侯阿美，儲(chǔ)繼軍，汪小莉，郭錦晨

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230038 2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

復(fù) 發(fā) 性 流 產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是一種病因復(fù)雜的生殖疾患，一般是指妊娠28周之前發(fā)生胎兒丟失的次數(shù)≥3 次的，近年來該病發(fā)病率呈增長趨勢(shì)，約占育齡期女性妊娠的1%～5%，嚴(yán)重威脅著女性身心健康[1]?，F(xiàn)代研究普遍認(rèn)為其病因主要與遺傳、免疫、血栓前狀態(tài)、內(nèi)分泌及解剖異常等因素有關(guān)，且有約50%的患者不能確定為上述病因，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）[2]。目前西醫(yī)對(duì)于RSA 患者妊娠早期主要以外源性孕激素+絨促性素的聯(lián)合方案進(jìn)行常規(guī)保胎治療為主，但整體效果欠佳[3]。

補(bǔ)腎安胎沖劑是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的特色制劑，多用于治療自然流產(chǎn)、先兆流產(chǎn)及RSA患者，臨床療效頗為顯著。方中以菟絲子（Cuscutae Semen，CS）、黨參（Codonopsis Radix，CR）為君藥，菟絲子補(bǔ)腎益精，腎旺自可蔭胎，黨參功可補(bǔ)氣益血，又能健脾生津。熟地黃（Rehmanniae Radix Praeparata，RR）補(bǔ)腎填精益髓，加強(qiáng)補(bǔ)腎之功；續(xù)斷（Dipsaci Radix，DR）為安胎之要藥，合桑寄生（Herba Taxilli，HT）以補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，固沖任；白術(shù)（Atractylodes Macrocephala Koidz，AM）、 黃 芪（Hedysarum Multijugum Maxim，HM）益氣健脾，脾旺則氣血充得以滋養(yǎng)先天，腎氣充則胎元固攝有權(quán)，以上共為臣藥。白芍（Paeoniae Radix Alba，PR）有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰柔肝之功；黃芩（Scutellariae Radix，SR）清熱燥濕，止血，安胎；旱蓮草（Ecliptae Herba，EH）可涼血止血，補(bǔ)益肝腎；苧麻根（Boehmeriae Rhizoma Et Radix，BR）功可清熱安胎，以防滋陰過于滋膩太過，為佐使藥。全方共奏補(bǔ)腎健脾益氣、清熱養(yǎng)血安胎之功。

前期臨床研究證實(shí)，補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)于RSA 患者具有十分顯著的療效[4]。在此基礎(chǔ)上，課題組致力于其作用的機(jī)理研究，發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能與調(diào)控VEGFR-2/RAS/MAPK 信 號(hào) 通 路[5]、TGF-β1/PI3K/AKT 信號(hào)通路[6]、MAPK[7]、VEGF[8]、TNF-α[9]等有關(guān)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)是現(xiàn)代中藥復(fù)方研究領(lǐng)域中的常用工具，能夠深入研究中藥藥效的作用基礎(chǔ)及環(huán)節(jié)，評(píng)價(jià)受體和藥物分子親和關(guān)系[10]。課題組基于前期研究，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)聯(lián)合起來，旨在進(jìn)一步探索、驗(yàn)證補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA的潛在靶標(biāo)及作用通路，探索補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA的分子作用機(jī)制，為其臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

資料與方法

1 補(bǔ)腎安胎沖劑藥物活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選

在TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索補(bǔ)腎安胎沖劑中各藥物的成分及靶點(diǎn)，通過設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 進(jìn)一步篩選方中各藥的活性成分。通過蛋白質(zhì)Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）對(duì)各個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行校正并獲得標(biāo)準(zhǔn)化的名稱簡(jiǎn)寫（Symbol）。

2 RSA 相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

將“recurrent spontaneous abortion”“spontaneous abortion”等作為關(guān)鍵詞，分別在Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、GeneBank（https：//cipotato.org/genebankcip/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）等數(shù)據(jù)庫中檢索并獲取與RSA 相關(guān)的靶基因。再將所獲全部基因進(jìn)行合并、去除重復(fù)項(xiàng)及假陽性，獲得RSA 疾病靶點(diǎn)基因的數(shù)據(jù)集。

3 中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫對(duì)RSA 相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行基因注釋，并將藥物相關(guān)靶點(diǎn)與RSA 相關(guān)靶點(diǎn)交集，獲取交集靶點(diǎn)，并以Venn 圖展示。通過在Cytoscape 3.8.2軟件中導(dǎo)入藥物活性成分及相應(yīng)靶基因、疾病靶點(diǎn)信息，構(gòu)建并繪制藥物與RSA 的“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，展示補(bǔ)腎安胎沖劑中活性成分與RSA 疾病基因的相關(guān)性大小。

4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI 網(wǎng)絡(luò)）的構(gòu)建

將1.3 中獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（http：//www.string-db.org/）建立PPI 網(wǎng)絡(luò)。再將所獲取的信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中，根據(jù)度值（Degree）進(jìn)行精簡(jiǎn)分析，構(gòu)建PPI 核心網(wǎng)絡(luò)。

5 GO 功能富集分析與KEGG 通路分析：

將基因簡(jiǎn)寫（Symbo1）轉(zhuǎn)化為基因ID（EntrezID）后，再通過David 數(shù)據(jù)庫及R 軟件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集及KEGG 通路分析，并繪制相關(guān)通路圖。

6 分子對(duì)接驗(yàn)證

從有機(jī)小分子藥物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem）中獲取PPI 核心網(wǎng)絡(luò)中補(bǔ)腎安胎沖劑對(duì)RSA 相關(guān)靶點(diǎn)活性成分2D 結(jié)構(gòu)，并通過ChemBio3DUltra14.0 軟件將2D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成3D 結(jié)構(gòu)，構(gòu)建小分子配體數(shù)據(jù)庫。再運(yùn)用PyMOL 生信軟件對(duì)核心蛋白受體結(jié)構(gòu)進(jìn)行去除水分子、無效小分子配體等處理。最后運(yùn)用Vina 進(jìn)行分子對(duì)接，獲得補(bǔ)腎安胎沖劑中活性分子與受體蛋白的結(jié)合關(guān)系和結(jié)合位置。

結(jié)果

1 補(bǔ)腎安胎沖劑活性成分的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中設(shè)置OB ≥30%，DL ≥0.18，檢索到化合物：菟絲子11 個(gè)、桑寄生2 個(gè)、續(xù)斷8 個(gè)、黨參21 個(gè)、白術(shù)7 個(gè)、黃芪20 個(gè)、黃芩36 個(gè)、白芍13個(gè)、熟地黃2 個(gè)、苧麻根5 個(gè)、旱蓮草10 個(gè)。刪除重復(fù)化合物和無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的化合物，共獲得110 個(gè)活性成分，部分活性成分見表1。

表1 補(bǔ)腎安胎沖劑部分活性成分信息

2 RSA 疾病基因的篩選

在 G e n e c a r d s、O M I M、T T D、G e n e B a n k、PharmGkb 等 數(shù) 據(jù) 庫 中，以“recurrent spontaneous abortion”“spontaneous abortion”等作為關(guān)鍵詞，檢索獲取RSA 相關(guān)的靶基因。將檢索到的靶基因經(jīng)過取并集去重復(fù)等處理后，共得到2197 個(gè)RSA 相關(guān)基因靶點(diǎn)，繪制Venn 圖見圖1。

圖1 RSA 疾病基因

3 中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫對(duì)疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行基因注釋，將藥物相關(guān)靶點(diǎn)、疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲取補(bǔ)腎安胎沖劑與RSA 的交集靶點(diǎn)共102 個(gè)，包括AKT1、CCND1、MAPK14、TP53 等，并以Venn 圖展示（圖2）。利用Cytoscape 3.8.2 構(gòu)建補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），共涉及81 種活性成分及102 個(gè)潛在靶點(diǎn)。其中圓餅圖代表中藥成分，不同顏色代表不同的中藥，藍(lán)色矩形則代表交集靶點(diǎn)。運(yùn)用CytoNCA工具分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)值，挖掘出中藥作用的核心成分，如槲皮素、木犀草素、山奈酚等。

圖2 補(bǔ)腎安胎沖劑與RSA 的交集靶點(diǎn)Venn 圖

圖3 補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，共得到102 個(gè) 節(jié) 點(diǎn)，1510 條 邊。 將 結(jié)果 導(dǎo) 入Cytoscape 3.8.2 進(jìn)行篩選，共得到28 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，291 條邊，以“Degree”“Betweenness”“Closeness”中 位 值 逐 步篩選，可得到6 個(gè)核心靶點(diǎn)，分別為AKT1、CCND1、MAPK14、TP53、JUN、ESR1，如圖3 所示，這些靶點(diǎn)可視為補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

5 GO 功能富集分析及KEGG 通路分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對(duì)102 個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，共獲得GO 條目1942 條（P＜0.05），其中BP 條目1762 個(gè)，CC 條目32 個(gè)，MF 條目148 個(gè)，各組分排名前10 的條目見圖5。結(jié)果表明，補(bǔ)腎安胎沖劑參與的生物學(xué)過程主要集中在血紅素的結(jié)合、RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合及氧化還原酶活性等。

圖5 補(bǔ)腎安胎沖劑與RSA 交集基因GO 富集分析

KEGG 通路分析共得到157 條信號(hào)通路（P＜0.05），主要包括PI3K-AKT 信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、AGE-RAGE 信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路等，前30 條信號(hào)通路見圖6。

圖6 補(bǔ)腎安胎沖劑與RSA 交集基因KEGG 通路富集分析

6 活性成分與靶點(diǎn)基因的分子對(duì)接驗(yàn)證

運(yùn)用Vina 對(duì)核心網(wǎng)絡(luò)中的6 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與相應(yīng)成分進(jìn)行分子對(duì)接，獲得補(bǔ)腎安胎沖劑中活性分子與受體蛋白的結(jié)合關(guān)系和結(jié)合位置，得到相應(yīng)對(duì)接分?jǐn)?shù)，如表2 所示。一般來說，分值越低，則表明配體與靶蛋白受體結(jié)合越穩(wěn)定[11]。可知，木犀草素（Luteolin）、黃芩素（Baicalein）與AKT1 的結(jié)合性最好（圖7），結(jié)合后呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)。

圖7 木犀草素（上）、黃芩素（下）與AKT1 的分子對(duì)接圖

表2 關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

討論

依據(jù)中醫(yī)理論，RSA 屬中醫(yī)學(xué)“滑胎”“數(shù)墮胎”范疇。中醫(yī)認(rèn)為，該病主要為母體沖任損傷或胎元不健導(dǎo)致，具體又有腎虛、脾腎虧虛、氣血兩虛、血熱、血瘀、肝郁等諸多病因[12]。近代醫(yī)家多認(rèn)為脾腎虧虛是其發(fā)病的重要病機(jī)，臨床多用補(bǔ)腎健脾之法，補(bǔ)腎安胎沖劑亦為該法之重要應(yīng)用。本研究通過利用現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理及分子對(duì)接技術(shù)，嘗試探討補(bǔ)腎安胎沖劑從多成分、多靶點(diǎn)、多途徑共同作用治療RSA 的可能作用機(jī)制。

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

本研究篩選出補(bǔ)腎安胎沖劑核心化合物有白樺脂酸、槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩素等。這些化合物大部分屬于黃酮類化合物，具有抗炎抗菌、抗氧化及調(diào)節(jié)代謝等作用[13]。槲皮素多存在于桑寄生、菟絲子等中藥，研究發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)妊娠小鼠子宮內(nèi)環(huán)境、改善小鼠胚泡著床障礙等作用[14]。木犀草素能通過抑制TNF-α、IL-1β 等的釋放起到抑制炎癥損傷的作用，同時(shí)可調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力[15]。黃芩素可通過提高滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖及侵襲力直接影響胚胎黏附和著床過程[16-17]，且能通過影響CD80/CD86 的表達(dá)建立以Th2 為主的外周特異性免疫耐受[17]。

通 過 構(gòu) 建PPI 網(wǎng) 絡(luò)，發(fā) 現(xiàn)AKT1、CCND1、MAPK14、TP53、JUN、ESR1 是補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA 的核心蛋白。中醫(yī)認(rèn)為，婦人妊娠后，胚胎的發(fā)育全賴母之血以養(yǎng)胎，其生長發(fā)育離不開母血之滋養(yǎng)。AKT1 是PI3K-AKT 信號(hào)通路中極為重要的下游靶激酶，可介導(dǎo)新血管的形成，與中醫(yī)化生氣血以養(yǎng)胎的理念相符。CCND1 為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，研究表明，該蛋白有利于妊娠早期胚胎著床、妊娠建立與維持，而細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)量下降可能是早期自然流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)理之一[18-19]。MAPK 參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)，活化后的MAPK 可快速增加細(xì)胞裂解，從而影響血管生成等方面。前期研究[11]表明，補(bǔ)腎安胎沖劑可通過提高RAS 及MAPK 蛋白水平的表達(dá)以達(dá)到促進(jìn)母胎界面血管生成的作用。研究[19-20]表明，TP53 在URSA 患者絨毛組織中呈高表達(dá)，其可阻斷細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡明顯，而敲除TP53 可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和抑制細(xì)胞凋亡。有學(xué)者指出，JUN 的表達(dá)增加可以增加滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲，胚泡著床后，其表達(dá)較正常內(nèi)膜增加[21]。同時(shí)，ESR1 基因多態(tài)性亦可增加RSA 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[22]。

GO 功能富集及KEGG 分析表明，補(bǔ)腎安胎沖劑可通過參與多種生物學(xué)過程及多個(gè)信號(hào)通路治療RSA。KEGG 分析得出信號(hào)通路主要包括PI3K-AKT信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、AGE-RAGE 信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路等，與前期研究結(jié)果[23-24]]大致相符。亦有研究[25]表明，調(diào)控AGE-RAGE 信號(hào)通路也能對(duì)子鼠發(fā)育及出生異常起到明顯的保護(hù)作用。p53 是與生育、生殖等多種生物學(xué)過程相關(guān)的腫瘤抑制因子，其可通過參與多種信號(hào)通路介導(dǎo)蛻膜化受損，影響胚胎著床從而導(dǎo)致RSA 的發(fā)生[26]。同時(shí)，Th17/Treg 及IL-17 高表達(dá)導(dǎo)致的免疫平衡失調(diào)是URSA 發(fā)生的原因之一[27]。

運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)，選取預(yù)測(cè)靶點(diǎn)最多的活性成分木犀草素及黃芩素為配體，選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中degree最大的靶點(diǎn)AKT1 為受體。結(jié)果顯示木犀草素、黃芩素能夠穩(wěn)定對(duì)接到AKT1 的蛋白結(jié)構(gòu)上。結(jié)果顯示篩選的靶點(diǎn)受體蛋白與活性成分具有較好的結(jié)合活性。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，另辟蹊徑，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接層面進(jìn)行研究，進(jìn)一步探明補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA 的內(nèi)在機(jī)制。結(jié)果表明補(bǔ)腎安胎沖劑主要通過槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩素等多種活性成分作用于AKT1、CCND1、MAPK14、TP53、JUN、ESR1 等基因，通過調(diào)控多種生物學(xué)功能和多條信號(hào)通路，從而起到治療RSA 的作用，揭示了補(bǔ)腎安胎沖劑具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制，為深入研究補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA 的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為其臨床應(yīng)用提供一定的參考價(jià)值。