牛圓圓，何培青，劉晨臨*

（1.自然資源部 第一海洋研究所海洋生物資源與環(huán)境研究中心,山東 青島 266061；2.自然資源部 海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266061）

深海熱液區(qū)環(huán)境惡劣，黑暗、高壓、低氧、溫度梯度變化大、硫化物和重金屬等有毒物質(zhì)含量高[1]，這種極端環(huán)境促使熱液區(qū)動(dòng)物形成了獨(dú)特的生存機(jī)制，即與微生物的共附生關(guān)系。在深海熱液區(qū)富含硫化物、氫氣（H2）或甲烷（CH4）等，化能自養(yǎng)微生物利用這些還原性物質(zhì)作為電子供體產(chǎn)生能量，并利用CO2合成有機(jī)物,為異養(yǎng)生物提供能源、碳源和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，形成以化能合成為基礎(chǔ)的生態(tài)系統(tǒng)[1]。大多數(shù)在熱液區(qū)生活的無脊椎動(dòng)物依賴這種初級(jí)生產(chǎn)力，以自由活動(dòng)的細(xì)菌為食，或與化能合成細(xì)菌形成共生關(guān)系[2-4]。微生物以內(nèi)共生（endosymbiont）或外共生（ectosymbiont）的方式分布在不同動(dòng)物宿主的不同組織中，包括管狀蠕蟲的營(yíng)養(yǎng)體、雙殼類動(dòng)物的鰓和腹足類動(dòng)物的食道腺以及節(jié)肢動(dòng)物（蝦、蟹等）和軟體動(dòng)物的外殼表面等[4]。熱液區(qū)生態(tài)系統(tǒng)中，微生物與地球化學(xué)環(huán)境、共生代謝和宿主生存之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系。微生物可以調(diào)節(jié)動(dòng)物宿主與環(huán)境的相互作用，通過營(yíng)養(yǎng)共生關(guān)系拓寬宿主動(dòng)物的生態(tài)位，促進(jìn)其生態(tài)和進(jìn)化的多樣性[5]。同時(shí)，熱液區(qū)的動(dòng)物也對(duì)其共生微生物具有高度選擇性，同一屬動(dòng)物受環(huán)境化學(xué)條件和個(gè)體發(fā)育階段的影響，也可能存在不同的宿主-共生關(guān)系[2,6]。

近年來，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家開展了盲蝦[7]、貽貝[8]和管蟲[9-10]等深海熱液區(qū)動(dòng)物共生微生物多樣性、共生體能量利用及共生機(jī)制[11-13]等方面的研究。大部分熱液區(qū)動(dòng)物通過水平傳播獲得共生菌，即從周圍環(huán)境獲得自由生活的細(xì)菌，經(jīng)過一個(gè)選擇性的過程將其遷移到特殊的器官，內(nèi)共生菌不再與外界環(huán)境直接接觸。當(dāng)動(dòng)物死亡后，這些內(nèi)共生菌被重新釋放到環(huán)境中，營(yíng)自由生活[9,12-14]。除了水平傳播外，在深海熱液蛤類中還發(fā)現(xiàn)了通過卵子從母代向子代垂直傳播共生菌的情況[10]。

目前，在深海熱液區(qū)已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了神盾螺屬（Gigantopelta）的2 個(gè)種，分別為南大洋東斯科舍洋脊熱液區(qū)的G.chessoia[15]和西南印度洋龍旂熱液區(qū)的G.aegis[16]，其共生菌主要分布于神盾螺的鰓和食道腺中[17]。印度洋G.aegis食道腺為雙內(nèi)共生菌系統(tǒng)，由γ-變形菌綱的硫氧化菌（Sulfide-Oxidizing Bacteria，SOB）和甲烷氧化菌（Methane-Assimilating Bacteria，MOB）同時(shí)為宿主提供能量[17]。南大洋G.chessoia膨大食道腺中主要分布硫氧化的γ-變形菌[18]。幼體G.chessoia（殼長(zhǎng)≤7 mm）主要通過捕食細(xì)菌獲得能量和營(yíng)養(yǎng)，直到成體階段才營(yíng)內(nèi)共生生活方式。與成體食道腺細(xì)菌組成相比，G.chessoia幼體細(xì)菌組成與成體鰓附著細(xì)菌組成更相似，包括多種γ-、ε-和δ-變形菌，這說明神盾螺可能通過水平傳播獲得共生菌[18]。

神盾螺共附生微生物是其與環(huán)境相互作用的重要媒介。以往研究結(jié)果表明，在南大洋和西南印度洋不同熱液區(qū)生活的神盾螺共附生微生物的多樣性存在差異[17]，但在同一生境中的神盾螺不同個(gè)體間是否存在共附生微生物差異還未見報(bào)道。本文利用擴(kuò)增子和宏轉(zhuǎn)錄組等高通量測(cè)序技術(shù)，分析西南印度洋龍旂熱液區(qū)神盾螺G.aegis不同個(gè)體間共附生微生物多樣性及其功能，為研究深海熱液區(qū)化能合成微生物對(duì)腹足類動(dòng)物宿主環(huán)境適應(yīng)和海洋生態(tài)位分布的影響提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019 年4 月8 日中國(guó)大洋52 航次第三航段深海熱液區(qū)底棲生物調(diào)查任務(wù)，利用“海龍Ⅲ”遙控水下機(jī)器人（Remote Operated Vehicle,ROV）在西南印度洋中脊龍旂低溫?zé)嵋簠^(qū)（49°38′59″E，37°42′01″S）采集獲得神盾螺樣品。采集樣品后將其置于船載–80 ℃冰箱保存，以便在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分析處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

PCR 擴(kuò)增使用的酶Phusion?High-Fidelity DNA polymerase，New England Biolabs 公司，美國(guó)；PCR 擴(kuò)增使用的緩沖液Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，New England Biolabs 公司，美國(guó)；建庫(kù)試劑盒Next?Ultra? IIDNA Library Prep Kit，New England Biolabs 公司，美國(guó)；膠回收試劑盒，Qiagen 公司，德國(guó)；Trizol 試劑，Invitrogen 公司，美國(guó)。Bio-rad T100 梯度PCR 儀，Bio-Rad 公司，美國(guó)；測(cè)序上機(jī)儀器Illumina NovaSeq 6000，Illumina 公司，美國(guó)。北京諾禾致源生物信息科技有限公司于2021 年6 月22 日完成樣品的DNA 提取和擴(kuò)增子測(cè)序，2019 年10 月20 日完成RNA 提取和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 擴(kuò)增子測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

1.3.1 基因組DNA 提取

利用液氮將3 個(gè)神盾螺個(gè)體（帶殼）分別研碎，采用CTAB 法提取基因組DNA[19]，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 純度和濃度。

1.3.2 16S rRNA 基因V3-V4 擴(kuò)增子測(cè)序

選用引物（正向引物515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，反向引物806R：5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′）、Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 和高保真酶PCR 擴(kuò)增16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)。PCR 的反應(yīng)體系（30 μL）為：Phusion Master Mix（2×）15 μL，PrimerF（1 μmol/L）1 μL，PrimerR（1 μmol/L）1 μL，Genomic DNA（1 ng/μL）10 μL，最后使用ddH2O 補(bǔ)足30 μL 體系；PCR 的反應(yīng)流程為：98 ℃預(yù)變性1 min；30 個(gè)循環(huán)（98℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃，5 min。使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，并根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后再次使用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后采用膠回收試劑盒回收目的條帶。使用Next?Ultra? IIDNA Library Prep Kit 建庫(kù)試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，利用NovaSeq 6000 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)處理和分析

根據(jù)接頭序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去接頭和引物序列后，使用FLASH（v1.2.11,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）[20]進(jìn)行拼接，得到原始序列（Raw Tags）。隨后使用數(shù)據(jù)質(zhì)控過濾軟件Fastp 對(duì)得到的原始序列（Raw Tags）進(jìn)行質(zhì)控，得到高質(zhì)量的序列（Clean Tags）。最后使用擴(kuò)增子數(shù)據(jù)處理分析軟件Vsearch（v2.15.0）將Clean Tags 與Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)并去除嵌合體[21]，最終獲得有效序列（Effective Tags）。

采用擴(kuò)增子分析軟件QIIME2（v202006）[22]中的DADA2 模塊對(duì)有效序列進(jìn)行降噪處理，并過濾掉豐度<5 的序列，最終獲得擴(kuò)增子序列變異（Amplicon Sequence Variants，ASVs）以及特征表。利用Classify-sklearn模塊將獲得的ASVs 與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)從而獲得每個(gè)ASV 的物種信息，并采用QIIME2 軟件計(jì)算α 多樣性指數(shù)[22]。

1.4 宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

1.4.1 樣品RNA 提取與宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

利用液氮分別研碎5 個(gè)神盾螺個(gè)體（帶殼），并采用Trizol 提取樣品的總RNA。檢測(cè)RNA 的純度、完整性和濃度后，從總RNA 中去除核糖體RNA，并將獲得的mRNA 隨機(jī)打斷成250～300 bp 的短片段，以片段化RNA 為模板，隨機(jī)寡核苷酸為引物合成cDNA 第一條鏈，隨后按照鏈特異性建庫(kù)方式進(jìn)行建庫(kù)。在Illumina HiSeqTM2000 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，最終生成的序列為150 bp 的雙端序列。

1.4.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估和轉(zhuǎn)錄本拼接

將測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)過濾掉低質(zhì)量讀長(zhǎng)（reads）后，用轉(zhuǎn)錄組組裝軟件Trinity（v2.4.0）對(duì)獲得的凈讀長(zhǎng)（Clean Reads）進(jìn)行拼接[23]，輸出可變剪切亞型的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，并梳理對(duì)應(yīng)于旁系同源基因的轉(zhuǎn)錄本。在Trinity 拼接基礎(chǔ)上，使用序列聚類軟件CD-HIT-EST（v4.8.1）去冗余（設(shè)定序列一致性閾值為0.95），得到非冗余基因（unigene）集合[24]。然后，以神盾螺全基因組序列[17]為參照，進(jìn)一步篩選掉宿主基因，獲得共附生微生物宏轉(zhuǎn)錄組序列。

1.4.3 物種和基因功能注釋

使用比對(duì)軟件Diamond（v0.8.22）[25]對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中抽提出的細(xì)菌（Bacteria）、真菌（Fungi）、古菌（Archaea）和病毒（Viruses）序列進(jìn)行比對(duì)（e-value≤1×e?5）；采取系統(tǒng)分類軟件MEGAN[26]的 LCA （Lowest Common Ancestor）算法，將出現(xiàn)第一個(gè)分支前的分類級(jí)別，作為該序列的物種注釋信息；根據(jù)LCA 注釋結(jié)果及基因豐度表，獲得各個(gè)樣品在各個(gè)分類層級(jí)上的豐度信息。

采用Diamond 軟件將宏轉(zhuǎn)錄組序列與各功能數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（Blastp，e-value≤1×e?5），進(jìn)行對(duì)比的功能數(shù)據(jù)庫(kù)包括：京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（Carbohydrate-Active enZYmes Database，CAZy），以及基因的進(jìn)化譜系：非監(jiān)督直系群數(shù)據(jù)庫(kù)（Evolutionary Genealogy of Genes:Non-supervised Orthologous Groups Database，eggNOG）等，基于NR 和Pfam 兩部分的蛋白注釋結(jié)果（e-value=1×e?6），確定宏轉(zhuǎn)錄組序列的基因功能。

2 結(jié)果與討論

2.1 擴(kuò)增子序列分析

通過16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序，分別分析3 個(gè)神盾螺個(gè)體共附生菌的組成。3 個(gè)樣品共擴(kuò)增獲得573 個(gè)ASVs，其中115 個(gè)ASVs 在3 個(gè)神盾螺個(gè)體中均有分布，138 個(gè)ASVs 僅分布于樣品Ga3 中，而104 和73 個(gè)ASVs 分別為Ga2 和Ga1 的特有序列（圖1）。3 個(gè)樣品測(cè)序覆蓋率（Goods Coverage）均為1，Ga3 低豐度物種較多，其總ASVs 最高為363 個(gè)，Ga2和Ga1 中的ASVs 分別為336 和247 個(gè)。Ga2 的香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon）和辛普森指數(shù)（Simpson）最高，說明其共附生菌的群落多樣性和物種分布均勻度最高（表1）。將573 個(gè)共附生細(xì)菌ASVs 與西南印度洋神盾螺的SOB 及MOB 內(nèi)共生菌基因組序列[17]比對(duì)，發(fā)現(xiàn)8 個(gè)ASVs 與參考序列具有較高相似性（98%）。其中，7 個(gè)ASVs 屬于SOB，豐度最高的ASV0 與SOB 序列相似性為100%，在3 個(gè)樣品中均有分布。豐度較低的1 個(gè)ASV（ASV244）屬于MOB，僅在1 個(gè)樣品中被檢測(cè)到（表2）。

圖 1 不同神盾螺個(gè)體ASV 組成的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of ASV composition in different individuals of Gigantopelta

表1 神盾螺共附生菌16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果及alpha 多樣性分析Table 1 Sequencing results of amplicon in V3-V4 region of 16S rRNA gene and analysis of alpha diversity of symbiotic and epiphytic microorganisms of Gigantopelta

表2 與已報(bào)道的神盾螺的SOB 內(nèi)共生菌和MOB 內(nèi)共生菌基因組序列相似性較高的ASVsTable 2 ASVs with high similarity to the reported genome sequence of the sulfur-oxidizing endosymbionts and methano-oxidizing endosymbionts of Gigantopelta

測(cè)序獲得的16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)擴(kuò)增子序列99.99%屬于細(xì)菌域，主要包括10 個(gè)門和20 個(gè)綱（圖2）。有125 個(gè)ASVs 屬于變形菌門（Proteobacteria），在神盾螺共附生菌中豐度最高的包括γ-、ε-和α-變形菌綱，其中112 個(gè)ASVs 屬于γ-變形菌綱。γ-變形菌綱在Ga1、Ga2 和Ga3 中的豐度分別為82.61%、 12.31%和81.25%。Ga1 和Ga3 的優(yōu)勢(shì)物種均為γ-變形菌綱Thiomicrospirales 目的SOB 內(nèi)共生菌（ASV0），豐度分別為72.45%和67.60%。但是在Ga2 中ASV0 豐度僅為1.41%。此外，在3 個(gè)螺中γ-變形菌綱腸桿菌目（Enterobacterales）的Escherichia-Shigella屬（ASV2）也有較高豐度，分別為5.69%、6.38%和7.53%。硫發(fā)菌目（Thiotrichales）、伯克氏菌目（Burkholderiales）、甲基球菌目（Methylococcales）和巴斯德氏菌目（Pasteurellales）的ASV 在3 個(gè)螺中平均豐度也均大于0.5%。

圖2 基于16S rRNA V3-V4 區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序的神盾螺共附生細(xì)菌群落組成Fig.2 Community composition of symbiotic and epiphytic bacteria from Gigantopelta based on amplicon sequencing in 16S rRNA V3-V4 region

ε-變形菌綱在Ga1、Ga2 和Ga3 中的豐度分別為7.73%、68.73%和2.28%。有34 個(gè)ASVs 被鑒定為ε-變形菌綱彎曲菌目（Campylobacterales），其中24 個(gè)ASVs 來自硫卵形菌屬（Sulfurovum），3 個(gè)ASVs 來自Nitratifractor屬。Ga2 共附生優(yōu)勢(shì)菌（ASV1）為ε-變形菌綱的硫卵形菌屬，其豐度達(dá)68.52%，而在Ga1 和Ga3 中ASV1 的豐度僅分別為7.65%和2.01%。與ASV1 序列相似性為100%的硫卵形菌屬（Sulfurovum）在深海熱液區(qū)生物和環(huán)境中廣泛存在，如西南印度洋中脊熱液區(qū)鱗足螺（Chrysomallon squamiferum）外殼附生菌（AY531602）[14]、大西洋熱液盲蝦（Rimicaris exoculata）腸道附生菌（FR839086）[27]，以及深海噴口新暴露玄武巖表面生物膜細(xì)菌（KT257758）[5]等。

在鑒定獲得的神盾螺共附生菌中，厚壁菌門（Firmicutes）種類最多，共包含196 個(gè)ASVs，其中62 個(gè)ASVs 屬于乳桿菌目（Lactobacillales），豐度最高的是毛絨厭氧桿菌屬（Lachnoanaerobaculum）；另外，Lachnospirales目、Oscillospirales 目和消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）的Romboutsia屬也在神盾螺中均有分布。擬桿菌門（Bacteroidetes）中包含135 個(gè)ASVs，其中Muribaculaceae 科、Prevotella屬和Aestuariimonas屬豐度最高。梭桿菌門（Fusobacteria）的22 個(gè)ASVs 中，梭桿菌屬（Fusobacterium）和纖毛菌屬（Leptotrichia）豐度最高。脫硫桿菌門（Desulfobacterota）中含有11 個(gè)ASVs，脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）和脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）在神盾螺中均有分布，其中在Ga2 中豐度最高。放線菌門（Actinobacteria）含有30 個(gè)ASVs，代表屬為糖多孢菌（Saccharopo-lyspora）和雙歧桿菌（Bifidobacterium）（圖2）。

在深海熱液區(qū)，優(yōu)勢(shì)化能自養(yǎng)菌主要為γ-變形菌和ε-變形菌的SOB[28]。對(duì)3 個(gè)神盾螺個(gè)體的16S rRNA基因V3-V4 區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果表明，同一熱液區(qū)不同個(gè)體的共附生菌種類差異較大。個(gè)體Ga1 和Ga3 的共附生菌以γ-變形菌為主，而個(gè)體Ga2 的以ε-變形菌為主。大西洋熱液盲蝦的鰓附著大量細(xì)菌，以ε-變形菌和γ-變形菌為主。它們氧化硫化氫（H2S）或氫氣，以不同途徑固碳，在減小附生菌間直接競(jìng)爭(zhēng)的同時(shí)，也擴(kuò)大了盲蝦棲息的環(huán)境范圍[7]。研究發(fā)現(xiàn)，南太平洋毛螺（Alviniconcha）鰓中同時(shí)分布著化能自養(yǎng)的γ-變形菌和ε-變形菌[2]，中印度洋中脊熱液區(qū)毛螺以ε-變形菌內(nèi)共生菌為主[4]。這些研究結(jié)果與我們的發(fā)現(xiàn)相一致，深海熱液區(qū)動(dòng)物的共附生菌組成具有相似性，以γ-變形菌和ε-變形菌為主，但本文獲得的同一區(qū)域生活的宿主的不同個(gè)體間的優(yōu)勢(shì)共附生菌組成存在差異的結(jié)果為首次報(bào)道。

盡管3 個(gè)神盾螺個(gè)體共附生菌的種類不同，但它們均屬于SOB，反映了神盾螺生存的龍旂熱液生態(tài)系統(tǒng)以SOB 為主要的化能自養(yǎng)初級(jí)生產(chǎn)力，SOB 在熱液環(huán)境中普遍存在，神盾螺的共附生菌可以營(yíng)自由生活，也可作為熱液動(dòng)物群的外共生和內(nèi)共生菌[29]。Ga2 的優(yōu)勢(shì)菌，ε-變形菌也在熱液區(qū)生境中大量存在，多以外共生形式生活于多毛類蠕蟲、軟體動(dòng)物和甲殼動(dòng)物上，很少以內(nèi)共生形式存在[30]。ε-變形菌能夠氧化硫、甲酸鹽和氫產(chǎn)生能量，用于自身生存和維持共生關(guān)系[2,4]。

2.2 基于宏轉(zhuǎn)錄組序列的神盾螺共附生微生物多樣性分析

將從5 個(gè)神盾螺個(gè)體中提取的RNA 混樣后，進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后的得到88 876 988個(gè)讀長(zhǎng)（reads），共13.33G 的堿基數(shù)據(jù)量。Phred 數(shù)值大于20 和30 的堿基占總堿基的百分比Q20 和Q30 分別為97.07%和91.92%，GC 含量為42.76%。數(shù)據(jù)拼接后共得到108 537 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，去冗余后得到95 408 條基因，其N50 和N90 長(zhǎng)度分別為438 和228 bp。

在神盾螺共附生微生物宏轉(zhuǎn)錄組序列中，去除宿主序列后共鑒定出39 個(gè)門，包括1 個(gè)病毒門、2 個(gè)古菌門、29 個(gè)細(xì)菌門以及7 個(gè)真核生物門。細(xì)菌序列占宏轉(zhuǎn)錄組序列的45.48%，主要為變形菌門（65.00%）和擬桿菌門（28.49%）；真核生物相對(duì)豐度為5.53%，主要為真菌，包括子囊菌門（Ascomycota，93.76%）和毛霉門（Mucoromycota，2.29%）；古菌序列相對(duì)豐度較低（0.17%），主要由廣古菌門（Euryarchaeota，30.10%）和奇古菌門（Thaumarchaeota，67.04%）構(gòu)成（圖3）。

圖3 基于宏轉(zhuǎn)錄組序列的神盾螺共附生微生物多樣性Fig.3 Symbiotic and epiphytic microbial diversity of Gigantopelta based on metatranscriptomic sequences

與擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果基本一致，宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明變形菌門在神盾螺共附生細(xì)菌中相對(duì)豐度最高，包括γ-（27.79%）、ε-（17.92%）、α-（9.79%）、δ-（4.12%）、β-（3.01%）和ζ-1.09%變形菌綱。其中，ε-變形菌綱細(xì)菌相對(duì)豐度最高，以硫卵菌（14.11%）為主，硫化螺旋菌（Sulfurospirillum）、硫單胞菌（Sulfurimonas）和Nitratifractor也有較高豐度。γ-變形菌中腸桿菌目、甲基球菌目、Cellvibrionales 目和硫發(fā)菌目豐度較高。δ-變形菌中黏球菌目（Myxococcales）、脫硫單胞菌目（Desulfuromonadales）、脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）和脫硫桿菌目（Desulfobacterales）豐度較高。擬桿菌門中，黃桿菌目（Flavobacteriales）的Lutibacter屬（2.43%）和極地桿菌屬（Polaribacter）（1.19%）豐度較高。放線菌門中擬孢囊菌屬（Kibdelosporangium）（1.06%）和Lawsonella（1.08%）豐度較高。黏膠球形菌門（Lentisphaerae，4.47%）和梭桿菌門中嗜冷桿菌（Psychrilyobacter，1.35%）的豐度較高。

除細(xì)菌序列外，在宏轉(zhuǎn)錄組中還鑒定獲得29 個(gè)屬的真菌序列，其中子囊菌門的Phialocephala屬豐度占95.48%，其次為芽枝霉門（Blastocladiomycota）和異水霉屬（Allomyces）。據(jù)報(bào)道，Phialocephala為植物內(nèi)共生真菌，能促進(jìn)宿主生長(zhǎng)，并通過產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物提高宿主抗病和抗采食能力[31]。Chen等[32]從一株深海沉積物真菌Phialocephala中分離獲得新的倍半萜對(duì)苯二酚，對(duì)白血病細(xì)胞顯示了很強(qiáng)的增殖抑制活性。Phialocephala與神盾螺是否存在互惠共生作用還有待進(jìn)一步研究。

在古菌序列中，甲烷微菌綱（Methanomicrobia）豐度占54.79%，古丸菌綱（Archaeo-globi）古丸菌屬（Archaeoglobus）占16.81%，甲烷暖球菌屬（Methanocaldoco-ccus）占5.65%。目前，已知的古丸菌綱都為從海洋熱液系統(tǒng)或海上油田中分離獲得的嚴(yán)格厭氧菌和超嗜熱菌。古丸菌屬類群均能夠還原亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽[33]。甲烷暖球菌為最早從深海熱液噴口中分離獲得的嗜熱化能自養(yǎng)微生物，擁有地球上最古老的呼吸代謝途徑之一，即利用氫氣和二氧化碳（CO2）產(chǎn)生甲烷獲得能量[34-35]。

2.3 基于宏轉(zhuǎn)錄組的共附生微生物功能分析

2.3.1 代謝相關(guān)基因

1）硫代謝

深海熱液區(qū)海水、熱液羽流以及無脊椎動(dòng)物的共附生微生物中存在多種SOB。硫化氫和硫化物氧化是深海熱液區(qū)化能自養(yǎng)代謝過程中最主要的能量來源。除了有氧氧化，硫氧化還與硝酸鹽還原相耦合[36]。

硫醌氧化還原酶（Sulfide：Quinone Oxidoreductase,SQR）是高濃度硫化物中SOB 生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因[37]。硫醌還原酶將硫化物不完全氧化成單質(zhì)硫，防止完全氧化生成硫酸鹽造成環(huán)境的酸化[38]。在大西洋盲蝦鰓腔內(nèi)，共生菌的硫醌還原酶基因不僅可以起到防止有害酸化的作用，而且在硫化物濃度較高時(shí)能夠以硫的形式儲(chǔ)存能量[7]。神盾螺宏轉(zhuǎn)錄組中含有36 條硫醌還原酶基因片段，與ε-變形菌綱的硫卵形菌屬和Nitratifractor屬，γ-變形菌綱發(fā)硫菌屬（Thiothrix），以及擬桿菌門黃桿菌綱（Flavobacteriia）等的硫醌還原酶基因有較高相似性。

硫代硫酸鹽氧化復(fù)合酶體系（Sox 多酶復(fù)合體系）參與氧化硫化物和亞硫酸鹽生成硫酸鹽的途徑。從神盾螺宏轉(zhuǎn)錄組序列中獲得28 條Sox 基因序列，親緣關(guān)系最近的基因主要包括熱液或冷泉環(huán)境中的γ-和ε-變形菌綱，如硫卵形菌屬和亮發(fā)菌屬（Leucothrix）等；也包括大西洋熱液盲蝦，黑煙囪熱液噴口螺以及冷泉管蟲共生菌（表2）。

異化亞硫酸鹽還原酶（Dissimilatory sulfite reductase，Dsr）在厭氧呼吸過程中以硫酸鹽、亞硫酸鹽或有機(jī)磺酸鹽為末端電子受體，催化亞硫酸鹽還原為硫化物，并抑制硫化物氧化[39]。此外，Dsr 能夠重新利用細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的硫元素，以維持在低濃度硫化物環(huán)境下的能量代謝[40-41]。與本研究Dsr 基因相似度最高的序列為γ-變形菌綱，其中發(fā)硫菌屬最常見。3 條Dsr 基因序列與已報(bào)道的印度洋神盾螺SOB 內(nèi)共生菌序列相似性高于90%，但未達(dá)到100%。由此可見，本樣品中的SOB 與之前報(bào)道的神盾螺SOB 內(nèi)共生菌可能屬于不同的基因型[17]。

2）氫代謝

氫化酶催化氫的可逆氧化。我們?cè)诤贽D(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了20 條氫酶基因與其他不同熱液環(huán)境中細(xì)菌的氫酶基因具有較高相似性，包括γ-變形菌綱、ε-變形菌綱和擬桿菌門等，如熱液噴口羽流的著色桿菌科（Chromatiaceae）和Lutibacter屬、深海熱液羽流和煙囪中的硫卵形菌屬、熱液沉積物中的Nitratifractor屬，以及大西洋盲蝦鰓共生菌等。這表明神盾螺共附生微生物能夠參與氫代謝以提供能量。

在多種深海熱液生物共生菌中均發(fā)現(xiàn)了氫酶基因，包括管狀蠕蟲（Riftia pachyptila）和大西洋盲蝦等[42]。研究表明，生活在富含氫氣的大西洋中脊Logatchev 熱液區(qū)深海貽貝共生菌能夠利用氫氣為能量源，生活在氫氣濃度較低的太平洋深海熱液區(qū)的貽貝共生菌也具有氫酶基因[43]；在不同熱液區(qū)的腹足類毛螺共生菌，都能同時(shí)以氫氣和硫化氫為能量來源，隨環(huán)境中氫氣和硫化氫濃度比例的下降，氫酶的基因表達(dá)量和酶活也降低[4]。這說明利用氫為能源的生存方式在熱液區(qū)共生關(guān)系中可能廣泛存在，尤其是在氫含量高的區(qū)域[4,43]。

3）甲烷代謝

盡管16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果表明MOB 內(nèi)共生菌豐度極低，但宏轉(zhuǎn)錄組序列中發(fā)現(xiàn)了甲烷代謝相關(guān)基因，包括四氫甲烷蝶呤水解酶（Fae）和甲烷單加氧酶（Pom）等基因。將4 條宏轉(zhuǎn)錄組Fae 序列與神盾螺MOB 內(nèi)共生菌的Fae 序列（WP_198245971）和熱液貽貝共生菌的Fae 序列（WP_174483451）進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)基因c20819_g1 與神盾螺的Fae 基因相似性較高，但仍有明顯序列差異（圖4）。將宏轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的3 條pomC 基因與其他熱液動(dòng)物共生菌的pomC 基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），發(fā)現(xiàn)其中2 條與不同熱液環(huán)境的深海貽貝以及神盾螺內(nèi)共生菌的基因聚為一個(gè)分支，另1 條序列則與來自甲基球菌目的細(xì)菌進(jìn)化關(guān)系最近。說明本研究的神盾螺宏轉(zhuǎn)錄組序列除共附生菌外可能也包括來自環(huán)境中的細(xì)菌，這些細(xì)菌將甲烷氧化成二氧化碳，并利用中間產(chǎn)物甲醛作進(jìn)行同化作用，為神盾螺提供碳源。

圖4 神盾螺宏轉(zhuǎn)錄組中甲烷代謝基因與其他深海熱液動(dòng)物內(nèi)共生菌參考序列的多重比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Multiple alignment of methane-metabolizing genes with reference sequences of symbiotic bacteria from other deep-sea hydrothermal animals in the metatranscriptomic of Gigantopelta and Phylogenetic analysis

2.3.2 環(huán)境脅迫應(yīng)答相關(guān)基因

Fis（Factor for Inversion Stimulation）是一種高效的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在不同生長(zhǎng)階段以及非生物脅迫時(shí)作出響應(yīng)[44]。Fis 可以調(diào)控毒力、運(yùn)動(dòng)和代謝等生物學(xué)過程，調(diào)節(jié)各種毒力性狀、胞外酶和胞外多糖的產(chǎn)生、細(xì)胞游動(dòng)和群體運(yùn)動(dòng)、生物膜的形成和細(xì)胞聚集，以及群體感應(yīng)系統(tǒng)等，涉及到100 多個(gè)相關(guān)基因表達(dá)的增強(qiáng)或抑制[45]。Fis 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子高度保守且在細(xì)菌基因組中通常只含有1 個(gè)拷貝，在細(xì)菌指數(shù)生長(zhǎng)期間高表達(dá)，在穩(wěn)定期幾乎測(cè)不到表達(dá)[46]。在宏轉(zhuǎn)錄組中本研究發(fā)現(xiàn)了多條Fis 序列，與西南印度洋神盾螺SOB 內(nèi)共生菌、海綿甲基球菌目共生菌、熱液噴口亮發(fā)菌屬，以及熱液羽流的甲烷冷泉甲基球菌科（Methylococcaceae）和Methylomarinum屬等序列相似性較高，說明這些微生物的近緣種在神盾螺共附生群落中有較高的活力。

在深海熱液環(huán)境中含有大量有毒性重金屬，微生物對(duì)重金屬的抗性機(jī)制主要是通過各種金屬外排ATP酶或化學(xué)滲透陽離子反向運(yùn)輸泵向外運(yùn)輸有毒離子[47]。在神盾螺宏轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了大量重金屬抗性基因，包括7 條Cd2+/Zn2+外排ATP 酶CadA 和6 條Cu2+外排ATP 酶CopAB 基因。鈷-鋅-鎘抗性蛋白（Cobalt-zinc-cadmium resistance protein,CzcA）是陽離子反向運(yùn)輸泵的核心，是由一段肽鏈編碼的同三聚體，可將離子從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出來[48]，在細(xì)菌的重金屬抗性方面發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)了7 條czcA 基因，與來自硫卵形菌屬，Lutibacter屬和Flavobacterium屬等物種的基因同源。

此外，在神盾螺宏轉(zhuǎn)錄組中還找到139 條編碼轉(zhuǎn)座酶（transposase）的基因。轉(zhuǎn)座酶可以在基因組內(nèi)或基因組間實(shí)現(xiàn)水平基因轉(zhuǎn)移，在中大西洋海脊熱液區(qū)的碳酸鹽煙囪的生物膜宏基因組中，超過8%的宏基因組與轉(zhuǎn)座酶序列相似，比在其他環(huán)境中的高一個(gè)數(shù)量級(jí)。通過轉(zhuǎn)座酶實(shí)現(xiàn)的水平基因轉(zhuǎn)移，使生物膜成員具有更高的表型多樣性，以適應(yīng)不利的生存環(huán)境[49]。宏轉(zhuǎn)錄組中大量的轉(zhuǎn)座酶基因，說明神盾螺共附生菌通過基因水平轉(zhuǎn)移，獲得更好的環(huán)境適應(yīng)性。

3 結(jié)語

采用16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)擴(kuò)增子和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法分析了西南印度洋龍旂熱液區(qū)神盾螺共附生微生物群落結(jié)構(gòu)及生態(tài)功能。研究發(fā)現(xiàn)SOB 是神盾螺共附生微生物群落中的優(yōu)勢(shì)類群。擴(kuò)增子測(cè)序表明，同一群落神盾螺不同個(gè)體間的優(yōu)勢(shì)菌的種類不同，優(yōu)勢(shì)類群分別為γ-變形菌綱和ε-變形菌綱。其中γ-變形菌綱代表種的序列與已報(bào)道的神盾螺SOB 內(nèi)共生菌序列相似度為100%。ε-變形菌綱代表屬為硫卵形菌屬，為深海熱液區(qū)廣分布類群。宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果也表明，硫卵形菌屬、Nitratifractor屬、亮發(fā)菌屬、Flavobacterium屬和甲基球菌目等為神盾螺共附生微生物優(yōu)勢(shì)類群。除硫氧化途徑外，宏轉(zhuǎn)錄組中還發(fā)現(xiàn)了參與氫氧化和甲烷的基因。與深海熱液環(huán)境微生物或熱液動(dòng)物共生菌的序列相似度最高，說明這些微生物能夠通過化能自養(yǎng)合成途徑，為自身和宿主提供能量和碳源。因此，深海熱液區(qū)動(dòng)物個(gè)體共附生菌具有獨(dú)特性，但其生態(tài)功能有一定的共性，反映了共附生關(guān)系的復(fù)雜性。

本研究為深海熱液區(qū)無脊椎動(dòng)物生存機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了理論參考。但是，由于樣品量有限，同時(shí)缺乏實(shí)時(shí)環(huán)境理化參數(shù)，尚無法確定不同神盾螺個(gè)體共附生微生物組成對(duì)宿主能量獲取的影響，也無法明確參與能量代謝過程的基因表達(dá)是否與環(huán)境中還原物質(zhì)濃度密切相關(guān)。