胡佳瑤，王悟敏，匡雪韶，劉文勝

（中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 湖南 長沙 410004）

鎘(Cd)是生物毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一，具有毒性持久、遷移性強(qiáng)和化學(xué)活性強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。目前，我國鎘污染土壤面積已達(dá)20 萬km2，涉及國內(nèi)11 個(gè)省市，部分地區(qū)鎘污染十分嚴(yán)重[2]。造成鎘污染的主要原因有化石燃料燃燒、垃圾填埋場滲濾液和磷肥過量使用等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，鎘在土壤中很難被消除，能通過食物鏈嚴(yán)重危害人類健康[4]。因而，土壤鎘污染問題急需解決。植物修復(fù)技術(shù)成本低、適應(yīng)范圍廣、環(huán)境擾動(dòng)小、治理效果持久，受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，篩選合適治理鎘污染土壤的植物，尤其是超富集植物是植物修復(fù)技術(shù)的關(guān)鍵[5]。

種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生長發(fā)育過程中最脆弱的時(shí)期，該階段的適應(yīng)性最能夠體現(xiàn)植物對(duì)逆境的耐受性。植物在受到重金屬脅迫時(shí)，種子萌發(fā)、幼苗生長狀況是對(duì)環(huán)境適應(yīng)的綜合反應(yīng)。同時(shí)，植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性等都會(huì)發(fā)生變化來緩解脅迫所帶來的毒害，但當(dāng)脅迫程度過高時(shí)，滲透調(diào)節(jié)機(jī)制和抗氧化酶促系統(tǒng)遭到破壞，造成植物細(xì)胞膜脂過氧化。丙二醛是植物受到外界不良環(huán)境脅迫時(shí)細(xì)胞膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量的多少可用來反映植物被毒害的程度[6]。

青葙(Celosia argentea)是莧科青葙屬的一年生草本植物，具有生物量大、適應(yīng)性強(qiáng)、觀賞價(jià)值高等特點(diǎn)。同時(shí)，該植物也是鎘的超富集植物[7]，對(duì)鎘有著極強(qiáng)的耐受和富集能力[8]，此外，青葙還對(duì)錳[9]、銅[10]有較強(qiáng)的耐受能力，可作為鎘嚴(yán)重污染地區(qū)修復(fù)重要的候選植物。目前，對(duì)青葙的研究主要集中在景觀價(jià)值、耐受性等方面，但鎘對(duì)青葙種子萌發(fā)及幼苗生長這一生活史重要階段的研究尚未見報(bào)道。

本研究以超富集植物青葙為研究對(duì)象，在不同鎘濃度脅迫下，研究種子的萌發(fā)特性和幼苗的生理特征，探究其在鎘脅迫下的生理耐受機(jī)制，研究結(jié)果可為土壤鎘污染的植物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用青葙種子于2020 年7 月采于湘江堤上(28°45′51.54″N，112°49′44.90″E)?，F(xiàn)場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，青葙平均高度1.2 m，在此地自然生長，人為干擾小，分布面積較大，在江邊形成了一道美麗的景觀。該植物結(jié)實(shí)量大，隨機(jī)選擇50 株長勢(shì)良好的青葙，采集種子并置于信封帶回實(shí)驗(yàn)室室溫保存?zhèn)溆?。青葙種子扁圓形，黑色有光澤，直徑約1.5 mm，千粒重為0.5739 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)試驗(yàn)

種子用0.2% KMnO4消毒10 min，用去離子水徹底清洗干凈后置于放有兩層濾紙、直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿25 粒種子。綜合參照Azizi 等[11]和偶春等[12]的方法，利用CdCl2分別設(shè)置0 (對(duì)照)、50、100、200、500 μmol·L?15 個(gè)鎘濃度，每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)。青葙種子萌發(fā)試驗(yàn)在人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度為(26 ± 0.5) ℃，相對(duì)濕度為70%，12 h 光照/ 12 h 黑暗，光照強(qiáng)度為200 μmol·(m2·s)?1。以青葙種子胚根達(dá)到種子直徑1/2 為萌發(fā)，每天定時(shí)記錄種子萌發(fā)數(shù)并加入去離子水保持濕潤，連續(xù)統(tǒng)計(jì)青葙種子萌發(fā)情況直至連續(xù)3 d 無新種子萌發(fā)。根據(jù)所得萌發(fā)數(shù)據(jù)計(jì)算青葙種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。青葙種子萌發(fā)結(jié)束后測(cè)定青葙幼苗的根長、芽長、鮮重、干重。

1.2.2 幼苗生長試驗(yàn)

采用盆栽沙培法進(jìn)行青葙幼苗生長試驗(yàn)，將與萌發(fā)試驗(yàn)同批青葙種子放入裝有200 mL 過2 mm篩潔凈沙子的盆缽中，每盆10 粒種子。試驗(yàn)在與青葙種子萌發(fā)試驗(yàn)相同條件的人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行，每天加入去離子水保持培養(yǎng)基質(zhì)濕潤。青葙幼苗長出2～4 片真葉時(shí)用Hoagland 營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。待青葙幼苗長出6～8 片真葉時(shí)用CdCl2進(jìn)行鎘脅迫，鎘濃度設(shè)置與萌發(fā)試驗(yàn)相同，每個(gè)處理10 個(gè)重復(fù)。脅迫15 d 時(shí)采用青葙幼苗中、上部位葉片進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定

青葙種子萌發(fā)指標(biāo)的測(cè)定參考潘高等[13]的方法：

式中：Gt為在t日的發(fā)芽種子數(shù)；Dt為發(fā)芽天數(shù)；S為幼苗高度。

1.3.2 幼苗生物量指標(biāo)測(cè)定

于萌發(fā)第16 天每個(gè)濃度處理隨機(jī)選10 株幼苗，用精度為0.1 mm 的游標(biāo)卡尺測(cè)定幼苗的根長、芽長；用濾紙吸去幼苗表面的水分，用解剖刀分成地上部分和地下部分，采用萬分之一電子天平稱鮮重后于95 ℃殺青10 min，70 ℃下烘至恒重，計(jì)算根冠比[14]：

根冠比=地下部分干重/地上部分干重。

1.3.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定

丙酮浸提法測(cè)光合色素含量，氮藍(lán)四唑法測(cè)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性，愈創(chuàng)木酚法測(cè)過氧化物酶(peroxidase, POD)活性，紫外吸收法測(cè)定過氧化氫酶(catalase, CAT)活性，蒽酮比色法測(cè)可溶性糖含量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)可溶性蛋白含量，酸性茚三酮顯色法測(cè)游離脯氨酸含量，硫代巴比妥酸法測(cè)丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0 進(jìn)行單因素方差分析，并利用最小顯著差數(shù)法進(jìn)行多重比較，結(jié)果均以“平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用SigmaPlot 12.5 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)及幼苗生長

種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生命周期中最關(guān)鍵的階段[16]。青葙種子發(fā)芽率隨鎘濃度升高基本無變化(P＞ 0.05)，發(fā)芽勢(shì)在500 μmol·L?1時(shí)達(dá)峰值，為78.0%(表1)。發(fā)芽指數(shù)先升高再降低后又升高，各處理發(fā)芽指數(shù)較對(duì)照分別減少了14.47%、6.43%、17.68%和2.25%，活力指數(shù)隨鎘濃度的升高而顯著下降 (P＜0.05)，分別減少了13.74%、12.64%、32.14%和58.24%，在500 μmol·L?1鎘處理時(shí)降到最低。

表1 鎘脅迫對(duì)青葙種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of cadmium stress on Celosia argentea seed germination

幼苗生長是植物對(duì)逆境脅迫適應(yīng)的綜合體現(xiàn)。青葙幼苗的根長隨鎘濃度的升高顯著下降(P＜ 0.05)，芽長、根干重和根冠比整體也呈下降趨勢(shì)，芽干重和干重則先升高后降低(表2)。各處理芽長較對(duì)照分別增加了0.85%、下降了6.84%、17.95%和57.26%，根長分別下降了62.43%、84.97%、87.86%和93.93%，干重分別下降了34.29%、5.71%、74.29%和74.29%，根冠比分別下降了50.00%、52.50%、66.25%和71.25%。干重在200 和500 μmol·L?1時(shí)均降到最低，為0.09 mg，芽長、根長及根冠比均在500 μmol·L?1時(shí)降到最低，分別為0.50 cm、0.21 cm、0.23。

表2 鎘脅迫對(duì)青葙幼苗生長的影響Table 2 Effects of cadmium stress on Celosia argentea seedling growth

2.2 光合色素

植物葉片葉綠素的含量能反映植物光合作用能力強(qiáng)弱。葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量隨鎘濃度的增加而顯著下降(P＜ 0.05)，葉綠素a 含量相較于對(duì)照分別下降了13.67%、18.71%、20.14%和24.46%，葉綠素b 含量分別下降了16.67%、23.81%、28.57%和26.19%，類胡蘿卜素含量分別下降了13.04%、17.39%、15.22%和21.74% (表3)。葉綠素a 和類胡蘿卜素含量 均 在500 μmol·L?1時(shí) 降 到 最 低，分 別 為1.05 和0.36 mg·g?1。

表3 鎘脅迫對(duì)青葙幼苗光合色素的影響Table 3 Effects of cadmium stress on the photosynthetic pigment content of Celosia argentea seedlings

2.3 抗氧化酶活性

植物在受到脅迫時(shí)會(huì)形成一個(gè)抗氧化系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)來清除活性氧并避免被氧化損傷，控制植物的抗氧化酶系統(tǒng)主要由SOD、POD、CAT 協(xié)同構(gòu)成[17]。青葙幼苗葉片的SOD、POD 和CAT 活性隨著鎘濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖1)，SOD 和POD活性均在100 μmol·L?1鎘濃度處理時(shí)達(dá)到峰值，分別為702.35 和324.67 U·g?1，相較于對(duì)照分別顯著增加了23.98%和53.87% (P＜ 0.05)。CAT 活性在200 μmol·L?1鎘濃度處理時(shí)達(dá)到峰值，為715.00 U·(g·min)?1，相較于對(duì)照顯著增加了60.97% (P＜ 0.05)。SOD 和CAT 活性在500 μmol·L?1鎘濃度處理相較于對(duì)照分別顯著增加了8.45%和34.90% (P＜ 0.05)，POD 活性在500 μmol·L?1鎘濃度處理相較于對(duì)照增加了29.23%。

圖1 鎘脅迫下青葙葉片SOD、POD 和CAT 活性Figure 1 SOD, POD, and CAT activities of Celosia argentea leaves under cadmium stress

2.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量

植物能通過積累各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸，用于生理代謝，以克服外界脅迫所帶來的危害[18]?？扇苄蕴呛侩S鎘濃度的升高而逐漸升高，在500 μmol·L?1鎘濃度處理時(shí) 達(dá) 到 峰 值4.65 mg·g?1，相 較 于 對(duì) 照 顯 著 增 加 了95.38% (P＜ 0.05) (圖2)。隨鎘濃度的升高，可溶性蛋白含量總體上升，在100 μmol·L?1鎘濃度處理時(shí)達(dá)到最大值，為13.53 mg·g?1，相較于對(duì)照顯著增加了144.67% (P＜ 0.05)。游離脯氨酸含量隨鎘濃度的升高呈先增加后下降的趨勢(shì)，在100 μmol·L?1鎘濃度處理時(shí)達(dá)到最大值，為12.08 mg·g?1，相較于對(duì)照顯著增加了45.89% (P＜ 0.05)。

圖2 脅迫下青葙葉片的可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量Figure 2 Soluble sugar, soluble protein, and free proline contents of Celosia argentea leaves under cadmium stress

2.5 丙二醛含量

青葙幼苗葉片丙二醛含量隨著鎘濃度的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在500 μmol·L?1時(shí)鎘濃度處理處達(dá)到峰值，為8.15 nmol·g?1，相較于對(duì)照顯著增加了73.99% (P＜ 0.05) (圖3)。

圖3 鎘脅迫下青葙葉片丙二醛含量Figure 3 Malondialdehyde content of Celosia argentea leaves under cadmium stress

3 討論

3.1 種子萌發(fā)及幼苗生長

植物種子萌發(fā)與幼苗生長是最能體現(xiàn)植物對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力的時(shí)期。本研究中，鎘脅迫對(duì)青葙種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)的影響較小，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)整體隨鎘濃度的升高而下降。這與鎘脅迫對(duì)靡子(Panicum miliaceum)[19]和玉米(Zea mays)的影響研究[20]結(jié)果一致。說明高濃度的鎘脅迫對(duì)青葙種子萌發(fā)的影響較小，其原因可能是青葙種子萌發(fā)主要靠種子內(nèi)部提供營養(yǎng)物質(zhì)，而對(duì)外界物質(zhì)的利用較少。

青葙幼苗根長、芽長、根干重和根冠比整體隨鎘濃度的升高而下降，這說明鎘抑制了青葙幼苗的生長。這與鎘脅迫下苧麻(Boehmeria nivea)的研究結(jié)果[21]一致，可能是重金屬鎘抑制了種子內(nèi)細(xì)胞生命活動(dòng)，導(dǎo)致植物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)不足，最終使植物的生物量減少。本研究還發(fā)現(xiàn)根冠比隨鎘濃度的升高而顯著下降，說明鎘對(duì)根的抑制作用大于地上部分，這與在辣椒(Capsicum annuum)幼苗上的研究結(jié)果[22]一致，可能是植物是通過根來吸收基質(zhì)中的物質(zhì)并輸送到地上部分，且相較于植物地上部分，根與鎘溶液直接接觸，使根受到鎘的抑制程度較大。

3.2 光合色素

葉綠素含量是體現(xiàn)植物光合作用強(qiáng)弱的重要參數(shù)，間接體現(xiàn)植物對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力。本研究中葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量隨鎘濃度增加而下降，這與在匍匐剪股穎(Agrostis stolonifera)[23]、巨桉(Eucalyptus grandis)[24]和火炬樹(Rhus typhina)[25]幼苗上的研究結(jié)果一致，可能是高濃度鎘脅迫損壞了葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)，葉綠素的合成受到抑制，從而影響了光合作用與新陳代謝，進(jìn)而影響植物的生長。

3.3 抗氧化酶

植物受到不利條件時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基，使得植物細(xì)胞膜脂過氧化，對(duì)植物產(chǎn)生毒害。植物體內(nèi)的SOD、POD 和CAT 等抗氧化酶活性會(huì)增強(qiáng)以減少活性氧自由基對(duì)植物生理機(jī)能的損傷。本研究中，青葙幼苗葉片的SOD、POD 和CAT 活性隨著鎘濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，這與在早開堇菜(Viola prionantha)[26]、雙腺藤(Mandevilla sanderi)[27]和黑楊派(Aigeiros)[28]上的研究結(jié)果一致，可能是鎘濃度較低時(shí)，植物通過提高抗氧化酶活性并增加體內(nèi)活性氧來抵抗重金屬帶來的毒害；隨著鎘濃度不斷增加，植物產(chǎn)生活性氧的能力超過清除能力，使植物生物膜及酶系統(tǒng)受到的傷害增加，植物內(nèi)環(huán)境紊亂，抗氧化酶最適環(huán)境遭到破壞，從而使植物體內(nèi)的抗氧化酶活性降低。可以看出，脅迫濃度較低時(shí)，青葙能通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性來減輕鎘所產(chǎn)生的毒害作用。

3.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

植物在遇到外界的不良環(huán)境時(shí)，會(huì)快速做出反應(yīng)來緩解不利影響，提高植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，來維持植物細(xì)胞正常的生命活動(dòng)。本研究中，可溶性糖和可溶性蛋白含量隨鎘濃度的升高而逐漸升高，這與鎘脅迫下香樟(Cinnamomum camphora)幼苗上的研究結(jié)果[29]一致，可能是植物在受到鎘脅迫時(shí)迅速反應(yīng)，為應(yīng)對(duì)外界的不利環(huán)境，植物通過產(chǎn)生大量的可溶性糖和可溶性蛋白為植物生理生化活動(dòng)提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)，也提高植物細(xì)胞液濃度，保持植物體內(nèi)水分調(diào)節(jié)，使植物細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)降低，而可溶性蛋白增加能使植物細(xì)胞維持相應(yīng)的膨壓和正常代謝，保證細(xì)胞內(nèi)各種生命活動(dòng)和生化反應(yīng)的進(jìn)行。

游離脯氨酸含量隨鎘濃度升高呈先增加后下降的趨勢(shì)，這與在珙桐(Davidia involucrata)幼苗[30]和尾穗莧(Amaranthus caudatus)[31]上的研究結(jié)果一致，可能是鎘濃度較低時(shí)，植物能通過增加游離脯氨酸含量來減輕逆境帶來的傷害；隨著鎘濃度的不斷升高，植物體內(nèi)各種生物化學(xué)反應(yīng)和酶活性受到影響，導(dǎo)致游離脯氨酸含量減少?？梢钥闯?，脅迫濃度較低時(shí)，青葙能通過調(diào)控體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來抵抗重金屬鎘所帶來的脅迫。

3.5 丙二醛

丙二醛含量的高低可代表植物遭受毒害的強(qiáng)度和對(duì)逆境條件下的反應(yīng)能力。青葙幼苗葉片MDA含量隨著鎘濃度的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，這與在小白菜(Brassica rapavar.oleifera)[32]上的研究結(jié)果一致。其原因可能是隨著鎘濃度的升高，青葙所受到的毒害作用增強(qiáng)，植物細(xì)胞遭到破壞，膜脂過氧化程度加深，使得丙二醛的含量增加。這說明鎘含量過高會(huì)導(dǎo)致青葙細(xì)胞膜脂過氧化，從而加大植物受到的傷害作用。

4 結(jié)論

鎘脅迫對(duì)青葙種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)影響較小，但降低了發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，也降低了幼苗的根長、芽長、干重、根冠比；光合色素含量隨鎘濃度的升高而逐漸下降；抗氧化酶活性隨著鎘濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，游離脯氨酸含量隨鎘濃度的升高呈先增加后下降的趨勢(shì)，可溶性糖、可溶性蛋白和MDA 含量均隨鎘濃度的升高而逐漸升高。青葙在高濃度鎘脅迫下尚能生長，能通過提高抗氧化酶活性和調(diào)控體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來應(yīng)對(duì)重金屬鎘帶來的毒害作用，其抗逆性和耐鎘能力較強(qiáng)，可作為土壤鎘污染嚴(yán)重地區(qū)修復(fù)的候選植物。