劉聰，衣丹，柴迎梅，叢柏林*

（1.山東 大學(xué) 海洋學(xué)院,山東 威海 264200；2.自然資源部第一海洋研究所,山東 青島 266061）

三（2-氯乙基）磷酸酯（Tris（2-carboxyethyl）phosphine，TCEP），分子式為C6H12Cl3O4P，分子量為285.31，屬于有機(jī)磷酸酯（organophosphate esters，OPEs）。2017 年7 月底TCEP 在內(nèi)的7 種有機(jī)磷酸酯類阻燃劑被聯(lián)合國環(huán)境署國際化學(xué)污染小組列在45 種內(nèi)分泌干擾物（Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs）清單中[1]。EDCs 作為類激素，在生物體內(nèi)較低劑量也能產(chǎn)生較強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)[2]。多種EDCs 通過各種途徑匯集于水體環(huán)境后會通過食物鏈的生物濃縮和放大效應(yīng)對水體生物和養(yǎng)殖動物產(chǎn)生影響[3]。目前隨著使用量的增加及在不同水體環(huán)境中的積累，TCEP 已成為各水系中普遍存在的新型污染物，其危害已被廣泛關(guān)注[4-9]。目前包括TCEP 在內(nèi)的OPEs 類化合物的毒性研究剛剛開始，相應(yīng)的環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的缺乏阻礙了對這類化合物進(jìn)行高效化學(xué)污染管理。而TCEP 這類物質(zhì)在自然界中穩(wěn)定存在，且能毒性累積，針對其大量使用的現(xiàn)狀，我們急需認(rèn)清TCEP 的環(huán)境毒性[10]。TCEP 可對多種生物產(chǎn)生危害，如TCEP 會造成魚類內(nèi)分泌干擾毒性以及神經(jīng)毒性[11-12]，還會造成鮭魚（Oncorhynchus keta）氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化[13-14]。在無脊椎動物中，TCEP 會造成線蟲（Caenorhabditis Elegans）運(yùn)動能力下降，損害線蟲神經(jīng)元，同時具有誘發(fā)帕金森病的神經(jīng)毒性[15]。在哺乳動物中，TCEP 可造成大鼠（Rattus norvegicus）肝腎免疫器官毒理損傷[16]，造成小鼠（Mus culus）氧化應(yīng)激和內(nèi)分泌紊亂[17]。由此可見，TCEP 可造成多種動物內(nèi)分泌干擾及免疫器官損害。

大菱鲆（Scophthalmus maximus）俗稱“多寶魚”，肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)高、易消化、經(jīng)濟(jì)效益高，是國內(nèi)外公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)海水養(yǎng)殖魚類[18-19]。它屬冷水性魚類，對海水水質(zhì)要求較高[20]。隨著工業(yè)及生活污水排放量的增加，海水中累積的各類污染物給大菱鲆養(yǎng)殖行業(yè)帶來了嚴(yán)重威脅。目前，常見的農(nóng)藥殘留、重金屬污染等危害已被廣泛關(guān)注和研究，并采取了相應(yīng)解決措施，而近些年來出現(xiàn)的新型污染物對大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的潛在危害尚未被完全認(rèn)知。TCEP 對大菱鲆免疫的影響尚未見報道。

近年來隨著TCEP 使用量增加，在海水中監(jiān)測到的積累量不斷升高，對大菱鲆等海水養(yǎng)殖魚類的威脅性增加。我們通過測定大菱鲆的TCEP 半致死濃度（lethal concentration 50%，LC50）[21]以及安全濃度（safe concentration，SC）[21]，評估TCEP 對大菱鲆的生物毒性效應(yīng)，這是毒理學(xué)研究的有效方法。已有研究表明，腫瘤壞死因子alpha (TNF-α) 基因在脂多糖LPS 刺激虹鱒（Oncorhynchus mykiss）巨噬細(xì)胞反應(yīng)和組織相容性復(fù)合體alpha (MHC-Ⅱ α)基因表達(dá)時起增強(qiáng)劑的作用[22]。在牙鲆（Paralichthys olivaceus）、金槍魚（Thunnus albacores）和斑馬魚（Danio rerio）等硬骨魚不同器官中，MHC-Ⅱ α和TNF-α的基因表達(dá)具有相關(guān)性[23-25]。所以我們將免疫相關(guān)因子MHC-Ⅱ α和TNF-α[26-29]作為共同生物標(biāo)志物，評估TCEP 對大菱鲆免疫系統(tǒng)的影響。以期為大菱鲆健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)，為大菱鲆環(huán)境污染物檢測提供分子標(biāo)記參考。

1 材料和方法

1.1 樣品和試劑

實驗用大菱鲆于2019 年10 月11 日購于山東煙臺宗哲水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，大菱鲆幼魚先后2 批共400 條，生長期4 個月，未達(dá)到性成熟，單條體長（17±2） cm，體重（56±4） g，用于測定半致死濃度LC50及免疫相關(guān)基因變化；大菱鲆成魚1 批，共50 條，生長期1 a，已達(dá)到性成熟，單條體重約600 g，約為幼魚的10 倍，用于測定半致死濃度LC50。實驗用海水在膠州灣岸邊由水泵抽取，并用紗布進(jìn)行過濾除去雜質(zhì)。實驗室內(nèi)大菱鲆的培養(yǎng)條件為鹽度（34.2±0.2）、溫度（16±2）℃、pH（7.8±0.2）、溶氧質(zhì)量濃度（7.5±0.2） mg/L。在實驗室培養(yǎng)條件下養(yǎng)殖7 d 后開始實驗，利用TCEP 進(jìn)行脅迫處理。實驗開始前2 d 停止喂食，停食期間大菱鲆無死亡。實驗動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。三(2-氯乙基)磷酸酯（TCEP）購于上海麥克林生化科技有限公司，純度99%（CAS 編號：115-96-8）。

1.2 TCEP 對大菱鲆的半致死濃度LC50 和安全濃度的測定

半致死濃度（LC50）是衡量水體中污染物對生物毒性大小的重要參數(shù)，安全濃度（SC）是指長期暴露但不會產(chǎn)生不良效應(yīng)的指標(biāo)。

2003 年Fisk 等研究添加TCEP 對魚類96 h 的LC50數(shù)據(jù)范圍為6.30～250.00 mg/L[30]。我們在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了預(yù)實驗，并結(jié)合所購買的TCEP 的質(zhì)量濃度(1.39 g/mL)，將實驗組TCEP 質(zhì)量濃度分別設(shè)定為83.40 mg/L、97.30 mg/L、132.10 mg/L、152.90 mg/L、187.70 mg/L、197.40 mg/L 和228.20 mg/L。取8 個68 L 培養(yǎng)箱，分別注入30 L 過濾海水，每個培養(yǎng)箱放置10 條大菱鲆幼魚，實驗組加入不同質(zhì)量濃度梯度的TCEP，對照組不添加TCEP。添加TCEP 時少量多次添加、不斷攪拌致溶液呈透明，水面無油滴狀，保證其在海水中充分溶解。在實驗過程中實驗組每隔24 h 觀測記錄一次大菱鲆的死亡率，對照組大菱鲆未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

統(tǒng)計不同質(zhì)量濃度梯度TCEP 處理大菱鲆幼魚24 h、48 h、72 h 和96 h 時的死亡數(shù)量，通過寇氏法[31]計算半致死濃度LC50及標(biāo)準(zhǔn)誤。采用24 h 時幼魚的TCEP 半致死濃度對40 條大菱鲆成魚進(jìn)行毒性試驗。安全濃度（SC，mg/L）采用Turubell 氏公式[31]計算：

式中：A為24 h LC50；B為48 h LC50。數(shù)據(jù)統(tǒng)計和計算采用Excel 軟件[32]，數(shù)值=平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。

1.3 MHC-Ⅱ α和TNF-α 基因表達(dá)的測定

魚類主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和激發(fā)機(jī)體特異性免疫反應(yīng)[26]。MHCⅡ類分子不僅能識別和清除抗原，還參與和調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)[27]。魚類MHCⅡ類分子主要由α 鏈和β 鏈異二聚體組成，與哺乳動物的MHC-Ⅱ α 在跨膜區(qū)保守區(qū)存在差異[28]。腫瘤壞死因子α（TNF-α）主要存在于動物血清中，具有殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[29]。

根據(jù)我們測定獲得的24 h 時TCEP LC50，設(shè)置實驗組的TCEP 質(zhì)量濃度分別為，設(shè)不添加TCEP 的海水對照組。每個箱內(nèi)放入14 條大菱鲆幼魚。在TCEP處理3 h、6 h、12 h 和24 h 后，從各實驗組隨機(jī)撈取3 條幼魚，經(jīng)20 mg/L 丁香酚麻醉后[33]，取脾臟、頭腎、鰓和腸，取樣后將3 條魚的相同組織混合，立刻用液氮冷凍。采用Trizol?Reagent（上海Invitrogen 公司生產(chǎn)，編號15 596 026）和PrimeScript RT?reagent kit with gDNA Eraser（大連Takara 公司生產(chǎn)，編號RR047A），參照說明書提取大菱鲆幼魚的mRNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

利用Primer5.0 軟件設(shè)計β-actin，MHC-II ɑ和TNF-ɑ基因（Gene Bank 序列號分別為AY008305.1，DQ094170.1，F(xiàn)J654645.1）的引物[34]：β-actinF:TGTCCCTGTATGCCTCTGGTCG，β-actinR:CAGTGGTGGTGAAGGAGTAGCC，MHC-II ɑF:CTCAACATTCCCTATCCCAACA，MHC-II ɑR:CAATAGTCAGACCCAGTCCACA，TNF-ɑF:CACAG GATATGGCGGTACTCG，TNF-ɑR:AGCTCGGACAGCATGTTGGT。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

將同一條件下處理的3 條幼魚不同組織所獲得的cDNA 混合后作為模板，采用MX3005P 熒光定量儀（美國Stratagene 公司生產(chǎn)）進(jìn)行實時熒光定量PCR（quantitative reverse transcription-PCR,qRT-PCR）分析。采用SYBR Premix Ex Taq II（大連Takara 公司生產(chǎn)，編號RR820A）試劑盒，擴(kuò)增體系：SYBR?Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×），10μL；PCR Forward Primer（10μmol/L），0.8μL； PCR Reverse Primer（10μmol/L），0.8μL ；ROX Reference Dye（50×），0.4μL； 1× DNA 模板，2.0μL； dH2O（滅菌蒸餾水） 6.0μL；總計20.0μL 的體系。擴(kuò)增條件：預(yù)變性 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40 個循環(huán)；熔解曲線分析 95 ℃ 1 min，55 ℃30 s，95 ℃ 30 s。采用MxPro 軟件包對溶解曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析[35]，MHC-II ɑ，TNF-ɑ和β-actin基因的溶解曲線呈單一峰值，且熒光定量Ct 值范圍為15～35，說明qRT-PCR 實驗體系可靠。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt方法[36]計算MHC-Ⅱ α和TNF-ɑ基因相對表達(dá)量，數(shù)值=平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。采用SPSS 17.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗[37]，p<0.05 為顯著性差異，p<0.01 為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCEP 對大菱鲆的LC50 和安全濃度的影響

不同質(zhì)量濃度梯度TCEP 條件下24 h、48 h、72 h 和96 h 的大菱鲆幼魚死亡率數(shù)據(jù)見表1。幼魚死亡率隨TCEP 質(zhì)量濃度的增加而升高。24 h、48 h、72 h 和96 h 時大菱鲆幼魚死亡率曲線見圖1。

圖1 不同TCEP 質(zhì)量濃度梯度和處理時間對大菱鲆幼魚死亡率的影響Fig.1 Effect of TCEP concentrations and treatment times on the mortality rate of Scophthalmus maximus

表1 不同質(zhì)量濃度梯度TCEP 脅迫大菱鲆幼魚的死亡率Table 1 Death rate of juvenile Scophthalmus maximus treated with different mass concentrations gradient of TCEP

通過寇氏法[31]計算表中數(shù)據(jù)可知，大菱鲆幼魚在TCEP 處理24 h、 48 h、72 h 和96 h 時的LC50分別為190.76 mg/L（24 h）、159.94 mg/L（48 h）、140.70 mg/L（72 h）和110.71 mg/L（96 h）。標(biāo)準(zhǔn)誤分別為0.027 2、0.012 1、0.012 0、0.015 4。對照組大菱鲆幼魚無死亡現(xiàn)象。以190.76 mg/L 質(zhì)量濃度的TCEP 處理大菱鲆成魚24 h 時，其死亡數(shù)量正好達(dá)到全部大菱鲆成魚數(shù)量的50%，說明大菱鲆成魚和幼魚的LC50相當(dāng)。根據(jù) Turubell 氏公式計算得ρSC為33.60 mg/L。

2.2 TCEP 對大菱鲆幼魚MHC-Ⅱ α和TNF-α 基因表達(dá)的影響

2.2.1MHC-Ⅱ α基因的表達(dá)

添加不同質(zhì)量濃度TCEP 脅迫處理的大菱鲆免疫相關(guān)組織中MHC-Ⅱ α基因表達(dá)變化如圖2 所示。分別添加23.85 mg/L、47.69 mg/L 和95.38 mg/L 的TCEP 后，3 h、6 h、12 h 和24 h 時內(nèi)大菱鲆幼魚脾臟、頭腎、鰓和腸組織中的MHC-Ⅱ α基因相對表達(dá)量較對照組都顯著或極顯著提高。

圖2 大菱鲆主要組織相容性復(fù)合體基因MHC-Ⅱ α 在脾臟、頭腎、鰓和腸組織中隨脅迫時間的相對表達(dá)（*表示p<0.05，**表示p<0.01，n=3）Fig.2 Relative expression of MHC-Ⅱ α in spleen,anterior kidney,gill and intestines of Scophthalmus maximus with different stress times(* is p<0.05,** is p<0.01,n=3)

在脾臟中，隨TECP 質(zhì)量濃度升高和脅迫時間延長，MHC-Ⅱ α基因相對表達(dá)量總體上呈現(xiàn)上升趨勢；TECP 質(zhì)量濃度為的處理組的上升幅度高于的處理組。脾臟中脅迫3 h 時TECP 質(zhì)量濃度為的處理組MHC-Ⅱ α表達(dá)上升極顯著（p<0.01），TECP 質(zhì)量濃度為的處理組MHC-Ⅱ α表達(dá)顯著上升（p<0.05）；脅迫6 h 時與3 h 時類似，但是TECP 質(zhì)量濃度為的處理組MHC-Ⅱ α表達(dá)上升極顯著（p<0.01）；脅迫12 h 時，只有在的處理組MHC-Ⅱ α表達(dá)上升極顯著；TECP 質(zhì)量濃度為的處理組中，24 h 時表達(dá)量達(dá)到最高值。

在頭腎組織中，MHC-Ⅱ α基因相對表達(dá)量總體上呈現(xiàn)上升趨勢，在TECP 質(zhì)量濃度為的處理組中上升幅度最大，在24 h 時相對表達(dá)量達(dá)到最高值。在鰓組織中，MHC-Ⅱ α基因相對表達(dá)量總體上呈現(xiàn)先上升后下降和持續(xù)上升兩種分化趨勢，在脅迫6 h 時47.69 mg/L 和95.38 mg/L 的處理組中達(dá)到最高值，但隨著時間延長，12 h 以后相對表達(dá)量開始下降，在TECP 質(zhì)量濃度為的處理組MHC-Ⅱ α表達(dá)上升極顯著（p<0.01），而TECP 質(zhì)量濃度為的處理組MHC-Ⅱ α表達(dá)上升（p<0.05）；脅迫24 h 與脅迫 12 h 的趨勢變化一致。在腸組織中MHC-Ⅱ α基因相對表達(dá)量總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在處理組中變化幅度較大，3 h 的相對表達(dá)量與6 h 相近，6 h 時相對表達(dá)量達(dá)到最高值，在24 h 時相對表達(dá)量降低。在受到TCEP 脅迫后，實驗組中MHC-Ⅱ α基因的表達(dá)量顯著提高，隨TCEP 的質(zhì)量濃度升高，MHC-Ⅱ α基因在較高濃度和的處理組中表達(dá)量變化明顯，反映出高質(zhì)量濃度的TCEP 對免疫系統(tǒng)的影響更明顯；而在脅迫時間超過12 h 時，表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，可能是免疫系統(tǒng)受到的損傷無法及時復(fù)原，導(dǎo)致免疫反應(yīng)的強(qiáng)度下降。

2.2.2TNF-α基因的相對表達(dá)

添加不同質(zhì)量濃度TCEP 脅迫處理的大菱鲆免疫相關(guān)組織中TNF-ɑ基因表達(dá)變化如圖3 所示。在分別添加23.85 mg/L、47.69 mg/L 和95.38 mg/L 的TCEP 后，3 h、6 h、12 h 和24 h 時內(nèi)大菱鲆幼魚脾臟、頭腎、鰓和腸組織中的TNF-ɑ基因相對表達(dá)量較對照組都顯著提高（p<0.05）。

圖3 TNF-ɑ基因在大菱鲆脾臟、頭腎、鰓和腸組織中隨脅迫時間的相對表達(dá)（*表示p<0.05，**表示p<0.01，n=3）Fig.3 Relative expression of TNF-ɑ in spleen,anterior kidney,gill and intestines of Scophthalmus maximus with different stress times(*is p<0.05,** is p<0.01,n=3)

在脾臟中，隨TECP 質(zhì)量濃度升高和脅迫時間延長，TNF-ɑ基因相對表達(dá)量總體上呈現(xiàn)先上升后下降和波浪式的趨勢，TECP 質(zhì)量濃度為的處理組中變化最為明顯，在12 h 時表達(dá)量達(dá)到最高值，24 h 時相對表達(dá)量下降；在脅迫3 h 和6 h 的TECP 質(zhì)量濃度為的處理組TNF-ɑ基因表達(dá)呈顯著性變化。

在頭腎組織中，TNF-ɑ基因相對表達(dá)量在TECP 質(zhì)量濃度為處理組中變化較為明顯，在12 h 時相對表達(dá)量達(dá)到最高值，24 h 之后相對表達(dá)量下降。在鰓組織中，TNF-ɑ基因相對表達(dá)量總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在脅迫6 h 時各處理組中都達(dá)到最高值，隨著時間延長相對表達(dá)量開始下降，24 h 時表達(dá)量極低。在腸組織中，TNF-ɑ基因相對表達(dá)量在TCEP 質(zhì)量濃度為處理組中呈現(xiàn)上升趨勢，在TCEP 質(zhì)量濃度為處理組中呈現(xiàn)下降趨勢；脅迫3 h 和6 h 的TECP 質(zhì)量濃度為處理組的TNF-ɑ基因表達(dá)變化不呈顯著性，其余處理組都呈顯著或極顯著變化（p<0.05）。

在受到TCEP 脅迫后，實驗組中TNF-ɑ基因與MHC-Ⅱ α基因的表達(dá)量變化趨勢相似，隨TCEP 的質(zhì)量濃度升高，TNF-ɑ基因在較高質(zhì)量濃度的處理組中表達(dá)量變化幅度更大，而在脅迫時間超過12 h 時，TNF-ɑ基因表達(dá)量呈現(xiàn)出下降的趨勢，可能與免疫系統(tǒng)受到的損傷無法及時復(fù)原相關(guān)。

3 討論

內(nèi)分泌干擾物是指環(huán)境中存在的能夠干擾生物體內(nèi)源激素的合成、釋放、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合、作用或清除，從而影響機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、生殖、發(fā)育及行為的外源性物質(zhì)[38]。TCEP 是一種新型的內(nèi)分泌干擾物，屬于有機(jī)磷酸酯（OPEs），主要作為阻燃劑添加到塑料產(chǎn)品、紡織品、電器設(shè)備、家具及建筑物中[39-40]。TCEP 的廣泛應(yīng)用使其在環(huán)境中不斷累積。2011 年英國亞爾河水中檢出了質(zhì)量濃度極高的OPEs（平均為6 350 ng/L）[4]。2015 年德國、奧地利、西班牙、意大利、美國、日本等多個國家的地表水中，OPEs 的質(zhì)量濃度范圍為76～2 230 ng/L[5]，其中TCEP 都是主要污染組分。地表水中的部分OPEs 隨河流入海，德國易北河和萊茵河排放入北海的包括TCEP 在內(nèi)的OPEs 分別可達(dá)5.5 和42.5 t/a[6]。2014 年的調(diào)查數(shù)據(jù)中，我國珠江入?？诳?OPEs 質(zhì)量濃度達(dá) 3.120 ng/L，其中TCEP 和 TCPP（磷酸三（2-氯丙基）脂）為主要污染物[7]；2015年我國黃、渤海 40 條入海河流中，包括TCEP、TCPP 和TPPO（三（N,N-四亞甲基）磷酸胺）在內(nèi)的12 種OPEs 在河流中的總OPEs 質(zhì)量濃度范圍為 9.6～1 549.0 ng/L，OPEs 中含氯的TCEP、TCPP 及 TPPO 為主要污染物[8]。還有研究發(fā)現(xiàn)TCPP 和TCEP 可通過滲透進(jìn)入地下水，并在地下水中持久存在[9]。上述研究說明，TCEP 在水環(huán)境中的積累量已經(jīng)不容忽視，而對于TCEP 對淡水和海洋生物的生物毒性亟需開展更廣泛的檢測與研究。TCEP（CAS:115-96-8）水溶解度為7.82 g/L，我們實驗所用的TCEP 最大質(zhì)量濃度為0.19 g/L，遠(yuǎn)低于其溶解度，能夠充分溶解。另外在前期實驗了4-甲基芐亞甲基樟腦（4-MBC）、對羥基苯甲酸丙酯（PP）、鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）等其他內(nèi)分泌干擾物，并測試了其溶解性，TCEP 無晶體析出，溶解性良好。

采用生態(tài)毒理學(xué)理論評估TCEP 危害[21]，常用表型觀測方式（LC50和SC 為主要指標(biāo)）和生物標(biāo)志物檢測。表型觀測方式研究結(jié)果表明，0.5 和5.0 mg/L 的 TCEP 可以抑制斑馬魚（Danio rerio）幼魚運(yùn)動距離，通過產(chǎn)生氧化損傷造成神經(jīng)毒性[10]，也對人類細(xì)胞及斑馬魚具有內(nèi)分泌干擾毒性[11]。5 mg/L TCEP 還能通過改變神經(jīng)營養(yǎng)因子及相關(guān)受體基因表達(dá)對鮈鯽（Gobiocypris rarus）產(chǎn)生神經(jīng)毒性[12]。已有OPEs 急性毒性研究表明TCPP 對斑馬魚（Danio rerio）成魚96 h 的LC50值為47.06 mg/L[41]、對大鼠（Rattus norvegicus）經(jīng)口的急性毒性LC50為500～4 200 mg/kg[42]、對黑頭呆魚（Pimephales promelas）96 h 的LC50值為51.00 mg/L[12,43]；在相關(guān)研究中，TDCPP 對虹鱒（Oncorhynchus mykiss）96 h 的LC50值為1.10 mg/L，對斑馬魚（Danio rerio）胚胎仔魚116 h的LC50值為7.00 mg/L[43-44]；TCEP 對于魚類96 h 的LC50值范圍為6.30～250.00 mg/L[30]。我們發(fā)現(xiàn)TCEP 對于大菱鲆的LC50分別為190.76 mg/L（24 h）、159.94 mg/L（48 h）、140.70 mg/L（72 h）和110.71 mg/L（96 h），符合內(nèi)分泌干擾物低劑量強(qiáng)生物學(xué)效應(yīng)的特點(diǎn)。根據(jù)《水和廢水監(jiān)測分析方法》，TCEP 對大菱鲆幼魚屬于中毒（100～1 000 mg/L）級別[45]。鑒于TCEP 對大菱鲆幼魚的急性毒性和致死作用，在其養(yǎng)殖活動中需對養(yǎng)殖海水中TCEP 的質(zhì)量濃度及時監(jiān)控，確保不超過33.60 mg/L 的安全濃度。

生物標(biāo)志物的檢測可深入探究TCEP 毒性機(jī)理[21]。魚類免疫系統(tǒng)分為非特異性免疫和特異性免疫，一般情況下魚類依靠非特異性免疫來抵御環(huán)境脅迫[46]。而非特異性免疫依賴各種免疫因子參與，具有代表性的免疫因子可以作為指示非特異性免疫變化的生物標(biāo)志物。大菱鲆免疫相關(guān)因子主要分布在頭腎、脾臟和黏膜相關(guān)的淋巴組織中。頭腎是魚類初級外周免疫器官，主要由淋巴組織構(gòu)成，是免疫細(xì)胞發(fā)生、分化和增殖的重要場所，也是捕獲抗原和產(chǎn)生抗體的主要器官，在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮協(xié)同作用[41]。脾臟是魚體次級外周免疫器官，是魚體紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生、貯存和成熟的主要場所[47]，在清除大分子物質(zhì)、促進(jìn)抗體生成中起著重要作用[48]。黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）指魚體中不具備完整淋巴結(jié)構(gòu)的、較為分散的淋巴生成中心，主要包括皮膚、腸和鰓淋巴組織[49]。分析MHC-Ⅱ α和TNF-α的基因表達(dá)結(jié)果可以看出，在受TCEP 脅迫后，大菱鲆免疫相關(guān)的基因相對表達(dá)量升高，但在不同免疫器官中的反應(yīng)速度和強(qiáng)度有所不同。隨著TCEP 脅迫時間延長及質(zhì)量濃度增加，MHC-Ⅱ α基因相對表達(dá)量最高的器官為鰓，在脾臟和頭腎組織中基因相對表達(dá)量呈升高趨勢；而在鰓和腸組織中，基因相對表達(dá)量呈先升后降趨勢。在相關(guān)的研究中，虹鱒(Oncorhynchus mykiss)受感染實驗表明，其肝臟和頭腎中的MHC基因在12 h 時上升，但在36 h 后呈下降趨勢，之后逐漸恢復(fù)正常[50]。大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）在鰻弧菌感染后，MHC-Ⅱ α相對基因表達(dá)有顯著變化，在12 h 時分別達(dá)到最大值，且在脾臟組織的表達(dá)量高于肝臟組織的[51]。在鰓組織中，MHC-Ⅱ α基因相對表達(dá)量在12 h 以后開始下降，這可能是由于腮是最直接與TCEP 接觸的器官，其表達(dá)趨勢也符合轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律。

我們的研究中大菱鲆的MHC-Ⅱ α受到TCEP 脅迫時迅速變化與此類似。TNF-ɑ基因表達(dá)的變化趨勢與MHC-Ⅱ α相似，在脾臟、頭腎和腸組織中相對表達(dá)量高峰均出現(xiàn)在12 h，在鰓組織中相對表達(dá)量高峰出現(xiàn)在6 h。這與細(xì)菌感染日本比目魚（Pacific Halibut）的研究[24]和菌株感染比目魚的研究[52]中TNF-α基因表達(dá)的變化趨勢一致。即在魚體內(nèi)，頭腎作為初級外周免疫器官，脾臟作為次級外周免疫器官，共同在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[53]。鰓和腸作是黏膜相關(guān)淋巴組織，也屬于免疫器官中外周免疫器官，可以產(chǎn)生淋巴細(xì)胞，對機(jī)體起到免疫保護(hù)作用[54]，在受免疫脅迫時，淋巴組織會及時對脅迫作出反應(yīng)。TNF-ɑ和MHC-Ⅱ α在不同器官中表達(dá)順序不同，可能是由于鰓和腸首先接觸到含TCEP 的海水，而頭腎和脾臟接觸較晚。先接觸TCEP 的鰓和腸通過免疫相關(guān)因子呈遞抗原，引起機(jī)體免疫應(yīng)答；頭腎和脾臟受到TCEP 影響后，免疫相關(guān)因子增多，同時分化產(chǎn)生大量免疫細(xì)胞，促進(jìn)抗體生成。隨脅迫時間延長，免疫相關(guān)因子表達(dá)量下降，可能是由于TCEP 造成的影響無法消除，導(dǎo)致免疫器官受到損傷，免疫防御能力下降；高質(zhì)量濃度TCEP 脅迫的大菱鲆相對表達(dá)量下降出現(xiàn)時間更早，說明高質(zhì)量濃度TCEP 對免疫器官造成的傷害更為嚴(yán)重。

TCEP 的脅迫會使大菱鲆免疫相關(guān)組織的MHC-Ⅱ α和TNF-α免疫相關(guān)基因的表達(dá)量上升，說明TCEP的脅迫對大菱鲆的免疫系統(tǒng)造成了影響；隨著TCEP 的脅迫時間延長，基因表達(dá)量會出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這可能是免疫器官受損導(dǎo)致免疫相關(guān)因子分泌減少，表現(xiàn)出TCEP 對大菱鲆的免疫系統(tǒng)造成了損傷；隨著TCEP 的質(zhì)量濃度上升，表達(dá)量的變化更明顯，說明高質(zhì)量濃度TCEP 的生物學(xué)效應(yīng)更明顯。水環(huán)境中TCEP 積累的量逐漸增長將成為更為嚴(yán)重的威脅。MHC-Ⅱ α和TNF-α基因表達(dá)水平的變化反映了大菱鲆在受到TCEP 不同程度影響后的狀態(tài)，因此兩者可以作為評估和預(yù)警TCEP 這種內(nèi)分泌干擾物造成的污染狀況的分子標(biāo)志物。

4 結(jié)語

我們研究不同質(zhì)量濃度的TCEP 對大菱鲆不同組織中關(guān)鍵免疫因子基因表達(dá)的影響，測定了TCEP 脅迫條件下MHC-Ⅱ α和TNF-ɑ基因的時空表達(dá)特征，推測其可能會對大菱鲆免疫系統(tǒng)造成急性損傷。

內(nèi)分泌干擾物是具有低劑量強(qiáng)生物學(xué)效應(yīng)及生物鏈放大效應(yīng)的化合物，作為一種新型污染物要警惕其危害性。TCEP 是一種新型內(nèi)分泌干擾物，近年來隨著使用量不斷增加，在環(huán)境中的積累量也不斷增加。TCEP 由于帶有氯離子，是一種可以長期穩(wěn)定存在的有機(jī)磷酸酯，需要我們進(jìn)一步明確其毒性。我們的研究表明TCEP 對大菱鲆的LC50分別為190.76 mg/L（24 h）、159.94 mg/L（48 h）、140.70 mg/L（72 h）和110.71 mg/L（96 h）；在海水養(yǎng)殖大菱鲆過程中，海水中TCEP 積累量不可超過33.60 mg/L 的安全濃度，這為大菱鲆的健康養(yǎng)殖提供了數(shù)據(jù)支持。TCEP 作為內(nèi)分泌干擾物能對大菱鲆產(chǎn)生免疫脅迫，使免疫相關(guān)因子MHC-Ⅱα和TNF-ɑ的基因表達(dá)發(fā)生變化，即TCEP 促進(jìn)免疫相關(guān)因子基因相對表達(dá)量提高。在急性脅迫實驗中，受到TCEP 脅迫的大菱鲆MHC-Ⅱ α和TNF-ɑ的相對表達(dá)量對比對照組會有明顯上升，當(dāng)質(zhì)量濃度超過47.69 mg/L（）脅迫時間持續(xù)超過12 h 時，基因相對表達(dá)量會呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這可能是由于TCEP可以影響大菱鲆的免疫系統(tǒng)，而高質(zhì)量濃度的TCEP 會造成大菱鲆免疫器官的損傷，進(jìn)而影響免疫相關(guān)因子的基因表達(dá)。因此MHC-Ⅱ α 和TNF-ɑ可作為潛在的預(yù)警污染物的分子標(biāo)志物，可以為大菱鲆的健康養(yǎng)殖和環(huán)境污染物內(nèi)分泌干擾物TCEP 的檢測提供可參考的分子標(biāo)記參考。TCEP 的毒性和對大菱鲆免疫的影響是其生物學(xué)效應(yīng)的一部分，后續(xù)研究其對大菱鲆生殖方面的影響，將是其對大菱鲆繁殖影響的直接證據(jù)。