文靜,李 智,張建武,吳小橋,朱澤超,徐海薏,牛 娜
(1.川北醫(yī)學(xué)院,四川 南充 637100;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,四川 南充 637100)
壁虎為壁虎科動(dòng)物無(wú)蹼壁虎Gekko swinhonis Guenther、多疣壁虎Gekko japonicus Dumeril et Bibron或蹼趾壁虎Gekko subpalmatus Guenther的干燥全體,別名守宮,其性寒、味咸,有小毒,入肝經(jīng),具有祛風(fēng)定驚、散結(jié)解毒等功效[1]。古代醫(yī)學(xué)典籍中關(guān)于守宮的記載有很多,最早見于《本草綱目》[2],主治“中風(fēng)癱瘓,手足不舉,或歷節(jié)風(fēng)痛,及風(fēng)驚癇,小兒疳痢,血積瘰,療蝎螫”;清·趙其光在《本草求原》中提到守宮入血分,可治血病,有滋陰降痰之功[3];《四川中藥志》稱其能“驅(qū)風(fēng)、破血積包塊,治腫瘤”[4]。現(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn),守宮可治療乳癖、抗腫瘤[5-6]。守宮主要含有多肽類、核苷類和多糖類等成分?,F(xiàn)代藥理研究顯示,其具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化,抑制肝癌細(xì)胞增殖,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力,抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[7]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,分子生物學(xué)研究領(lǐng)域不斷拓展,已有研究證實(shí)多糖類成分在抗癌、抗腫瘤及提高機(jī)體免疫力等方面發(fā)揮著重要作用。閆祝辰等[8]研究發(fā)現(xiàn),守宮多糖可增強(qiáng)肝癌抗原活化的淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,促進(jìn)淋巴細(xì)胞對(duì)肝癌的殺傷作用。巴一等[9]發(fā)現(xiàn)從守宮中提取分離出的守宮硫酸多糖可誘導(dǎo)人肝癌BEL-7402細(xì)胞凋亡。黃卉等[10]研究復(fù)方金龍膠囊(守宮為君藥)治療腦腫瘤的藥理機(jī)制,認(rèn)為守宮與金錢白花蛇、蘄蛇合用可干預(yù)多基因、多通路、多環(huán)節(jié),發(fā)揮抗腦腫瘤的作用?!吨腥A人民共和國(guó)藥典》中尚未收載守宮含量測(cè)定方法,為進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),本研究采用苯酚-濃硫酸顯色法對(duì)其多糖類成分進(jìn)行測(cè)定。
1.1 儀器與試劑 儀器:粉碎機(jī)(上?;垠w設(shè)備有限公司),Multiskan Skyhigh紫外分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技公司),RE5000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州英峪領(lǐng)科儀器設(shè)備有限公司),Secura-1CN電子分析天平(瑞士賽多利斯),LD4-2A離心機(jī)(湖南湘儀儀器有限公司)。試劑:葡萄糖(默克公司,貨號(hào)Y0001745,供含量測(cè)定用),濃硫酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,純度98.08%,批號(hào):20180507),苯酚(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號(hào):P100765),無(wú)水乙醇(Sigma-Aldrich,含醇度≥99.5%,產(chǎn)品號(hào):459836),蒸餾水(MILL-Q純水儀制備)。
1.2 實(shí)驗(yàn)樣品 3種守宮均購(gòu)買于四川荷花池中藥材市場(chǎng),分別來(lái)源于河北承德(生產(chǎn)批號(hào):A20200123),遼寧本溪(生產(chǎn)批號(hào):20200514),北京密云(生產(chǎn)批號(hào):20200328)。守宮購(gòu)回后用粉碎機(jī)粉碎后過篩(80目篩),密封,置于干燥處-20℃保存。
2.1 對(duì)照品溶液的制備 取于105℃環(huán)境下干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品約12.50 mg,精密稱定,置于50 m L量瓶中,加水溶解并稀釋至50 m L,搖勻,得到濃度為0.25 mg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 m L,置于25 m L量瓶中,并加水稀釋并定容至25 m L,分別得 到 系 列濃度為10.00、15.00、20.00、25.00、30.00、35.00μg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.2 守宮供試品溶液的制備 ①準(zhǔn)確稱取守宮樣品25 mg,置于25 m L的量瓶中,加水搖勻定容至25 mL,搖勻;溫室超聲(400 W)30 min,取濾液5 mL,3 500 r/min離心10 min,取上清液;將上述溶液稀釋5倍,即得守宮總糖供試品溶液。②準(zhǔn)確稱取守宮樣品400 mg,置于100 m L錐形瓶中,加入水20 m L,再加入無(wú)水乙醇(含醇量達(dá)85%),靜置過夜;3 500 r/min離心5 min;精密吸取上清液,55℃旋轉(zhuǎn)蒸干,殘?jiān)盟芙?,并轉(zhuǎn)移至25 m L量瓶中,加水定容至25 m L,將上述樣品稀釋50倍,即得守宮游離糖供試品溶液。
2.3 苯酚-濃硫酸顯色反應(yīng) 精密吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、守宮供試品溶液各2 m L,分別置于20 m L具塞玻璃試管中,再分別加入5%苯酚溶液1 m L,混勻,再迅速加入濃硫酸7 m L,搖勻,于40℃水浴中保溫30 min,取出,立即置于冰水中5 min,待恢復(fù)至室溫,以水為隨行空白,于490 nm處測(cè)定吸光度。
3.1 確定最大吸收波長(zhǎng) 分別對(duì)經(jīng)苯酚-濃硫酸顯色的葡萄糖對(duì)照品溶液(25.00μg/m L)和守宮總糖供試品溶液在220~800 nm進(jìn)行光譜掃描,最終確定最大吸收波長(zhǎng)為490 nm。
3.2 線性關(guān)系 選取2.5 m L水顯色后的溶液作為空白,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。線性回歸方程:Y=0.013 8X+0.016 4,R2=0.994 5,線性范圍10.00~35.00μg/m L。
3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取守宮供試品溶液2 mL,重復(fù)測(cè)定吸光度6次,結(jié)果分別為13.54、13.54、13.54、13.41、13.39、13.41,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.55%,表明儀器精密度良好。
3.4 守宮總糖、游離糖供試品溶液穩(wěn)定性 分別精密吸取守宮總糖、游離糖供試品溶液各2 m L,分別經(jīng)苯酚-濃硫酸顯色后測(cè)定放置0、2、4、6、8、10 h的吸光度,總糖供試品溶液的RSD為1.15%,游離糖供試品溶液的RSD為2.46%,提示兩種供試品溶液在0~10 h的穩(wěn)定性均良好。見表1。
表1 守宮總糖、游離糖供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
3.5.1 總糖樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱取守宮樣品6份,每份約25 mg,置于25 mL量瓶中,加水適量使其溶解,再加水定容至刻度,搖勻,3 500 r/min,離心10 min,取上清液;再將守宮上清液稀釋5倍,即得總糖供試品溶液。6份總糖供試品溶液各精密吸取2 mL,RSD為0.48%,表明重復(fù)性良好。
3.5.2 游離糖樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱取守宮凍干粉6份,各約400 mg,分別置于100 m L錐形瓶中,加水20 m L溶解,再加入無(wú)水乙醇,使其含醇量達(dá)到85%,靜置過夜,3 500 r/min離心10 min,取上清液,55℃旋轉(zhuǎn)蒸干,殘?jiān)盟芙?,轉(zhuǎn)移至25 m L量瓶中,并定容至刻度,再將上述樣品稀釋50倍,即得游離糖供試品溶液。6份游離糖供試品溶液各精密吸取2 m L,RSD為2.10%,表明重復(fù)性良好。
3.6 加樣回收實(shí)驗(yàn)
3.6.1 守宮總糖加樣回收實(shí)驗(yàn) 取30.00μg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液4 400μL加水稀釋至10 mL,得葡萄糖對(duì)照品溶液13.20μg/m L。分別稱取守宮樣品6份,每份約25 mg,分別置于25 m L量瓶中,加水適量使溶解,再加水定容至25 mL,搖勻,3 500 r/min離心10 min,取上清液。精密吸取1 mL上清液,置于5 mL量瓶中,各加入1 m L葡萄糖對(duì)照品溶液(13.20μg/m L),定容至刻度,搖勻。苯酚-濃硫酸顯色后測(cè)定吸光度,計(jì)算多糖含量?;厥章剩剑悠泛浚珜?duì)照品加入量)/測(cè)得量×100%。結(jié)果顯示,總糖平均回收率為100.38%,RSD=1.60%。見表2。
表2 守宮總糖加樣回收實(shí)驗(yàn)
3.6.2 守宮游離糖加樣回收實(shí)驗(yàn) 取30.00μg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液3 500μL加水稀釋至10 m L,得葡萄糖對(duì)照品溶液10.50μg/mL。分別稱取守宮樣品6份,各400 mg,分別置于100 m L錐形瓶中,加水20 m L溶解,再加入無(wú)水乙醇,靜置過夜,3 500 r/min離心10 min,取上清液,蒸干,殘?jiān)盟芙猓D(zhuǎn)移至25 m L量瓶中,并定容至25 m L;精密吸取1 m L續(xù)濾液,置于50 m L量瓶中,各加入1 m L葡萄糖對(duì)照品溶液(10.50μg/m L),定容至刻度,搖勻。苯酚-濃硫酸顯色后測(cè)定吸光度,計(jì)算多糖含量。結(jié)果顯示,游離糖平均回收率為100.16%,RSD=2.34%。見表3。
表3 守宮游離糖加樣回收實(shí)驗(yàn)
3.7 守宮樣品多糖含量測(cè)定 利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定3個(gè)批次的守宮樣品的多糖含量,每個(gè)批次重復(fù)3次,多糖含量百分率=(總糖百分含量-游離糖百分含量)×100%。不同產(chǎn)地守宮中多糖含量差異,其中由高到低依次為北京密云含量為6.363%、遼寧本溪含量為4.584%、河北承德含量為3.501%。見表4。
表4 守宮樣品多糖含量測(cè)定結(jié)果(%)
守宮作為傳統(tǒng)的中藥,具有祛風(fēng)、活絡(luò)、散結(jié)、解毒功效,可用于治療中風(fēng)偏癱、關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)濕痛及惡性腫瘤(如食管癌、胃癌、肝癌、肺癌)的治療。守宮中多糖類成分是其主要抗腫瘤的活性成分之一[5,7],但《中華人民共和國(guó)藥典》并未設(shè)立守宮含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。多糖含量測(cè)量方法通常分為兩大類,一類是多糖含量直接測(cè)定法,如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸(DNS)法等;另一類是多糖含量間接測(cè)定法,如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、離子色譜法(IC)等,此類方法操作煩瑣,對(duì)樣品處理和要求高,不適合快速檢測(cè),對(duì)多數(shù)中藥多糖也不適宜。目前,多糖的含量測(cè)定多采用紫外分光光度法,該方法操作較簡(jiǎn)單迅速,且準(zhǔn)確度高,適合大量檢測(cè),能更好滿足現(xiàn)階段要求,但不同的中藥多糖有其適合的含量測(cè)定方法,其中苯酚-濃硫酸法是使用最多的。故本文采用苯酚-濃硫酸法建立守宮多糖的測(cè)定,并用該方法測(cè)定不同產(chǎn)地守宮中多糖含量,可為守宮后續(xù)研究提供參考。