩（80目篩），密封，置于干燥處－20℃保存。

2 研究方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備 取于105℃環(huán)境下干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品約12.50 mg，精密稱定，置于50 m L量瓶中，加水溶解并稀釋至50 m L，搖勻，得到濃度為0.25 mg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 m L，置于25 m L量瓶中，并加水稀釋并定容至25 m L，分別得 到 系 列濃度為10.00、15.00、20.00、25.00、30.00、35.00μg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 守宮供試品溶液的制備 ①準(zhǔn)確稱取守宮樣品25 mg，置于25 m L的量瓶中，加水搖勻定容至25 mL，搖勻；溫室超聲（400 W）30 min，取濾液5 mL，3 500 r/min離心10 min，取上清液；將上述溶液稀釋5倍，即得守宮總糖供試品溶液。②準(zhǔn)確稱取守宮樣品400 mg，置于100 m L錐形瓶中，加入水20 m L，再加入無(wú)水乙醇（含醇量達(dá)85%），靜置過夜；3 500 r/min離心5 min；精密吸取上清液，55℃旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)盟芙?，并轉(zhuǎn)移至25 m L量瓶中，加水定容至25 m L，將上述樣品稀釋50倍，即得守宮游離糖供試品溶液。

2.3 苯酚-濃硫酸顯色反應(yīng) 精密吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、守宮供試品溶液各2 m L，分別置于20 m L具塞玻璃試管中，再分別加入5%苯酚溶液1 m L，混勻，再迅速加入濃硫酸7 m L，搖勻，于40℃水浴中保溫30 min，取出，立即置于冰水中5 min，待恢復(fù)至室溫，以水為隨行空白，于490 nm處測(cè)定吸光度。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 確定最大吸收波長(zhǎng) 分別對(duì)經(jīng)苯酚-濃硫酸顯色的葡萄糖對(duì)照品溶液（25.00μg/m L）和守宮總糖供試品溶液在220～800 nm進(jìn)行光譜掃描，最終確定最大吸收波長(zhǎng)為490 nm。

3.2 線性關(guān)系 選取2.5 m L水顯色后的溶液作為空白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。線性回歸方程:Y＝0.013 8X＋0.016 4，R2＝0.994 5，線性范圍10.00～35.00μg/m L。

3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取守宮供試品溶液2 mL，重復(fù)測(cè)定吸光度6次，結(jié)果分別為13.54、13.54、13.54、13.41、13.39、13.41，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.55%，表明儀器精密度良好。

3.4 守宮總糖、游離糖供試品溶液穩(wěn)定性 分別精密吸取守宮總糖、游離糖供試品溶液各2 m L，分別經(jīng)苯酚-濃硫酸顯色后測(cè)定放置0、2、4、6、8、10 h的吸光度，總糖供試品溶液的RSD為1.15%，游離糖供試品溶液的RSD為2.46%，提示兩種供試品溶液在0～10 h的穩(wěn)定性均良好。見表1。

表1 守宮總糖、游離糖供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

3.5.1 總糖樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱取守宮樣品6份，每份約25 mg，置于25 mL量瓶中，加水適量使其溶解，再加水定容至刻度，搖勻，3 500 r/min，離心10 min，取上清液；再將守宮上清液稀釋5倍，即得總糖供試品溶液。6份總糖供試品溶液各精密吸取2 mL，RSD為0.48%，表明重復(fù)性良好。

3.5.2 游離糖樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱取守宮凍干粉6份，各約400 mg，分別置于100 m L錐形瓶中，加水20 m L溶解，再加入無(wú)水乙醇，使其含醇量達(dá)到85%，靜置過夜，3 500 r/min離心10 min，取上清液，55℃旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)盟芙?，轉(zhuǎn)移至25 m L量瓶中，并定容至刻度，再將上述樣品稀釋50倍，即得游離糖供試品溶液。6份游離糖供試品溶液各精密吸取2 m L，RSD為2.10%，表明重復(fù)性良好。

3.6 加樣回收實(shí)驗(yàn)

3.6.1 守宮總糖加樣回收實(shí)驗(yàn) 取30.00μg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液4 400μL加水稀釋至10 mL，得葡萄糖對(duì)照品溶液13.20μg/m L。分別稱取守宮樣品6份，每份約25 mg，分別置于25 m L量瓶中，加水適量使溶解，再加水定容至25 mL，搖勻，3 500 r/min離心10 min，取上清液。精密吸取1 mL上清液，置于5 mL量瓶中，各加入1 m L葡萄糖對(duì)照品溶液（13.20μg/m L），定容至刻度，搖勻。苯酚-濃硫酸顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量?；厥章剩剑悠泛浚珜?duì)照品加入量）/測(cè)得量×100%。結(jié)果顯示，總糖平均回收率為100.38%，RSD＝1.60%。見表2。

表2 守宮總糖加樣回收實(shí)驗(yàn)

3.6.2 守宮游離糖加樣回收實(shí)驗(yàn) 取30.00μg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液3 500μL加水稀釋至10 m L，得葡萄糖對(duì)照品溶液10.50μg/mL。分別稱取守宮樣品6份，各400 mg，分別置于100 m L錐形瓶中，加水20 m L溶解，再加入無(wú)水乙醇，靜置過夜，3 500 r/min離心10 min，取上清液，蒸干，殘?jiān)盟芙猓D(zhuǎn)移至25 m L量瓶中，并定容至25 m L；精密吸取1 m L續(xù)濾液，置于50 m L量瓶中，各加入1 m L葡萄糖對(duì)照品溶液（10.50μg/m L），定容至刻度，搖勻。苯酚-濃硫酸顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量。結(jié)果顯示，游離糖平均回收率為100.16%，RSD＝2.34%。見表3。

表3 守宮游離糖加樣回收實(shí)驗(yàn)

3.7 守宮樣品多糖含量測(cè)定 利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定3個(gè)批次的守宮樣品的多糖含量，每個(gè)批次重復(fù)3次，多糖含量百分率＝（總糖百分含量－游離糖百分含量）×100%。不同產(chǎn)地守宮中多糖含量差異，其中由高到低依次為北京密云含量為6.363%、遼寧本溪含量為4.584%、河北承德含量為3.501%。見表4。

表4 守宮樣品多糖含量測(cè)定結(jié)果(%)

4 討論

守宮作為傳統(tǒng)的中藥，具有祛風(fēng)、活絡(luò)、散結(jié)、解毒功效，可用于治療中風(fēng)偏癱、關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)濕痛及惡性腫瘤（如食管癌、胃癌、肝癌、肺癌）的治療。守宮中多糖類成分是其主要抗腫瘤的活性成分之一[5，7]，但《中華人民共和國(guó)藥典》并未設(shè)立守宮含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。多糖含量測(cè)量方法通常分為兩大類，一類是多糖含量直接測(cè)定法，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3，5-二硝基水楊酸（DNS）法等；另一類是多糖含量間接測(cè)定法，如高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、離子色譜法（IC）等，此類方法操作煩瑣，對(duì)樣品處理和要求高，不適合快速檢測(cè)，對(duì)多數(shù)中藥多糖也不適宜。目前，多糖的含量測(cè)定多采用紫外分光光度法，該方法操作較簡(jiǎn)單迅速，且準(zhǔn)確度高，適合大量檢測(cè)，能更好滿足現(xiàn)階段要求，但不同的中藥多糖有其適合的含量測(cè)定方法，其中苯酚-濃硫酸法是使用最多的。故本文采用苯酚-濃硫酸法建立守宮多糖的測(cè)定，并用該方法測(cè)定不同產(chǎn)地守宮中多糖含量，可為守宮后續(xù)研究提供參考。