尚穎，宋淑軍，司少艷

中國人民解放軍戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心研究部二室，北京 100101

20世紀(jì)30年代初，丹麥生化學(xué)家Dam和Sch?nheyder[1]發(fā)現(xiàn)，由于小雞飼料中缺乏某種物質(zhì)，導(dǎo)致小雞出現(xiàn)異常出血癥狀。1935年，Dam[2]發(fā)現(xiàn)了一種具有促進(jìn)凝血作用的物質(zhì)，并將其命名為維生素K（vitamin K）。因發(fā)現(xiàn)維生素K，Dam于1943年獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。維生素K作為凝血輔助因子參與凝血過程，近年來其抗腫瘤作用已成為研究重點(diǎn)。維生素K對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長具有抑制作用或細(xì)胞毒性作用，本文針對(duì)維生素K的抗腫瘤作用機(jī)制及臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 維生素K及維生素K依賴蛋白

1.1 維生素K的結(jié)構(gòu)及來源

維生素K是一類脂溶性維生素，包括天然存在的維生素K1、維生素K2，以及人工合成的維生素K3、維生素K4和維生素K5。維生素K家族成員具有相同的1，4-萘醌結(jié)構(gòu)，萘環(huán)上1位和4位含有2個(gè)羰基，根據(jù)2位和3位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的不同進(jìn)行分類。

維生素K1具有飽和側(cè)鏈，也稱為葉綠醌，主要來源于綠色蔬菜和水果。維生素K2是一類以部分不飽和側(cè)鏈為主的化合物，主要來源于發(fā)酵食品、肉類和乳制品等，通過腸道細(xì)菌合成。維生素K3是一種人工合成的維生素，可在肝臟中烷基化后轉(zhuǎn)化為維生素K2。

1.2 維生素K和維生素K依賴蛋白的功能

維生素K是參與凝血過程重要的輔助因子，其主要功能是作為輔助因子激活凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及調(diào)節(jié)蛋白C、S、Z等，從而發(fā)揮凝血作用[3]。維生素K1也是肝臟合成多種凝血因子的必要成分，在促進(jìn)凝血、維護(hù)骨骼健康、維護(hù)心血管功能健康、促進(jìn)傷口愈合等方面起到積極作用。與其他維生素K不同，大劑量的維生素K3會(huì)引起各種不良反應(yīng)，包括過敏反應(yīng)、溶血性貧血和肝細(xì)胞毒性等[4]。研究表明，維生素K能夠在不同水平對(duì)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用和促凋亡作用[5]。

維生素K依賴蛋白是一類依賴維生素K激活而發(fā)揮作用的蛋白，除了參與凝血，還在其他不同的生理過程中發(fā)揮作用，如參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)骨鈣化、抑制血管鈣化[6]以及參與腫瘤抑制作用[7]等。

1.3 維生素K循環(huán)

在激活凝血因子的過程中，維生素K在磷酸輔酶Ⅰ的作用下轉(zhuǎn)化為維生素K氫醌（vitamin KH2，KH2），KH2在γ-谷氨酸羧化酶（gamma-glutamyl carboxylase，GGCX）的作用下被氧化成維生素K環(huán)氧化物（vitamin K epoxide，KO），同時(shí)使凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ中無活性的谷氨酸（glutamic，Glu）殘基轉(zhuǎn)化為有活性的γ-羧基谷氨酸（γ-carboxyglutamic acid，Gla），從而激活這些凝血因子，在鈣離子的參與下產(chǎn)生凝血作用[8]。KO又可以被硫醇和維生素K環(huán)氧化物還原酶（vitamin K-dependent epoxide reductase，VKOR）還原為維生素K，然后再被還原為KH2[9]，使循環(huán)得以持續(xù)進(jìn)行。維生素K、KH2和KO之間的循環(huán)被稱為維生素K循環(huán)。維生素K循環(huán)的本質(zhì)是氧化還原循環(huán)，維生素K的活性可能會(huì)影響組織和細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，因此維生素K是氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因子[10]。

2 維生素K的抗腫瘤作用機(jī)制

維生素K在不同水平抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，包括肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌和白血病等。雖然體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯示維生素K對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒性作用和抑制細(xì)胞生長的作用，但其對(duì)不同類型細(xì)胞的作用機(jī)制并不相同，維生素K3的抗腫瘤機(jī)制主要為氧化應(yīng)激和芳基化作用，而維生素K1和維生素K2則主要通過非氧化應(yīng)激機(jī)制介導(dǎo)抗腫瘤作用[9]，這些作用機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)尚不十分明確。

2.1 氧化應(yīng)激介導(dǎo)的抗腫瘤作用

維生素K具有氧化還原活性，一方面表現(xiàn)為將氫醌還原為半氫醌，在有氧情況下，半氫醌氧化成維生素K，導(dǎo)致氧減少、活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多；另一方面在醌氧化還原酶抗原Ⅰ的催化下，以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作為電子供體，將維生素K還原為氫醌，此反應(yīng)也導(dǎo)致ROS增多[11]。這兩種反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，產(chǎn)生大量ROS，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與其防御機(jī)制之間的不平衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激水平的增加會(huì)誘導(dǎo)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化修飾和DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或腫瘤細(xì)胞分化。由于腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞含有更高水平的ROS，腫瘤細(xì)胞更容易受到氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。過氧化物氧化還原酶1（peroxiredoxin 1，PRX1）在腫瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖等許多生理過程中都發(fā)揮著重要作用。He等[12]研究發(fā)現(xiàn)，如果將人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和宮頸癌Hela細(xì)胞的PRX1基因敲除，可使維生素K3在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)累積ROS，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)維生素K3的敏感性，減少殺滅腫瘤細(xì)胞所需維生素K3的劑量。

維生素K3能夠擾亂鈣穩(wěn)態(tài)并引起細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑谷胱甘肽含量減少，也稱為芳基化作用。細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽耗竭，被認(rèn)為是細(xì)胞毒性損傷的重要因素之一，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能衰竭，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2.2 非氧化應(yīng)激介導(dǎo)的抗腫瘤作用

2.2.1 維生素K促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡 維生素K通過不同途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，包括改變細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、Fas依賴性和非依賴性信號(hào)通路以及核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等促凋亡因子[13]。目前有關(guān)維生素K促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的通路有兩個(gè)比較清楚，分別為線粒體介導(dǎo)的通路和Fas/Fas配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）膜受體通路。

線粒體是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心，維生素K3可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，從而改變線粒體膜中半胱氨酸基團(tuán)的氧化還原狀態(tài)，降低線粒體膜電位以及破壞內(nèi)膜完整性，最終導(dǎo)致細(xì)胞色素C、凋亡肽酶激活因 子 1（apoptotic peptidase activating factor 1，APAF1）等細(xì)胞凋亡蛋白的釋放，觸發(fā)caspase 9激活[14]。維生素K2可降低B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）表達(dá)，增加Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）表達(dá)，引起線粒體膜電位去極化，釋放細(xì)胞色素C，并激活caspase 3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。

Fas是腫瘤壞死因子家族中一個(gè)重要的死亡受體，F(xiàn)asL通過三聚化激活Fas受體的功能，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。維生素K3能夠誘導(dǎo)突變型白血病細(xì)胞Fas和FasL表達(dá)[9]。一些外在的刺激，如結(jié)合T細(xì)胞受體（T-cell receptor，TCR）、紫外線、γ輻射以及藥物，可以通過激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)FasL[13]。TCR誘導(dǎo)FasL的表達(dá)依賴于c-Myc的表達(dá)[14]。維生素K3可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞c-Myc表達(dá)，促進(jìn)Fas和FasL表達(dá)增加，這些進(jìn)一步證實(shí)c-Myc與Fas/FasL系統(tǒng)之間的聯(lián)系[13]。

另外，WNT信號(hào)過度激活是結(jié)腸癌發(fā)生的重要指征，維生素K3可以通過激活糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β），阻斷結(jié)腸癌WNT信號(hào)通路，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌發(fā)生[16]。維生素K3還能通過干擾磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）信號(hào)通路，激活蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、腺苷一磷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）以及p38信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。

2.2.2 維生素K抑制腫瘤細(xì)胞周期 腫瘤的發(fā)生可能是由于細(xì)胞周期調(diào)控異常所致，細(xì)胞周期蛋白是細(xì)胞周期中的調(diào)節(jié)蛋白，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）結(jié)合，調(diào)節(jié)CDK活性，細(xì)胞周期蛋白和CDK的異常改變可使細(xì)胞失控性生長，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[17]。NF-κB可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1，達(dá)到調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長的作用，因此，NF-κB的活性是控制腫瘤細(xì)胞的重要因素。

維生素K2通過作用于細(xì)胞周期蛋白，抑制細(xì)胞周期并啟動(dòng)分化作用。維生素K2通過抑制NF-κB與細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子的結(jié)合，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，使肝癌細(xì)胞周期停滯在G1期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，維生素K2呈劑量依賴性抑制肝癌細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的生長[18]。維生素K2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期阻滯的另一種機(jī)制是促進(jìn)p21和p27轉(zhuǎn)錄。p21和p27是近年來發(fā)現(xiàn)的CDK依賴性抑制劑CIP/KIP家族中的重要成員，它們能夠抑制細(xì)胞周期G1/S期進(jìn)程[19]。維生素K2在白血病細(xì)胞中可以上調(diào)p27表達(dá)，使白血病細(xì)胞停滯在G0/G1期[20]。

維生素K3能有效延遲細(xì)胞周期的G1/S期和S/G2期，在25～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)，其以劑量依賴性方式延遲人肝癌細(xì)胞S/G2期[9]。維生素K3可誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0亞群細(xì)胞增加，進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡[16]。維生素K3還可以將胃癌細(xì)胞阻滯在G2/M期[21]。維生素K3與一種蘑菇生物活性提取物在腎細(xì)胞癌中協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯[22]。因此，維生素K對(duì)細(xì)胞周期的影響可能與腫瘤細(xì)胞種類等因素相關(guān)。

2.2.3 維生素K促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬 細(xì)胞自噬參與維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在多種人類腫瘤中均存在自噬活性的改變，自噬功能降低可以提高腫瘤細(xì)胞的存活優(yōu)勢，因此自噬能力的衰退可能有利于腫瘤惡化。然而，自噬在腫瘤細(xì)胞中具有雙重作用，既可以通過去除受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器作為腫瘤抑制因子，又可以在不利條件下由于應(yīng)激耐受而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。自噬可能在不同腫瘤或同一腫瘤的不同階段發(fā)揮不同作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能導(dǎo)致細(xì)胞自噬，可以將自噬看作細(xì)胞凋亡前的狀態(tài)[19]。研究表明，維生素K2可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬而不伴隨凋亡小體的形成，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞COLO201死亡[23]，促進(jìn)代謝應(yīng)激并引發(fā)膀胱癌細(xì)胞中AMPK依賴性自噬細(xì)胞死亡[24]。

2.2.4 其他機(jī)制 缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，除缺氧外，HIF-1α還能被蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）激活，PKC-δ通過增加核易位來增強(qiáng)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，維生素K2可能通過抑制肝癌細(xì)胞中的PKC來抑制HIF-1α活化，從而起到抑制腫瘤生長的作用[25]。活躍的糖酵解代謝也是腫瘤細(xì)胞的顯著特征之一。抑制糖酵解酶的活性和表達(dá)可以降低糖酵解速率并抑制腫瘤的發(fā)展，維生素K3和維生素K5是糖酵解酶抑制劑，能夠抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF-7糖酵解過程中產(chǎn)生的己糖激酶、磷酸果糖激酶-1、果糖二磷酸醛縮酶等糖酵解酶，從而達(dá)到抗腫瘤作用[26]。

3 維生素K抗腫瘤的臨床應(yīng)用研究

維生素K單獨(dú)在臨床抗腫瘤治療中的應(yīng)用研究較少，主要集中在血液和消化系統(tǒng)腫瘤，且多數(shù)與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用。

3.1 單獨(dú)使用維生素K治療血液和消化系統(tǒng)腫瘤

2000年日本學(xué)者進(jìn)行的一項(xiàng)問卷調(diào)查顯示，接受維生素K2治療的50例骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和 MDS后急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者中，20.0%（3/15）的難治性貧血患者的血細(xì)胞減少癥有所改善，72.7%（8/11）的難治性貧血伴原始細(xì)胞過多轉(zhuǎn)變型患者和50.0%（6/12）的MDS后AML患者骨髓和外周血中原始細(xì)胞數(shù)量減少以及血液學(xué)改善，說明維生素K2能有效治療MDS和MDS后AML，尤其適用于不耐受清髓化療和干細(xì)胞移植的老年患者[27]，并且由于維生素K2毒性較低，適合長期安全給藥，故可將其作為預(yù)防MDS向AML轉(zhuǎn)化或控制MDS疾病進(jìn)展的長期用藥。

維生素K可用于肝癌的預(yù)防與治療?？诜S生素K2可降低肝癌細(xì)胞通過肝臟靜脈侵襲和擴(kuò)散的能力，肝臟組織中的維生素K2濃度至少是血漿中的10倍，并且對(duì)肝癌復(fù)發(fā)有抑制作用，但對(duì)患者生存率無顯著影響[28]。Ganbat等[29]在維生素K治療腫瘤療效的系統(tǒng)評(píng)價(jià)和薈萃分析中提到，對(duì)于可切除的胃癌患者，應(yīng)用維生素K2類似物2～3年，能夠顯著降低肝癌患者的復(fù)發(fā)率，與應(yīng)用維生素K2類似物1年的患者相比，相對(duì)危險(xiǎn)度由0.94降至0.69，患者生存率顯著升高；對(duì)于不可切除的胃癌患者，應(yīng)用維生素K后患者總生存率顯著提高，相對(duì)危險(xiǎn)度為0.74，并且長期攝取維生素K可能有效預(yù)防胃癌復(fù)發(fā)，由此可見，由于累積效應(yīng)，維生素K發(fā)揮更好的抗腫瘤效果需要更長的持續(xù)應(yīng)用時(shí)間，而不是更大的應(yīng)用劑量。

3.2 維生素K與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用

在臨床中單獨(dú)使用維生素K預(yù)防或治療肝癌的效果欠佳時(shí)，維生素K和其他藥物聯(lián)合應(yīng)用便逐漸進(jìn)入大眾視野。已有大量研究證明，維生素K與索拉非尼、絲裂霉素C等腫瘤化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，可對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同抑制作用[9,30-33]，并減少抗腫瘤藥物的不良反應(yīng)[34]。

大量研究表明，維生素K1聯(lián)合索拉非尼治療肝癌具有協(xié)同作用。索拉非尼是一種小分子多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物，D’Alessandro等[35]在研究維生素K1與索拉非尼協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞遷移和增殖的過程中發(fā)現(xiàn)，較高濃度的維生素K1和索拉非尼的協(xié)同抑制作用更強(qiáng)，較低濃度時(shí)協(xié)同抑制作用較弱或無協(xié)同抑制作用，并且不同細(xì)胞系之間會(huì)有一些差異。2017年，Haruna等[36]關(guān)于維生素K增強(qiáng)索拉非尼抗肝癌作用的報(bào)道顯示，與單獨(dú)應(yīng)用索拉非尼相比，索拉非尼和維生素K聯(lián)合應(yīng)用可顯著延長肝癌患者的中位無進(jìn)展生存期（分別為6.0個(gè)月和2.0個(gè)月），中位總生存期也顯著延長（分別為12.5個(gè)月和10.0個(gè)月），治療8周后，與單獨(dú)應(yīng)用索拉非尼相比，索拉非尼和維生素K聯(lián)合應(yīng)用患者的血清脫-γ-羧基凝血酶原（des-γ-carboxy-prothrombin，DCP）水平下降，之前研究表明，高劑量維生素K可抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)DCP積累和釋放，因此推斷維生素K可能通過抑制DCP的產(chǎn)生而發(fā)揮協(xié)同抑制作用。2021年，Haruna等[37]還發(fā)現(xiàn)，肝癌患者每天口服45 mg維生素K2聯(lián)合索拉非尼與單獨(dú)服用索拉非尼相比，聯(lián)合用藥患者的客觀緩解率顯著升高（分別為27.3%和4.5%），中位無進(jìn)展生存期顯著延長（分別為4.9個(gè)月和2.7個(gè)月）。

維生素K2雖然可以促進(jìn)正常成骨細(xì)胞的增殖和活力，但也可以抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63的附著、增殖和活力，當(dāng)維生素K2與姜黃素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，顯示出對(duì)骨肉瘤的協(xié)同治療作用[38]。2010年一項(xiàng)多中心Ⅱ期臨床試驗(yàn)顯示，維生素K2單獨(dú)給藥16周后，低危/中危MDS患者的總緩解率為13%；維生素K2和1α-羥基VD3聯(lián)合治療16周后，患者總緩解率為30%；45%的患者貧血好轉(zhuǎn)，30%的患者血小板減少癥好轉(zhuǎn)[39]。靜脈輸注維生素K3和絲裂霉素C可用于治療實(shí)體瘤，維生素K3對(duì)絲裂霉素C的耐受性無明顯影響[40]。

雖然之前研究表明維生素K2對(duì)治療肝癌及控制復(fù)發(fā)會(huì)產(chǎn)生有益影響，但最新研究表明，肝癌患者應(yīng)用維生素K2不總是安全的。Vera等[41]發(fā)現(xiàn)，在肝癌前病變期應(yīng)用干擾素（interferon，IFN）-α-2b治療，能夠增加病灶內(nèi)腫瘤細(xì)胞死亡數(shù)量，減少病灶體積和數(shù)量，補(bǔ)充維生素K2可阻斷IFN-α-2b對(duì)癌前病變的作用，提高Bcl-2表達(dá)水平，抑制IFN-α-2b對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。

目前，臨床應(yīng)用維生素K治療腫瘤時(shí)，在給藥劑量和持續(xù)用藥時(shí)間方面的研究較少，并且維生素K治療實(shí)體瘤時(shí)，浸潤性較差，需研制維生素K新型制劑用于提高抗實(shí)體瘤療效。

4 維生素K類似物及維生素K新型制劑

1，4-萘醌硫化物等維生素K3類似物對(duì)腎癌細(xì)胞TK10、黑色素瘤細(xì)胞UACC62、乳腺癌細(xì)胞MCF7、宮頸癌細(xì)胞Hela、前列腺癌細(xì)胞PC3和肝癌細(xì)胞HepG2具有抑制作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，其中一種1，4-萘醌衍生物抑制腫瘤細(xì)胞的作用是由于依托泊苷和小白菊內(nèi)酯對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[42]。維生素K2納米載體的應(yīng)用目前正在進(jìn)行臨床前研究。用唾液酸-膽固醇結(jié)合物修飾的維生素K2納米乳劑顯著增強(qiáng)了抗腫瘤活性，表明這些形式的維生素K2可能會(huì)成為預(yù)防或治療腫瘤有潛力的藥物[43]。

5 小結(jié)與展望

隨著新型維生素K衍生物、維生素K新型制劑的不斷研發(fā)，以及維生素K與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，維生素K展現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景，有可能成為今后腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，但同時(shí)合理評(píng)估維生素K作用的利弊也有待于更廣泛的研究。