于海明，盧武，李玉姬，張思也

湖南省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，長(zhǎng)沙 410000

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）最致命的原發(fā)性腦腫瘤。美國(guó)約有30%的CNS腫瘤被診斷為神經(jīng)膠質(zhì)瘤[1]，其中，惡性腫瘤占81%[2]。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）根據(jù)組織學(xué)特征將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)[3]。彌漫性低級(jí)別（WHOⅠ～Ⅱ級(jí)）膠質(zhì)瘤稱為低級(jí)別膠質(zhì)瘤（low-grade glioma，LGG）[4]。由于其增殖速度快和高侵襲性，這些LGG將在幾個(gè)月內(nèi)發(fā)展成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）（WHOⅢ～Ⅳ級(jí)）[5]。GBM是最常見的惡性膠質(zhì)瘤，臨床預(yù)后差，很少患者生存時(shí)間超過(guò)14個(gè)月[6]。因此，研發(fā)幫助判斷膠質(zhì)瘤臨床預(yù)后的生物標(biāo)志物是非常必要的。核糖核酸酶A家族成員2（ribonuclease A family member 2，RNASE2）是免疫系統(tǒng)的重要調(diào)控因子，是多種腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物[7-9]，但其在膠質(zhì)瘤中與免疫浸潤(rùn)及預(yù)后的關(guān)系仍未有研究。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析RNASE2基因在膠質(zhì)瘤組織與正常組織中的表達(dá)差異，并評(píng)估其與膠質(zhì)瘤預(yù)后、免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 RNASE2基因的篩選過(guò)程

下載癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atla，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤組織測(cè)序數(shù)據(jù)163個(gè)和腦組織測(cè)序數(shù)據(jù)44個(gè)，進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，得到7649個(gè)差異表達(dá)的基因（P＜0.05）；根據(jù)預(yù)后數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，取差異最顯著的前500個(gè)預(yù)后基因（P＜0.05）。免疫基因來(lái)自IMMPORT數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.immport.org/shared/genelists）中的細(xì)胞因子，共456個(gè)。三者采用韋恩在線分析（http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn）取交集。

1.2 RNASE2基因的表達(dá)水平分析

RNASE2基因在中國(guó)膠質(zhì)瘤基因組圖譜（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）和 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)泛癌中的表達(dá)采用腫瘤免疫評(píng)估資源（Tumor Immune Estimation Resource，TIMER）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://timer.comp-genomics.org/）和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）進(jìn) 行 分 析 。RNASE2基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤組織和腦組織中的mRNA表達(dá)量及其與預(yù)后的分析均應(yīng)用基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn/about.html）軟件進(jìn)行分析。RNASE2基因在CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中GMB和腦組織中的表達(dá)量分析采用數(shù)據(jù)庫(kù)自帶軟件（http://www.cgga.org.cn/）進(jìn)行分析。

1.3 RNASE2與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系分析

RNASE2基因表達(dá)與大量免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相關(guān)性分析應(yīng)用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)基因模塊進(jìn)行分析。

1.4 RNASE2及相關(guān)基因的京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）及基因本體論（gene ontology，GO）分析

采用Linkedomics軟件（http://www.linkedomics.org/admin.php）中的Pearson相關(guān)分析法對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤（n=489）與RNASE2基因轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性進(jìn)行分析，并采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG信號(hào)通路分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用TCGA、CGGA、TIMER、UALCAN、GEPIA、Linkedomics等軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNASE2基因在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平

首先將膠質(zhì)瘤表達(dá)差異顯著基因（n=7649）、預(yù)后差異顯著基因（n=500）、免疫細(xì)胞因子（n=456）取交集，得到7個(gè)交集基因，選擇RNASE2作為后續(xù)研究對(duì)象。采用TIMER分析RNASE2在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)泛癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示RNASE2在膠質(zhì)瘤中表達(dá)較高（P＜0.001）（圖1）。GEPIA分析顯示，RNASE2基因在GMB和LGG中的表達(dá)水平均高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。UALCAN分析顯示，RNASE2基因在GMB中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖3）。

圖1 RNASE2在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)泛癌中的表達(dá)

圖2 GEPIA分析RNASE2基因在GMB、LGG及相應(yīng)癌旁組織中表達(dá)水平的比較

圖3 UALCAN分析RNASE2基因在GMB（n=156）及癌旁組織（n=5）中表達(dá)水平的比較

2.2 RNASE2表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

CGGA分析顯示，RNASE2基因表達(dá)水平在WHOⅡ級(jí)、WHOⅢ級(jí)、WHOⅣ級(jí)膠質(zhì)瘤中依次遞增，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖4）；此外，RNASE2基因在復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平明顯高于原位膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖5）。

圖4 CGGA分析RNASE2基因在不同WHO分級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平比較

圖5 CGGA分析RNASE2基因在復(fù)發(fā)及原位膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平比較

2.3 RNASE2表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

采用GEPIA2與CGGA分析RNASE2與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，RNASE2低表達(dá)的GMB和LGG患者生存情況均明顯優(yōu)于RNASE2高表達(dá)的GMB和LGG患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（圖6、圖7）

圖6 RNASE2低表達(dá)（n=65）與高表達(dá)（n=81）GMB患者的生存曲線

圖7 RNASE2低表達(dá)（n=257）與高表達(dá)（n=257）LGG患者的生存曲線

2.4 RNASE2表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系

RNASE2mRNA表達(dá)水平與CD8+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞呈正相關(guān)（P＜0.05）。（圖8）

圖8 RNASE2 mRNA表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性

2.5 RNASE2的基因富集分析

使用Linkedomics的LinkFinder模塊分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，6235個(gè)基因與RNASE2呈負(fù)相關(guān)，5807個(gè)基因與RNASE2呈正相關(guān)。與RNASE2相關(guān)的前50位顯著正性基因和前50位顯著負(fù)性基因詳見圖9、圖10。RNASE2與免疫基因Toll樣受體1（Toll-like receptor 1，TLR1）呈正相關(guān)（r=0.773，P＜0.001）；RNASE2與ARVCFδ連環(huán)蛋白家族成員（ARVCFdeltacateninfamilymember，ARVCF）呈負(fù)相關(guān)（r=-0.471，P＜0.001）。

圖9 與RNASE2相關(guān)的前50位顯著正性基因表達(dá)熱圖

圖10 與RNASE2相關(guān)的前50位顯著負(fù)性基因表達(dá)熱圖

此外，通過(guò)GSEA進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果顯示，與RNASE2相關(guān)的差異表達(dá)基因主要富集在免疫（Fc γ介導(dǎo)的吞噬作用）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路等中（圖11）。GO分析結(jié)果與KEGG結(jié)果類似，RNASE2差異表達(dá)基因主要富集在免疫、炎癥[急性炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）生成]相關(guān)的生物過(guò)程（嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫）和分子功能（膠原黏附、細(xì)胞因子受體活性）。為了進(jìn)一步研究RNASE2在膠質(zhì)瘤中可能的分子機(jī)制，利用Linkedomics對(duì)miRNA進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示RNASE2與（CAGCAGG）miRNA-370相關(guān)（圖12）。

圖11 GSEA分析RNASE2差異表達(dá)基因KEGG富集通路

圖12 RNASE2的miRNA靶基因分析

3 討論

目前，大多數(shù)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后很差，即使采用綜合治療策略。膠質(zhì)瘤的治療耐藥性已被廣泛報(bào)道，與其獨(dú)特的代謝機(jī)制和周圍復(fù)雜的免疫抑制微環(huán)境密切相關(guān)[10-11]。因此，迫切需要探索可靠的預(yù)后生物標(biāo)志物和個(gè)性化治療策略。本研究發(fā)現(xiàn)，RNASE2表達(dá)在膠質(zhì)瘤中顯著增加，且與預(yù)后、復(fù)發(fā)有關(guān)。RNASE2可作為評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤預(yù)后與復(fù)發(fā)的潛在標(biāo)志物。

RNASE2作為核糖核酸酶A家族的一員，可以作為細(xì)胞因子參與免疫及腫瘤的預(yù)后[7,12-13]。Ostendorf等[13]的一項(xiàng)研究指出，Toll樣受體8對(duì)合成細(xì)菌和原生動(dòng)物RNA的免疫傳感需要RNASET2和RNASE2的協(xié)調(diào)處理。在胃癌中，RNASE2與預(yù)后呈正相關(guān)，可作為潛在的評(píng)估胃癌預(yù)后及免疫浸潤(rùn)的標(biāo)志物[7]。RNASE2還被證明為肺動(dòng)脈高壓及免疫浸潤(rùn)的標(biāo)志物[14]。在腎透明細(xì)胞癌中，RNASE2與預(yù)后相關(guān)[15]。在另一項(xiàng)研究中，RNASE2可作為腎透明細(xì)胞癌預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)[9]。上述研究結(jié)論進(jìn)一步佐證了RNASE2作為膠質(zhì)瘤預(yù)后的標(biāo)志物。

免疫浸潤(rùn)會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤中免疫微環(huán)境破壞，促進(jìn)免疫逃逸的發(fā)生，因此，本研究評(píng)估RNASE2水平是否與膠質(zhì)瘤的免疫浸潤(rùn)相關(guān)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞群，在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤免疫逃逸的作用。隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例增加[16]。多項(xiàng)研究說(shuō)明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的高表達(dá)預(yù)示不良預(yù)后[17-18]。在本研究中，RNASE2基因的表達(dá)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例呈正相關(guān)，RNASE2低表達(dá)時(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例低，預(yù)后更好（未提供）。本研究還發(fā)現(xiàn)RNASE2的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。CD8+T細(xì)胞可分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，抵抗外來(lái)病原體的入侵[19]。Kane等[20]證明CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫編輯抑制小鼠膠質(zhì)瘤基因組進(jìn)化和免疫逃逸。

此外，對(duì)RNASE2的相關(guān)性基因分析發(fā)現(xiàn)，RNASE2與ARVCF基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與TLR1表達(dá)呈正相關(guān)。ARVCF表達(dá)下調(diào)時(shí)可抑制p53誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[21]。TLR1能夠調(diào)節(jié)腦腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)[22]。為探討RNASE2影響患者生存的可能機(jī)制，本研究對(duì)RNASE2差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析，結(jié)果提示存在多種免疫相關(guān)通路。此外，GSEA富集分析進(jìn)一步揭示了多種免疫相關(guān)功能和途徑的富集。因此，推測(cè)RNASE2可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫發(fā)揮促癌作用，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫等，這在之前的研究中沒有發(fā)現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的膠質(zhì)瘤預(yù)后基因RNASE2，它也與免疫密切相關(guān)。這一結(jié)果在以往國(guó)內(nèi)外研究中未見報(bào)道，因此本研究可能會(huì)影響膠質(zhì)瘤未來(lái)的診斷和治療。然而，本研究也有一些局限性。本研究未對(duì)RNASE2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的功能和潛在機(jī)制進(jìn)行評(píng)估。此外，RNASE2與腫瘤免疫微環(huán)境之間的關(guān)系仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。最后，RNASE2在一些特殊類型的膠質(zhì)瘤（如彌漫性中線膠質(zhì)瘤）中的作用仍有待進(jìn)一步討論。