邢鳳霞，張 強(qiáng)，盧國(guó)徽，趙艷芳，周 瓊

（北京大學(xué)第三醫(yī)院北方院區(qū)口腔科，北京 100089）

硒是一種人體必需的微量元素，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著多種生理功能，比如抗氧化損傷、解毒、增強(qiáng)免疫力等。流行病學(xué)研究提示，血清硒濃度與腫瘤發(fā)生率、死亡率之間呈負(fù)相關(guān)[1]。因此人們?cè)O(shè)計(jì)合成了多種含硒化合物抑制腫瘤[2]。但是這些含硒化合物的毒副作用也限制了其在腫瘤治療中的應(yīng)用[3]。因此，北京大學(xué)藥學(xué)院師長(zhǎng)進(jìn)等[4]合成了一種高效、低毒的有機(jī)硒化合物-乙烷硒啉（1,2-[ 二(1,2-苯并異硒唑-3(2H)-酮)]乙烷，BBSKE）。體外研究顯示，BBSKE對(duì)多種腫瘤細(xì)胞，如肝癌Bel-7402、白血病HL-60、鼻咽癌KB、宮頸癌HeLa、胃癌BGC-823等細(xì)胞系有明顯抑制作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，BBSKE明顯抑制肺癌、前列腺癌等的生長(zhǎng)[5-6]。腺樣囊性癌是最常見(jiàn)的涎腺惡性腫瘤之一，易沿神經(jīng)擴(kuò)散，浸潤(rùn)性極強(qiáng)，肺轉(zhuǎn)移率高。雖然可長(zhǎng)期帶瘤生存，但其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率較高，且對(duì)多種化療藥物均不敏感?；诖?，本研究探討B(tài)BSKE對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及機(jī)制，將有助于腺樣囊性癌的輔助治療。

1 材料與方法

1.1 試劑 乙烷硒啉(北京大學(xué)有機(jī)硒藥物研究中心，分子量422.2，含量＞98.5%)，用二甲基亞砜（DMSO）（上海吉至生化科技有限公司）制成20 mmol/L儲(chǔ)存液，20 ℃分裝保存。3(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）；無(wú)血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基（RPMI 1640）（GIBCO公司）；胎牛血清（北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所）；[5,5－二硫雙（2－硝基苯甲酸）](DTNB)和還原型輔酶Ⅱ（NADPH）購(gòu)自Sigma公司。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人腺樣囊性癌細(xì)胞系（SACC-83、SACC-LM）由本實(shí)驗(yàn)室建系。細(xì)胞用含15%胎牛血清，100 U/ mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液；于37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖分析 用MTT法[7]觀察BBSKE對(duì)SACC-83、SACC-LM細(xì)胞增殖活性的影響。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SACC-83、SACC-LM制備細(xì)胞懸液，按5×103個(gè)/孔，180 μL/孔，接種于96孔板。24 h后吸取上清液，更換為含不同濃度BBSKE的細(xì)胞培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組含0.1%的DMSO，每一濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束前每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡培養(yǎng)液后每孔加入150 μL DMSO，37 ℃，100 r/min震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶后用酶標(biāo)儀 (USA，型號(hào)：BIO-Tek Elx808)于570 nm波長(zhǎng)下測(cè)每孔的吸光度（A值）。計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=加藥組平均A值/對(duì)照組平均A值）×100%]及抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到50%時(shí)的藥物濃度（IC50）。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.4 赫斯特（Hoechst）熒光染色 用Hoechst熒光染色法[8]觀察BBSKE對(duì)SACC-83、SACCLM細(xì)胞形態(tài)變化的影響。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SACC-83、SACC-LM制備細(xì)胞懸液，按2.5×105個(gè)/孔接種于D60 mm的培養(yǎng)皿。24 h后吸去上清液，更換為含10 μmol/L BBSKE的細(xì)胞培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組含0.1%的DMSO，每一濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后用0.25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，采用Hoechst染色，熒光顯微鏡(200倍)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 半胱氨蛋白水解酶-3（Caspase-3）活性檢測(cè) SACC-83、SACC-LM細(xì)胞經(jīng)不同濃度的BBSKE處理48 h后，按Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒（Promega公司）說(shuō)明，加入細(xì)胞裂解液1×108個(gè)細(xì)胞/mL提取蛋白，Brandford法定量（普利萊公司）。50 μg蛋白加入2 μL底物，37 ℃孵育4 h后在酶標(biāo)儀405 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。

1.6 硫氧還蛋白還原酶（TrxR）活性檢測(cè) 采用DTNB法 測(cè) 定 TrxR 活 性[9]。SACC-83、SACCLM細(xì)胞經(jīng)不同濃度的BBSKE（每個(gè)濃度2個(gè)平行樣）處理48 h后加入蛋白裂解液 [25 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl） (pH=7.4)，137 mmol/L 氯化鈉，1% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），1% 脫氧膽酸鈉，10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），0.1% 十二烷基硫酸鈉（SDS）]提取蛋白，Brandford法蛋白定量后，在半微量比色池中加入0.3 mmol/L 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、10 μg細(xì)胞蛋白，用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)最終體積至100 μL[DTNB的體積]。加入150 μmol/L DTNB啟動(dòng)DTNB二硫鍵還原反應(yīng)，立即在核酸/蛋白檢測(cè)儀（Beckman Coulter DU730）412 nm處測(cè)定吸光度值，每10 s測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定10 min，記錄吸光度值的變化量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BBSKE對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞系SACC-83、SACC-LM細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BBSKE對(duì)SACC-83、SACC-LM細(xì)胞的增殖均有抑制作用。不同濃度的BBSKE對(duì)SACC-83、SACC-LM細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。BBSKE作用于SACC-83和SACC-LM腺樣囊性癌細(xì)胞 72 h，IC50分別為 12 μmol/L 和 10 μmol/L，見(jiàn)圖1。

圖1 BBSKE對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞系SACC-83、SACC-LM細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 BBSKE對(duì)SACC-83、SACC-LM細(xì)胞形態(tài)變化的影響 細(xì)胞凋亡的特征性形態(tài)學(xué)變化主要包括細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成。10 μmol/L的BBSKE作用SACC-83、SACC-LM細(xì)胞24 h，細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡相應(yīng)形態(tài)變化，結(jié)果顯示，BBSKE對(duì)SACC-83、SACC-LM細(xì)胞均有凋亡誘導(dǎo)作用，且SACC-LM細(xì)胞凋亡發(fā)生更為敏感，見(jiàn)圖2。

圖2 BBSKE對(duì)SACC-83、SACC-LM細(xì)胞形態(tài)變化的影響

2.3 不同濃度BBSKE對(duì)SACC-83、SACC-LM細(xì)胞中Caspase-3活性的影響 以0 μmol/L為對(duì)照，采用3種不同濃度的BBSKE作用SACC-83、SACCLM細(xì)胞48 h，檢測(cè)Caspase-3活性（405 nm處的吸光度值）。隨著B(niǎo)BSKE濃度增大，Caspase-3活性升高，且SACC-LM比SACC-83細(xì)胞升高更為明顯，見(jiàn)圖3，SACC-83 細(xì)胞：5 μmol/L組與對(duì)照組Caspase-3活性相比無(wú)明顯變化，其相對(duì)活性分別為（1.27±0.16）和 1.00，而 10 μmol/ L組和20 μmol/L組Caspase-3相對(duì)活性分別為（1.44±0.18）和（1.8±0.04），顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；SACC-LM細(xì)胞：5 μmol/L 組、10 μmol/L 組 和 20 μmol/L組Caspase-3相對(duì)活性分別為（2.89±0.07）、（2.75±0.49）和（3.14±0.09），顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 不同濃度BBSKE對(duì)SACC-83、SACC-LM細(xì)胞中Caspase-3活性的影響

2.4 BBSKE對(duì)SACC細(xì)胞TrxR活性的影響 3種不同濃度的BBSKE作用SACC-83、SACC-LM細(xì)胞48 h后檢測(cè)TrxR活性。SACC-83細(xì)胞：BBSKE對(duì)其TrxR活性無(wú)明顯的影響；SACC-LM細(xì)胞：隨著B(niǎo)BSKE濃度增大，TrxR活性明顯降低。BBSKE 5 μmol/L 組、10 μmol/L 組 和 20 μmol/L組的TrxR活性（λ=412 nm處的吸光度值）分別為（0.113±0.003）、（0.088±0.007）、（0.046±0.017），見(jiàn)圖4。

圖4 BBSKE對(duì)SACC細(xì)胞TrxR活性的影響

3 討論

本研究證實(shí)，新型有機(jī)硒化合物BBSKE對(duì)腺樣囊性癌有抑制作用。其作用靶點(diǎn)是TrxR，通過(guò)抑制TrxR活性抑制癌細(xì)胞的增殖[10，13]。硫氧還蛋白（Trx）系統(tǒng)(TrxR、Trx、NADPH)是普遍存在于細(xì)胞內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)，在體內(nèi)發(fā)揮著重要的抗氧化和氧化還原調(diào)控等作用[11]。Trx系統(tǒng)在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞中的TrxR在轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)水平都有所增加[12]。因此，控制癌細(xì)胞中的TrxR活性至關(guān)重要。含硒化合物可調(diào)節(jié)TrxR的活性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BBSKE對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞的增殖也有抑制作用，且在其他細(xì)胞系中也有類(lèi)似的結(jié)果[10-14]。

BBSKE可以調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如細(xì)胞周期蛋白A（cyclinA），細(xì)胞周期蛋白E（cyclinE），細(xì)胞周期抑制蛋白P21，細(xì)胞周期蛋白B1（cyclinB1），細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1），細(xì)胞周期蛋-依賴性蛋白激酶4（Cdk4）等，使腫瘤細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期S期而抑制腫瘤細(xì)胞增殖；也可調(diào)控增殖、凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase3）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的末端信號(hào)分子，其在決定細(xì)胞是否凋亡中起著重要作用。

同時(shí)，由于許多腫瘤細(xì)胞中TrxR表達(dá)水平高于正常細(xì)胞，所以BBSKE能特異性選擇殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞的損傷很小。在不同的研究中發(fā)現(xiàn)，相同作用條件下，BBSKE 對(duì)正常肝細(xì)胞系HC7701(IC50-24 h∶53.83 μmol/L)的生長(zhǎng)抑制作用比腫瘤肝細(xì)胞系Bel-7402 (IC50-24 h∶32.41 μmol/L)??；BBSKE對(duì)人胚胎肺二倍體細(xì)胞系CCC-HPF-1（IC50-24 h＞40 μmol/L）生長(zhǎng)抑制作用明顯低于肺癌細(xì)胞系 A459(IC50-24 h ∶ 7 μmol/L)[6，13]。BBSKE比亞硒酸鈉具有更好的組織耐受性及低毒性，BBSKE還可通過(guò)增加正常及腫瘤鼠的相對(duì)脾重、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性、自然殺傷細(xì)胞(NK)活性等，顯著提高機(jī)體免疫力[14]。而染色體畸變?cè)囼?yàn)證實(shí)BBSKE無(wú)致突變作用[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，BBSKE可以抑制腺樣囊性癌細(xì)胞的增殖，且對(duì)腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SACC-LM更為敏感。其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制細(xì)胞中TrxR的活性，升高Caspase-3活性實(shí)現(xiàn)的。但是BBSKE是否可以在體內(nèi)抑制腺樣囊性癌的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移則需要人體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。