馮家楨，賀 濤，邢怡橋

0引言

黃斑前膜(epiretinal membrane, ERM)是一種以發(fā)生于視網(wǎng)膜內(nèi)表面的纖維細胞膜為特征的視網(wǎng)膜疾病。ERM可分為不伴明顯原發(fā)疾病的特發(fā)性黃斑前膜(idiopathic epiretinal membrane, iERM)，及繼發(fā)于眼外傷、眼內(nèi)炎、視網(wǎng)膜血管疾病、或眼部手術(shù)等的繼發(fā)性ERM[1]。多數(shù)ERM是無癥狀且長期無進展的，少數(shù)ERM的整體病程是逐漸進展的[2]。ERM的診斷依賴于裂隙燈下所見眼底及OCT檢查[3-4]。ERM在病理上表現(xiàn)為視網(wǎng)膜內(nèi)表面上形成的病理性纖維細胞膜[1]，絕大多數(shù)ERM主要由兩部分組成，即細胞與細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)[5-6]。在ERM的早期病理表現(xiàn)中可見神經(jīng)膠質(zhì)細胞明顯增多，但此時期患者多無明顯癥狀，僅在裂隙燈檢查下可見黃斑玻璃紙樣反射。而在ERM的晚期病理表現(xiàn)中肌成纖維細胞明顯增多，膜表現(xiàn)收縮特性，OCT下表現(xiàn)為視網(wǎng)膜前黃斑纖維化，此時期患者多有嚴重視力下降及視物變形癥[7-8]。早期ERM通常無需隨訪。而晚期ERM患者由于持續(xù)性的視力下降及嚴重視物變形常需行玻璃體切割術(shù)剝離ERM[9]。

1ERM

目前對ERM的研究多集中于病理及細胞水平。就iERM而言，隨年齡增長逐漸進展的玻璃體液化所導(dǎo)致的玻璃體后脫離(posterior vitreous detachment, PVD)可能是其發(fā)生的始動因素[10]，這一觀點已得到多數(shù)學(xué)者的認可。PVD可導(dǎo)致內(nèi)界膜(internal limiting membrane, ILM)損傷，并在其表面形成微滲漏孔，這使得視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pigment epithelium, RPE)細胞、Müller細胞、小膠質(zhì)細胞等細胞得以向ILM表面遷移。其次，PVD所導(dǎo)致的玻璃體劈裂也使得玻璃體細胞可以遷移至ILM表面[11]。在早期iERM的病理表現(xiàn)中，神經(jīng)膠質(zhì)細胞占據(jù)主導(dǎo)地位，其中以來源于星形膠質(zhì)細胞、Müller細胞等細胞的轉(zhuǎn)分化的細胞為主[12]。但在晚期iERM的病理表現(xiàn)中肌成纖維細胞占主導(dǎo)地位[13]，目前認為晚期iERM中的肌成纖維細胞來源于Müller細胞、玻璃體細胞、RPE細胞的轉(zhuǎn)分化、肌成纖維細胞分泌收縮蛋白并沉積膠原蛋白，使晚期iERM呈現(xiàn)收縮牽拉特性[14]。繼發(fā)性ERM同樣可能與PVD有很大關(guān)聯(lián)，但其與原發(fā)病的聯(lián)系更為緊密，已有的研究表明繼發(fā)性ERM本質(zhì)上是一種愈合反應(yīng)，這種反應(yīng)可以經(jīng)由缺氧，感染等病因通過激活轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)相關(guān)通路促進細胞增殖及細胞間質(zhì)的合成從而導(dǎo)致ERM的形成[15]。還有研究表明IL-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白-1等炎性細胞因子的上調(diào)及巨噬細胞、T細胞、B細胞等免疫細胞的活化參與了部分繼發(fā)性ERM的發(fā)生發(fā)展[16]。

2TGF-β

TGF-β是高度多效細胞因子，其在哺乳動物中存在三種同工型(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)，它們包含高度保守的區(qū)域，僅在幾個氨基酸區(qū)域中存在差異，且都通過相同的受體信號通路在傷口愈合、血管生成、免疫調(diào)節(jié)、癌癥及纖維化疾病中扮演重要角色[17]。TGF-β同源二聚體與潛伏相關(guān)肽(latency associated peptide，LAP)相互作用，形成小潛伏復(fù)合體(small latent complexes，SLC)，隨后與TGF-β結(jié)合蛋白(latent transforming growth factor β binding proteins，LTBP)結(jié)合，形成大型潛在復(fù)合體(large latent complex，LLC)。LLC以非活性形式分泌到細胞外基質(zhì)中，阻止TGF-β與其受體結(jié)合。LLC從基質(zhì)中釋放后，LAP與整合素αvβ6等結(jié)合后釋放活性TGF-β[18]。TGF-β有三種存在于胞膜的受體(TGFβRⅠ、TGFβRⅡ和TGFβRⅢ)。TGFβRⅠ和TGFβRⅡ的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中都含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，而TGFβRⅢ沒有激酶活性。TGF-β與TGFβRⅡ的結(jié)合以及與TGFβRⅠ的異源四聚化通過下游Smad啟動細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。TGFβRⅢ作為輔助受體發(fā)揮作用，以增加配體與TGFβRⅡ的結(jié)合效率[19]?；罨腡GF-β經(jīng)受體轉(zhuǎn)運進入胞質(zhì)后激活Smad信號通路，介導(dǎo)Smad2/3的磷酸化，磷酸化后的Smad2/3與Smad4結(jié)合后進入細胞核內(nèi)調(diào)控相關(guān)基因表達[20]。除上述經(jīng)典TGF-β-Snail途徑外，TGF-β下游還存在著Wnt/β-catenin通路、Snail通路等其他信號途徑，調(diào)控多種生理病理過程[21]。

3TGF-β與ERM

現(xiàn)階段學(xué)術(shù)界多將ERM視為始動于PVD的視網(wǎng)膜內(nèi)界膜層面的損傷愈合反應(yīng)或纖維化疾病。近年來對ERM成分的多項免疫組化研究也表明了TGF-β及其相關(guān)通路在ERM發(fā)病中的重要地位。在TGF-β所參與的ERM的發(fā)病機制中，可分為非經(jīng)典的TGF-β-Snail途徑與經(jīng)典的TGF-β-Smad途徑。

3.1TGF-β-Snail途徑與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)是1960年代由Elizabeth Hay首次提出的概念，指上皮細胞在胚胎發(fā)育時期及病理狀態(tài)下基因表達譜及表型均發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)特點的具有遷移能力的間葉樣細胞的過程[22-23]。EMT使細胞黏附分子的表達下調(diào)，角蛋白細胞骨架轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄐ蔚鞍?，從而使上皮細胞失去極性與上皮表型，獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質(zhì)等特性。EMT在胚胎發(fā)育(1型EMT)，組織修復(fù)及纖維化(2型EMT)及上皮性腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲(3型EMT)方面發(fā)揮重要作用[24]。而繼發(fā)性ERM本質(zhì)上是一種損傷愈合及纖維化反應(yīng)，2型EMT在其發(fā)生及發(fā)展中起著重要作用。

研究表明Snail、Slug、ZEB1、SIP1和Twist等轉(zhuǎn)錄因子參與了EMT的調(diào)控，其中以TGF-β-Snail途徑的作用最為關(guān)鍵[25-26]。TGF-β介導(dǎo)Snail與E-鈣黏著蛋白基因(E-cadherin)啟動子中的特定DNA序列E-boxs結(jié)合并抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)細胞黏附蛋白E-鈣黏著蛋白表達，而E-鈣黏著蛋白的下調(diào)被視為EMT的標(biāo)志[27]。

一般認為在繼發(fā)性ERM中EMT的發(fā)生發(fā)展過程是由源于視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment, RD)后經(jīng)歷增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy, PVR)的RPE細胞[28]，RD后由于視網(wǎng)膜的斷裂與血-視網(wǎng)膜屏障的破壞導(dǎo)致RPE細胞直接暴露于TGF-β，導(dǎo)致細胞內(nèi)Snail合成增多，作用增強進而導(dǎo)致EMT，使得RPE細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞，分泌ECM，從而形成ERM[29]。Li等[30]的一項研究發(fā)現(xiàn)在沉默Snail后間充質(zhì)標(biāo)志物——纖連蛋白及a-肌動蛋白(alpha-smooth muscle Actin，a-SMA)減少，上皮標(biāo)志物——E-cadherin及ZO-1增加，這進一步證明在繼發(fā)于PVR的ERM中Snail是RPE細胞在TGF-β介導(dǎo)下發(fā)生EMT的重要調(diào)控因子。

在晚期iERM中，其特征細胞成分肌成纖維細胞與2型EMT關(guān)系密切[31-32]，但iERM中轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞的Müller細胞卻并非上皮來源[33-34]，Kanda等[35]研究了Müller細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(GMT)作為EMT替代機制的可行性。通過實驗，Atsuhiro Kanda發(fā)現(xiàn)與BMP-4、CTGF等細胞因子相比，TGF-β1刺激下2型EMT標(biāo)記物(α-SMA，SM22，Ⅰ型膠原)上調(diào)明顯，故將TGF-β1作為潛在的2型EMT誘導(dǎo)劑。進一步測定TGF-β1刺激后EMT相關(guān)標(biāo)記物水平，發(fā)現(xiàn)Snail表達明顯上調(diào)，并且敲低Snail mRNA耗竭Snail抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的EMT相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)。后續(xù)實驗進一步揭示了Snail在Müller細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中賦予其遷移能力及喪失膠質(zhì)表型的作用。綜上所述，Müller細胞可經(jīng)歷由TGF-β-Snail軸驅(qū)動的2型EMT，并提出了Müller細胞GMT這一新概念，而其他可發(fā)生ERM的非上皮源性細胞如玻璃體細胞及其他膠質(zhì)細胞是否也有類似的轉(zhuǎn)化過程還需進一步研究。

3.2TGF-β-Smad途徑RPE細胞除經(jīng)TGF-β-Snail軸外還受到很多其他細胞因子及通路如p38-MAPK途徑、PKA、HSP90和MDM2等的調(diào)控經(jīng)歷2型EMT，而這些因子都通過對經(jīng)典的TGF-β-Smad途徑的影響進而促進RPE細胞遷移至ILM表面形成ERM。

3.2.1p38-MAPK 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)由一組級聯(lián)活化的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶蛋白組成，通過依級聯(lián)反應(yīng)將上游信號傳遞至下游應(yīng)答分子。p38是MAPK家族的重要成員，參與炎癥的調(diào)控及細胞增殖、分化、凋亡等過程[36-37]。

在PVR導(dǎo)致的ERM中，經(jīng)歷EMT的活化RPE細胞可達95%[38-39]，已有研究表明多種細胞因子在誘導(dǎo)RPE細胞活化中起作用，其中以TGF-β和TNF-α的研究最為成熟[40-41]，Shirasawa等[42]發(fā)現(xiàn)TNF-α可通過p38-MAPK途徑損傷RPE屏障功能進而導(dǎo)致其經(jīng)歷EMT，而在肺泡上皮細胞與小腸上皮細胞的EMT中TGF-β與TNF-α有協(xié)同作用[43]。Schiff等[44]通過對進行TGF-β和TNF-α共同處理(TNT)所形成的表現(xiàn)特殊收縮特性的體外成人RPE(adult human RPE，ahRPE)細胞聚集體進行研究，對比對照組、敲除p38基因組及使用p38抑制劑SB202190組收縮性物質(zhì)的含量，結(jié)果表明敲除p38基因組及使用p38抑制劑SB202190組收縮性物質(zhì)的含量下調(diào)甚至逆轉(zhuǎn)，這證明了p38-MAPK途徑是TGF-β和TNF-α下游信號通路的主要信號傳導(dǎo)節(jié)點,并且他們將采集到的患者ERM樣品進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，結(jié)果也呈現(xiàn)p38-MAPK途徑的富集。2018年Chen等[45]發(fā)現(xiàn)Plumbagin(PLB)可通過下調(diào)p38-MAPK信號通路相關(guān)分子表達來抑制PVR中RPE的增殖特性，展現(xiàn)了抑制p38-MAPK途徑在ERM臨床治療方面的可觀前景。

3.2.2TGF-β與HSP90 在iERM中，由于ECM中各型膠原及纖連蛋白等基質(zhì)成分的存在，使其具有纖維化疾病的特點[46-47]，而TGF-β介導(dǎo)了纖維化疾病的進展，免疫組化表明iERM中TGF-β1及其受體的過表達[48-49]。在TGF-β通路中，TGF-β與2型TGF-β受體結(jié)合后激活1型TGF-β受體[50-51]，進而激活下游Smad途徑，Smad是TGF-β通路的重要細胞質(zhì)介質(zhì)，Smad2/3磷酸化后與Smad4結(jié)合并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，調(diào)節(jié)多種基因表達，最終調(diào)控αSMA和Ⅰ型膠原等促進纖維化的蛋白的表達[52-53]。上述通路中存在包括熱休克蛋白90(HSP90)在內(nèi)的多種調(diào)節(jié)劑。已有報道證明HSP90在其他纖維化疾病中的作用，即HSP90能夠使2型TGF-β受體免受降解進而維持其磷酸化后的活性，從而促進纖維化物質(zhì)的表達[54]。Sethi等[55]研究了iERM中HSP90在TGF-β通路中的調(diào)控機制。結(jié)果顯示在表達2型TGF-β受體的iERM細胞中發(fā)現(xiàn)較高表達的HSP90，同時觀察到的Smad2/3、Smad4表達上調(diào)，表明Smad途徑的激活得到了增強。目前對于ERM中HSP90的更多機制還需進一步研究，但可將其視為潛在的治療靶標(biāo)。

3.2.3TGF-β與蛋白激酶A 蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinasea，PKA)是一類依賴于cAMP的蛋白激酶，激活后可導(dǎo)致多種蛋白質(zhì)磷酸化，在細胞生長、分化、凋亡及ECM分泌等過程中發(fā)揮重要作用[56-57]。RPE細胞的EMT已被認為是PVR后ERM形成的主要原因，其中TGF-β是EMT的一種重要調(diào)節(jié)劑[58-59]。TGF-β誘導(dǎo)的EMT受到多種信號通路及分子的串?dāng)_調(diào)節(jié)，PKA是串?dāng)_的重要組成部分。早先的研究已經(jīng)證實在腎小球系膜細胞及胰腺腺泡細胞等細胞中PKA能夠調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的EMT[60-61]，Lyu等[62]研究了PKA在PVR后RPE細胞EMT中的作用，實驗中通過對PVR患者ERM的PKA C亞基(PRKACa)表達的檢測發(fā)現(xiàn)PRKACa在ERM樣品中表達量明顯上升，且與EMT標(biāo)記物α-SMA和上皮標(biāo)記物CK8強烈共定位，結(jié)果表明PKA在經(jīng)歷EMT的RPE細胞中被激活。隨后，實驗者向PVR模型大鼠玻璃體腔內(nèi)注射選擇性PKA抑制劑H89，可觀察到PVR進展的延緩及眼底結(jié)構(gòu)的改善，并且視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram, ERG)b波波幅也得到了改善這表明H89對大鼠的視覺功能有一定的保護作用。在后續(xù)實驗中，Lyu等[62]又進一步驗證了H89對TGF-β途徑中有重要作用的Smad2/3沒有影響，不會引起其磷酸化或核異位，但阻斷了TGF-β1對抑制性信號Smad6的下調(diào)作用，說明H89增強了Smad6的抑制作用。這一結(jié)果揭示了PKA抑制劑在治療ERM方面的潛在可能。

3.2.4TGF-β與小鼠雙微體2 小鼠雙微體2(mouse double minute 2，MDM2)是一種致癌基因所編碼的蛋白，它可以作為P53-E3-泛素的連接酶促進抑癌基因編碼的P53蛋白通過泛素途徑降解，MDM2在p53依賴或非依賴途徑的腫瘤EMT中占有重要地位[63-64]。MDM2基因中有兩個啟動子，啟動子1(P1)是管家啟動子，而位于內(nèi)含子1的啟動子2(P2)則可被Smad或特異性蛋白1(Sp1)激活，進而響應(yīng)包括TGF-β在內(nèi)的各種刺激調(diào)控[65-66]。Sp1與P2的親和力增加可上調(diào)MDM2的表達，進而誘導(dǎo)RPE的EMT進程，最終導(dǎo)致罹患包括ERM在內(nèi)的PVR的風(fēng)險增高[67]。因此，抑制P2驅(qū)動的MDM2表達在預(yù)防ERM的發(fā)生發(fā)展中有著巨大的潛力。成簇的規(guī)則間隔短回文序列相關(guān)蛋白9(Cas9)是一種特異性極高的遺傳編輯工具，可通過阻斷轉(zhuǎn)錄延伸、阻止RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子與真核生物DNA結(jié)合靶向干擾真核生物基因組[68-71]。Liu等[72]用含有兩個突變的靶向MDM2 P2 dCas9(dCas9)的慢病毒轉(zhuǎn)染已受TGF-β2誘導(dǎo)而發(fā)生EMT的人RPE(ARPE-19)，發(fā)現(xiàn)dCas9阻斷了TGF-β2誘導(dǎo)的MDM2表達進一步的研究發(fā)現(xiàn)，dCas9也可抑制MDM2在非刺激條件下的基礎(chǔ)表達，暗示了高選擇性的dCas9療法在治療繼發(fā)于PVR的ERM方面的潛在價值[73-74]。

4總結(jié)與展望

TGF-β自1981年在轉(zhuǎn)化大鼠腎成纖維細胞的培養(yǎng)物中被發(fā)現(xiàn)后，對其功能及上下游信號通路的研究一直是醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域的熱點。經(jīng)過多年的研究，TGF-β在纖維化、腫瘤、炎癥、免疫調(diào)節(jié)等生理病理過程中的作用機制被逐一揭示。而ERM作為PVD后視網(wǎng)膜各細胞經(jīng)歷EMT而形成的纖維細胞膜，TGF-β通路及其相關(guān)串?dāng)_因子在其中扮演重要角色(圖1)。

圖1 TGF-β通路參與ERM形成的示意圖 TGF-β誘導(dǎo)Snail合成上調(diào)，下調(diào)E-鈣黏著基因表達，介導(dǎo)EMT。TGF-β激活P38通路，增強MITF、OTX2和RPE65等基因效應(yīng)，上調(diào)纖連蛋白、α-SMA、ECM?；罨腡GF-β經(jīng)受體轉(zhuǎn)運進入胞質(zhì)后激活Smad信號通路，介導(dǎo)Smad2/3的磷酸化，磷酸化Smad2/3與Smad4結(jié)合后進入細胞核內(nèi)調(diào)控相關(guān)基因表達。HSP90抑制Smad2/3去磷酸化，增強Samd2/3途徑效應(yīng)。PKA通過阻斷Smad6對Smad2/3的抑制作用增強經(jīng)典Samd通路效應(yīng)。

當(dāng)然，ERM的形成不僅依靠TGF-β的調(diào)節(jié)，越來越多的分子及通路被發(fā)現(xiàn)：如在增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者的ERM中，腫瘤壞死因子超家族成員15(TNFSF15)與成纖維細胞生長因子誘導(dǎo)分子14(FN14)結(jié)合后可在多種細胞(血管內(nèi)皮細胞，單核細胞、巨噬細胞和成肌纖維細胞)內(nèi)激活核因子NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[75]，上調(diào)包括基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、E-選擇素、IL-6、IL-8等多種促炎因子的表達，促進炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)膠質(zhì)細胞增生，形成纖維細胞膜，值得一提的是，PDR中以NF-κB為核心的炎癥信號通路上Wip1等相關(guān)分子在不斷地被發(fā)現(xiàn)完善[76]，而NF-κB在介導(dǎo)PDR患者繼發(fā)性ERM形成過程中是否與TGF-β通路有串?dāng)_有待進一步的研究證實；Zhang等[76]研究中發(fā)現(xiàn)，ROCK信號通路在DR缺氧和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的Müller細胞損傷中起著關(guān)鍵作用，ROCK途徑的激活可以導(dǎo)致Müller細胞形態(tài)改變，增加遷移率并刺激細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成[77-78]，進而促進Müller細胞在ILM上形成ERM。

如今ERM的發(fā)病率逐漸提高，已經(jīng)成為老年人視力損害的一大病因[79]。雖然玻璃體切除術(shù)合并ILM剝離這一一線治療方案已成為有癥狀ERM的首選治療，但手術(shù)具體入路選擇的爭議，染料的安全性不高，術(shù)后并發(fā)癥較多及ERM復(fù)發(fā)風(fēng)險較高等問題仍有待解決[80-82]。現(xiàn)階段學(xué)術(shù)界尚未就ERM的發(fā)病的分子機制達成一致，對其分子機制的進一步研究不僅能夠增進我們對ERM的理解，發(fā)現(xiàn)發(fā)病機制中重要的分子靶點也能為臨床選擇新治療手段提供思路。眾所周知，抗VEGF治療自2004年進入眼科范疇以來，通過對相關(guān)疾病分子機制的不斷完善，新型藥物層出不窮，已成為玻璃體切除術(shù)外治療DR等疾病的重要手段，且相較玻璃體切除術(shù)，玻璃體腔注射給患者帶來的不適也大大減少[83]。而TGF-β在兩型ERM的發(fā)生發(fā)展中雖占據(jù)重要地位，但由于TGF-β作為一種多功能的分子，單純抗TGF-β治療雖然能抑制ERM，但同樣阻礙了細胞其他生理活動。因此，進一步對整個TGF-β通路相關(guān)分子的完善，精準(zhǔn)抑制特異性高的分子，如Yoshida等[84]發(fā)現(xiàn)通過Smad4的去乙酰化誘導(dǎo)RPE細胞下調(diào)α-SMA并抑制TGF-β2誘導(dǎo)EMT的白藜蘆醇等新靶點藥物的將為ERM非玻璃體切除治療及預(yù)防帶來巨大的變革。