張 莉 湯加勇 賈 剛 田 剛 劉光芒 陳小玲 蔡景義 趙 華

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130)

作為節(jié)糧型草食性動(dòng)物，家兔是我國(guó)畜牧業(yè)重要組成部分。家兔腸道健康是制約其生產(chǎn)的重要原因之一，使用抗生素在抑制腸道有害菌生長(zhǎng)的同時(shí)也抑制有益菌生長(zhǎng)，造成腸道微生物菌群失調(diào)，且誘發(fā)更多的耐藥菌，危害生態(tài)環(huán)境。隨著飼料行業(yè)禁抗的推行，尋找代替抗生素提高家兔抗病能力的飼用添加劑是促進(jìn)兔業(yè)持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一?？咕氖且活悘V泛存在于生物體內(nèi)的陽(yáng)離子兩親性小分子多肽，通常由12～100個(gè)氨基酸組成，具有耐熱、耐酸堿、廣譜抗菌和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[1]。根據(jù)來(lái)源可分為細(xì)菌抗菌肽、植物抗菌肽、昆蟲抗菌肽、水生抗菌肽、動(dòng)物抗菌肽等；根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為蛙皮類、防御素類、天蠶類和蜂毒類等?？咕氖莿?dòng)物非特異性免疫的重要成分，同時(shí)在體液免疫中也起著重要作用，且不同抗菌肽其抗菌范圍不同。鯰魚抗菌肽parasin Ⅰ是從受傷鯰魚上皮黏膜中分離得到，由19個(gè)氨基酸組成[2]，具有高效殺菌效果且無(wú)溶血性，其抗菌效果是蛙皮素maganin 2的12～100倍，是蟾蜍胃抗菌肽buforin Ⅰ的8倍[3]。研究發(fā)現(xiàn)，鯰魚抗菌肽parasin Ⅰ可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等有害菌的生長(zhǎng)[4]?？咕闹饕饔糜诩?xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的分子效應(yīng)器，其在進(jìn)入動(dòng)物腸道后可有效抑制有害菌的生長(zhǎng)并促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能和腸道健康[5]。

目前，在豬、禽和反芻動(dòng)物上的研究均表明抗菌肽可提高牲畜生長(zhǎng)性能，改善腸道微生物組成，促進(jìn)腸道健康[6-7]，而在家兔上的研究相對(duì)較少。生物蛋白API為本課題組成功設(shè)計(jì)表達(dá)的包含鯰魚抗菌肽parasin Ⅰ功能片段的基因工程蛋白，其對(duì)家兔的生長(zhǎng)性能及腸道健康等是否有效還有待進(jìn)一步研究。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加不同水平API在對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能、空腸消化酶活性、盲腸發(fā)酵產(chǎn)物及微生物組成以及空腸緊密連接蛋白和免疫細(xì)胞因子相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響，為其在家兔飼糧中的應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

API為本實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建的畢赤酵母陽(yáng)性菌株表達(dá)的上清液，伊拉商品肉兔購(gòu)自雅安市天全縣華聯(lián)兔業(yè)農(nóng)民專業(yè)合作社。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取30日齡健康且體重[(644.93±31.92) g]相近的斷奶伊拉商品肉兔144只，根據(jù)平均體重隨機(jī)分為4組，每組18個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只兔。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.1、0.5和1.0 mg/kg API。試驗(yàn)期8周?；A(chǔ)飼糧參照NRC(1994)營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制，飼糧類型為4.0 mm顆粒料?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content磷酸氫鈣 CaHPO41.00氯化鈉 NaCl0.30預(yù)混料 Premix1)0.50合計(jì) Total100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)10.34粗蛋白質(zhì) CP16.01粗脂肪 EE4.25淀粉 Starch16.29粗纖維 CF15.27中性洗滌纖維 NDF33.49酸性洗滌纖維 ADF18.75酸性洗滌木質(zhì)素 ADL4.26鈣 Ca0.92總磷 TP0.54有效磷 AP0.41賴氨酸 Lys0.82蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.52蘇氨酸 Thr0.62

1.3 飼養(yǎng)管理

肉兔飼養(yǎng)試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所教學(xué)科研基地進(jìn)行。試驗(yàn)前清洗兔舍和用具并用甲醛進(jìn)行熏蒸消毒。肉兔飼養(yǎng)于3層金屬籠中，兔舍溫度控制在15～22 ℃，相對(duì)濕度66%～78%，自然采光并保證適宜通風(fēng)，每天飼喂5次(07:30、10:00、13:00、15:00、18:30)，自由飲水。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能與健康狀況

試驗(yàn)期間，以重復(fù)為單位，記錄各組肉兔每周的給料量、廢料量和余料量；分別于第1天、第28天和第56天對(duì)肉兔空腹稱重。計(jì)算各組肉兔平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。每日觀察并記錄肉兔腹瀉和死亡情況，計(jì)算肉兔腹瀉率、死亡率和健康風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)[8]。

1.4.2 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，按平均體重選取24只健康肉兔(每組6只)，屠宰后立即取出盲腸，用pH計(jì)(PHSJ-3D)測(cè)定盲腸食糜pH，取前、中、后3處測(cè)定后計(jì)算平均值。同時(shí)快速分離腸段，取空腸黏膜、盲腸食糜于凍存管中，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 空腸消化酶活性測(cè)定

空腸黏膜的淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 盲腸發(fā)酵產(chǎn)物及微生物組成測(cè)定

盲腸食糜中的揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)含量用CP-3800型氣相色譜儀測(cè)定，氨態(tài)氮(NH3-N)含量用比色法測(cè)定[9]。盲腸食糜微生物總DNA采用糞樣DNA提取試劑盒(No.D4015-01，Omega)提取，用SYBRTMGreen染色法(No.RR820A，TaKaRa，10 μL體系)對(duì)總菌和大腸桿菌數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，用TaqMan法對(duì)乳酸桿菌數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5 空腸緊密連接蛋白和免疫相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

采用RNAiso Plus(No.9109，TaKaRa)提取空腸黏膜總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit(No.RR047A，TaKaRa)把RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；用SYBR?Primix Ex TaqTMⅡ (No.RR820A，TaKaRa，10 μL體系)對(duì)緊密連接蛋白[封閉蛋白-1(Claudin-1)、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、閉鎖小帶蛋白-2(ZO-2)]和免疫相關(guān)基因[(白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量(QuantStudio 6，ABI)PCR，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算分析。定量引物序列用Primer Express 3.0設(shè)計(jì)，并送至上海生工生物公司合成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行初步整理，對(duì)發(fā)病率、死亡率和健康風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)其他指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計(jì)顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 API對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能和健康狀況的影響

由表2可知，飼糧中添加API對(duì)肉兔末重、ADFI、ADG和F/G無(wú)顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，飼糧中添加API可降低肉兔腹瀉率，0.1 mg/kg API組腹瀉率降低了39.99%，0.5和1.0 mg/kg API組腹瀉率均降低了30.02%；飼糧中添加1.0 mg/kg API可降低肉兔死亡率和健康風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)，分別降低了37.49%和33.34%。

表2 API對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能和健康情況的影響

2.2 API對(duì)肉兔盲腸發(fā)酵產(chǎn)物和微生物組成的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.1 mg/kg API可顯著提高盲腸丙酸比例(P<0.05)；飼糧中添加0.5和1.0 mg/kg API對(duì)盲腸丙酸比例無(wú)顯著影響(P>0.05)，但在數(shù)值上有所降低。飼糧中添加API對(duì)盲腸pH、NH3-N含量、總揮發(fā)性脂肪酸含量、乙酸比例和丁酸比例無(wú)顯著影響(P>0.05)；但飼糧中添加0.5和1.0 mg/kg API組盲腸NH3-N含量在數(shù)值上均低于對(duì)照組，且盲腸NH3-N含量隨飼糧中API添加水平增加而降低。與對(duì)照組相比，飼糧中添加API可降低盲腸大腸桿菌數(shù)量，其中1.0 mg/kg API組盲腸大腸桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)。飼糧中添加API對(duì)盲腸總菌和乳酸桿菌數(shù)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表3 API對(duì)肉兔盲腸發(fā)酵產(chǎn)物和微生物組成的影響

2.3 API對(duì)肉兔空腸緊密連接蛋白相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加API可提高空腸Claudin-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，且空腸Claudin-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量隨飼糧中API添加水平增加而升高，其中1.0 mg/kg API組顯著升高(P<0.05)。飼糧中添加API對(duì)空腸ZO-1和ZO-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.4 API對(duì)肉兔空腸免疫相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加API可提高空腸IL-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量，其中0.5和1.0 mg/kg API組顯著升高(P<0.05)。飼糧中添加API對(duì)空腸IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.5 API對(duì)肉兔空腸消化酶活性的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加1.0 mg/kg API可顯著提高空腸淀粉酶活性(P<0.05)；飼糧中添加0.1、0.5和1.0 mg/kg API均可顯著提高空腸脂肪酶和胰蛋白酶活性(P<0.05)，其中空腸脂肪酶活性分別提高了97.81%、49.07%、45.59%，空腸胰蛋白酶活性分別提高了41.16%、57.26%、55.50%。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

圖2 API對(duì)肉兔空腸免疫相關(guān)基因

3 討 論

動(dòng)物生產(chǎn)中大量使用抗生素降低動(dòng)物自身免疫力并干擾腸道菌群穩(wěn)態(tài)，抗生素殘留導(dǎo)致有害菌耐藥性提高。因此，在飼料禁抗后，研發(fā)無(wú)毒副作用的飼用抗生素替代物是畜牧業(yè)當(dāng)前重要的任務(wù)之一。有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加適量抗菌肽具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和改善健康的作用。其中，抗菌肽plectasin可促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)性能[10]，抗菌肽PBD-ml和LUC-n可提高山羊飼料利用率，改善生長(zhǎng)性能[6]。也有研究表明抗菌肽對(duì)正常生理狀態(tài)下仔豬的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響[11]，但能顯著提高大腸桿菌攻毒條件下斷奶仔豬的ADG[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加API對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，有不同程度降低腹瀉率的作用，當(dāng)添加高水平(1.0 mg/kg)API時(shí)，其健康風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)最低。這表明API對(duì)肉兔的健康狀況有一定的改善作用，本結(jié)果與復(fù)合抗菌肽CAP提高仔豬抗病能力和降低腹瀉率結(jié)果[13]相類似。

表4 API對(duì)肉兔空腸消化酶活性的影響

肉兔腹瀉主要原因是腸道菌群紊亂，其中盲腸中大腸桿菌是引起腹瀉的主要細(xì)菌之一?？咕腗ccJ 25可減少肉雞腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量，增加乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量[14]；也有研究表明抗菌肽可抑制有害菌的生長(zhǎng)，但對(duì)有益菌的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響[15]。本研究中，隨著飼糧中API添加水平的增加，肉兔盲腸大腸桿菌的數(shù)量逐漸降低，表明API能很好地抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。同時(shí)，盲腸微生物生長(zhǎng)繁殖與NH3-N和VFA密切相關(guān)。因?yàn)镹H3-N是盲腸內(nèi)微生物生長(zhǎng)的氮源，其含量降低有利于抑制有害菌的繁殖[16]；VFA(包含乙酸、丙酸和丁酸)是微生物分解碳水化合物的產(chǎn)物，能反映微生物發(fā)酵能力且具有抗炎抗菌的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.5和1.0 mg/kg API降低了盲腸NH3-N含量，飼糧中添加0.1 mg/kg API提高了盲腸丙酸比例，這預(yù)示著API有提高肉兔盲腸微生物發(fā)酵能力的作用。以上結(jié)果表明，飼糧中添加中、高水平(0.5和1.0 mg/kg)API在一定程度上可降低盲腸NH3-N含量，降低微生物生長(zhǎng)的氮源，從而抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，改善盲腸的微生物菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低肉兔的腹瀉率和死亡率。

腸上皮機(jī)械屏障是防止有毒物質(zhì)入侵機(jī)體的屏障之一，腸上皮細(xì)胞旁間隙由連接復(fù)合體封閉，其最重要的組成結(jié)構(gòu)是緊密連接蛋白，如Claudin-1、ZO-1和ZO-2。Claudin-1與腸上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道的形成相關(guān)，對(duì)維持腸上皮細(xì)胞屏障的完整性及其功能至關(guān)重要[18]。ZO-1是緊密連接蛋白的骨架蛋白，常作為評(píng)價(jià)腸道屏障功能和通透性的指標(biāo)[19]。緊密連接蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量的減少可導(dǎo)致膜通透性增加，從而破壞腸道屏障功能。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加API可上調(diào)肉兔空腸Claudin-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，且一定程度地上調(diào)ZO-1、ZO-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量，與前人的研究結(jié)果[20]一致。這表明API的攝入在一定程度上可降低空腸上皮通透性，改善其機(jī)械屏障功能，改善腸道健康，從而上調(diào)了緊密連接蛋白的表達(dá)。

抗菌肽在腸道中除增強(qiáng)機(jī)械屏障作用外，還有增強(qiáng)腸道黏膜免疫屏障的作用[21]。腸道不僅是機(jī)體的消化器官，也是機(jī)體重要的免疫器官。IL-2可增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性，對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)至關(guān)重要；IL-6具有促進(jìn)體液免疫的作用[22]。在魚類上的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽hepcidin對(duì)斑馬魚肝臟、脾臟、腎臟的IL-2表達(dá)均有調(diào)節(jié)作用[23]?？咕膕ublancin可提高小鼠脾臟IL-2的表達(dá)[22]。本研究中，飼糧中添加不同水平API均可上調(diào)肉兔空腸IL-2和IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量，且顯著上調(diào)IL-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量，這表明API的攝入可通過抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)來(lái)增強(qiáng)腸道的免疫屏障功能，改善腸道健康，從而上調(diào)了免疫因子的表達(dá)。

淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶是小腸中主要的消化酶，其活性的高低可反映動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力。腸道消化酶活性和腸道屏障完整性、腸道微生物平衡之間密切相關(guān)。本試驗(yàn)中，飼糧中添加不同水平API可不同程度地提高肉兔空腸淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性，這與抗菌肽surfactin提高羅非魚腸道消化酶活性研究結(jié)果[24]一致。這表明API的攝入在一定程度上改善了腸道健康，從而提高了腸道的消化酶活性。在本研究中，API的攝入可通過抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)來(lái)增強(qiáng)腸道的機(jī)械屏障和免疫屏障功能，從而改善腸道健康，提高腸道消化酶活性，促進(jìn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

4 結(jié) 論

飼糧中添加API雖然對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，但可抑制盲腸大腸桿菌生長(zhǎng)，改善盲腸微生物平衡；飼糧中API添加水平在1.0 mg/kg時(shí)，肉兔的健康風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)最低，空腸Claudin-1、IL-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，空腸淀粉酶和胰蛋白酶活性也相對(duì)較高。因此，在本試驗(yàn)條件下，飼糧中API添加水平為1.0 mg/kg時(shí)對(duì)肉兔的腸道健康改善效果最佳。