鄭 磊，張國(guó)明，陳妙虹，馬大卉

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，合并有黃斑水腫或進(jìn)展為增殖期通常會(huì)對(duì)患者的視功能造成不可逆損害，目前DR已成為全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的致盲性疾病之一。纖維增生膜的產(chǎn)生是DR晚期的基本病理表現(xiàn)之一，可引起牽拉性視網(wǎng)膜脫離，臨床處理相對(duì)棘手，因此阻止DR進(jìn)展及纖維增生膜形成一直是研究的熱點(diǎn)。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)層介于視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和脈絡(luò)膜之間，容易受到血糖波動(dòng)的影響，大量研究已證實(shí)視網(wǎng)膜微環(huán)境持續(xù)高糖水平會(huì)影響RPE細(xì)胞功能而參與介導(dǎo)DR發(fā)病進(jìn)展，如高糖環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡，破壞視網(wǎng)膜外屏障而加劇水腫和滲出[1]、高糖環(huán)境會(huì)導(dǎo)致RPE細(xì)胞分泌大量炎癥因子，包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6促進(jìn)DR進(jìn)展[2]等。而最近的研究還發(fā)現(xiàn)高糖可以增強(qiáng)RPE細(xì)胞的遷移能力[3-4]，可能參與DR纖維膜的形成，并且與RPE細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)的活化有關(guān)[5]。AG3340(普啉司他)是一種廣譜的MMPs合成抑制劑，已被證實(shí)可用于抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，AG3340還可以拮抗部分眼底新生血管的形成[7-9]，但目前尚缺乏AG3340在DR中的研究。本研究擬通過(guò)體外高糖條件下培養(yǎng)RPE細(xì)胞，探究AG3340對(duì)高糖狀態(tài)下RPE細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及相關(guān)機(jī)制，以期為抑制晚期DR纖維膜的產(chǎn)生提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(human retinal pigment epithelial cells-19，ARPE-19)購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)細(xì)胞物研究所(ATCC公司)。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器DMEM/F12培養(yǎng)基、2.5g/L胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(中美合資蘭州民海生物)，二甲基亞砜(DMSO)、AG3340(美國(guó)Sigma公司)，Transwell小室(美國(guó)Corning公司)，基質(zhì)膠Matrigel(美國(guó)BD公司)，MMP-9(ab228402)、MMP-2(ab92536)、Fibronectin(ab268021)及Collagen Ⅳ抗體(ab182744，英國(guó)Abcam公司)。微量加樣器(德國(guó)Eppendorf公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)(美國(guó)Licor公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%青-鏈霉素)，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，每3d傳代1次，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組將ARPE-19細(xì)胞分為4組進(jìn)行培養(yǎng)：(1)對(duì)照組(Control組)：含5.6mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2)高糖(high glucose，HG)組：含30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)HG+AG3340組：用MMPs抑制劑AG3340預(yù)處理細(xì)胞12h后，再添加含30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；(4)甘露醇(mannitol，MA)組：含5.6mmol/L葡萄糖和24.4mmol/L甘露醇的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為滲透壓對(duì)照組。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ARPE-19細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以2×105個(gè)/孔鋪于6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上，以200μL槍頭垂直于6孔板底部劃直線，人為制造細(xì)胞間距；用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，按照分組方案每孔加入等量培養(yǎng)液2mL繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。分別在0、24、48h使用倒置顯微鏡隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，用Image J軟件測(cè)量劃痕寬度。細(xì)胞遷移能力采用遷移率表示，細(xì)胞遷移率=(原劃痕寬度-現(xiàn)劃痕寬度)/原劃痕寬度×100%。

1.2.4Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ARPE-19細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以2×105個(gè)/孔鋪于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照分組方案每孔加入等量培養(yǎng)液2mL繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h；去除原培養(yǎng)基，PBS清洗1次，取少量胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞；PBS清洗細(xì)胞3次，計(jì)數(shù)，重懸于無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中；Transwell小室在加入細(xì)胞懸液前，需用Matrigel膠預(yù)先包被小室底部膜的上室內(nèi)面，置于24孔板內(nèi)，再于上室中加入細(xì)胞密度為1×105cell/mL的細(xì)胞懸液100μL，下室加入500μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h；待終止培養(yǎng)后，取出小室，用棉簽輕輕拭去上室內(nèi)層未發(fā)生侵襲的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定5min，0.2%結(jié)晶紫染色8min，清水洗去多余結(jié)晶紫，晾干后置于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，并計(jì)數(shù)發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.5Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平按照分組處理ARPE-19細(xì)胞48h后收集細(xì)胞，PBS洗滌，并用RIPA裂解緩沖液溶解，4℃以13 000r/min離心10min。上清液蛋白采用SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，并在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1h。MMP-9(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、Fibronectin(1∶500)及Collagen Ⅳ(1∶500)一抗孵育，加入相應(yīng)比例的熒光二抗，避光孵育1h，并使用LICOR-Odyssey儀器掃膜分析。

2結(jié)果

2.1AG3340抑制高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞遷移能力細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組在劃痕24h后的細(xì)胞遷移率總體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=72.02，P=0.001)；MA組細(xì)胞遷移率(20.91%±0.92%)與Control組(21.00%±0.81%)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.37，P=0.42)；HG組細(xì)胞遷移率(46.33%±7.76%)明顯高于Control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.29，P<0.001)；采用2.5、5.0、10.0μg/mL AG3340預(yù)處理后，細(xì)胞遷移率分別為38.33%±3.51%、33.50%±2.29%、33.00%±2.01%，均較HG組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.74、0.59、3.18，均P<0.01)。各組在劃痕48h后的細(xì)胞遷移率總體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=109.78，P<0.001)；MA組細(xì)胞遷移率(31.33%±1.49%)與Control組(31.67%±1.53%)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.62，P=0.35)；HG組細(xì)胞遷移率(67.00%±1.73%)明顯高于Control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.45，P<0.001)；采用2.5、5.0、10.0μg/mL AG3340預(yù)處理后，細(xì)胞遷移率分別為54.67%±2.52%、47.00%±7.07%、47.33%±17.24%，均較HG組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.56、4.16、0.27，均P<0.01)。在劃痕24、48h后AG3340 5.0μg/mL預(yù)處理的細(xì)胞遷移率均明顯低于AG3340 2.5μg/mL預(yù)處理的細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),但與AG3340 10μg/mL預(yù)處理的細(xì)胞對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(均P>0.05)，見(jiàn)圖1。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇5.0μg/mL作為AG3340預(yù)處理濃度。

圖1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力 A：劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移圖；B：各組細(xì)胞遷移率統(tǒng)計(jì)圖。

2.2AG3340抑制高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞侵襲能力Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞侵襲數(shù)目總體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=104.97，P<0.001)；MA組細(xì)胞侵襲數(shù)目(108.33±10.40個(gè))與Control組(109.31±5.73個(gè))相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.53，P=0.30)；HG組細(xì)胞侵襲數(shù)目(336.00±22.55個(gè))明顯多于Control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.87，P<0.001)；采用AG3340預(yù)處理后，細(xì)胞侵襲數(shù)目(238.67±13.89個(gè))較HG組減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.29，P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力 A：Transwell小室細(xì)胞侵襲圖；B：各組細(xì)胞侵襲數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖。bP<0.01 vs Control組; dP<0.01 vs HG組。

2.3AG3340拮抗高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、Fibronectin及Collagen Ⅳ蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=89.72、49.43、50.06、76.64，均P<0.001)。MA組MMP-9、MMP-2、Fibronectin及Collagen Ⅳ蛋白相對(duì)表達(dá)量與Control組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.43、0.29、0.48、3.33，均P>0.05)；與Control組相比，HG組細(xì)胞MMP-9和MMP-2相對(duì)表達(dá)量增加，F(xiàn)ibronectin和Collagen Ⅳ相對(duì)表達(dá)量減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.06、3.73、2.46、0.34，均P<0.001)。采用AG3340預(yù)處理后，細(xì)胞中MMP-9和MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均較HG組降低，F(xiàn)ibronectin和Collagen Ⅳ相對(duì)表達(dá)量均較HG組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.14、6.21、0.49、3.70，均P<0.05)，見(jiàn)圖3，表1。

表1 各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖3 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)。

3討論

DR是目前全世界范圍內(nèi)工作年齡人群第一位的致盲性疾病，根據(jù)病變嚴(yán)重程度可分為非增殖性DR(nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR)和增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，后者是DR的相對(duì)晚期階段[10]。PDR在我國(guó)糖尿病患者人群中的比例約為3.3%～7.4%[11]。纖維增生組織、纖維增生膜的產(chǎn)生是PDR的基本病理表現(xiàn)之一，由此可產(chǎn)生牽拉性視網(wǎng)膜脫離等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，損害患者的視功能[12]。如何抑制纖維增生膜的形成是挽救PDR患者視功能的關(guān)鍵。

目前關(guān)于PDR纖維化的形成機(jī)制尚無(wú)定論，復(fù)雜多樣的病理因素交織在一起形成網(wǎng)絡(luò)，相互影響，促進(jìn)PDR纖維化的發(fā)生[13]。研究發(fā)現(xiàn)PDR纖維增生膜中的主要細(xì)胞成分包括RPE細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等[14]，其中RPE細(xì)胞作為血-視網(wǎng)膜屏障的組成部分之一，承擔(dān)著維護(hù)視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要作用，其功能紊亂與很多視網(wǎng)膜疾病存在關(guān)聯(lián)[15]。由于RPE細(xì)胞緊鄰脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層，其非常容易受到體內(nèi)血糖濃度的影響。Farnoodian等[3]研究證實(shí)高糖會(huì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，與增加氧化應(yīng)激反應(yīng)和色素上皮衍生因子的表達(dá)有關(guān)。Che等[4]也發(fā)現(xiàn)高糖會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)RPE細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進(jìn)細(xì)胞遷移。本研究使用30mmol/L葡萄糖刺激ARPE-19細(xì)胞，證實(shí)高糖不僅可以增加細(xì)胞的遷移能力，同時(shí)局部侵襲能力也明顯增強(qiáng)。而RPE細(xì)胞一旦離開(kāi)其自然位置后，會(huì)化生為巨噬細(xì)胞或成纖維樣細(xì)胞，獲得較強(qiáng)的分裂增生能力，并可以產(chǎn)生和分泌膠原或其他細(xì)胞外基質(zhì)(extra-cellular matrix，ECM)成分，促進(jìn)眼內(nèi)纖維膜的形成[16]。因此，有效抑制高糖狀態(tài)下RPE細(xì)胞遷移，對(duì)于遏制纖維增生膜的形成和阻止DR的進(jìn)展至關(guān)重要。

MMPs家族是一組金屬離子依賴的結(jié)構(gòu)和功能同源的內(nèi)肽酶家族，能降解ECM的多種蛋白成分，是促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲最重要的蛋白家族之一[17]。大量研究已證實(shí)，在PDR患者的玻璃體液和增生膜中MMPs表達(dá)明顯增加[14，18-20]。這些MMPs來(lái)自于不同類(lèi)型的細(xì)胞，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、RPE細(xì)胞等[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)高糖環(huán)境使得ARPE-19細(xì)胞中的Fibronectin和Collagen Ⅳ降解明顯，前者是ECM和基底膜中的主要非膠原性糖蛋白，在細(xì)胞黏附中起核心作用；后者則構(gòu)成ECM的骨架。二者的降解勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致高糖環(huán)境下ARPE-19細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。而高糖狀態(tài)下ARPE-19細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)明顯上調(diào)，也證實(shí)了此種病理環(huán)境中ECM的降解確實(shí)與MMPs的活化有關(guān)。

AG3340是一種廣譜的、有效的MMPs抑制劑，可以有效抑制MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9等[22]。AG3340已被證實(shí)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有良好的抗癌效應(yīng)，如黑色素瘤、人結(jié)腸癌、人胰腺癌、乳腺癌等，其作用機(jī)制與AG3340可以抑制腫瘤新生血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移等相關(guān)[23]。此外，AG3340除了具有抗腫瘤效應(yīng)，在眼科部分疾病中也被證實(shí)可能具有一定的治療效用。既往研究報(bào)道AG3340可以降低外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(perliferative vitreoretinopathy，PVR)動(dòng)物模型中牽拉性視網(wǎng)膜脫離發(fā)生的數(shù)量和比例，其機(jī)制可能與AG3340抑制PVR形成過(guò)程中MMPs的形成有關(guān)[5-6]。另有研究證實(shí)AG3340可以抑制動(dòng)物模型中視網(wǎng)膜前膜(epiretinal membrane，ERM)的形成[24]。Garcia等[7]和Barnett等[8]發(fā)現(xiàn)無(wú)論是經(jīng)腹腔注射或經(jīng)玻璃體注射AG3340均可以顯著抑制氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen induced retinopathy，OIR)小鼠模型中視網(wǎng)膜新生血管的形成[7-8]。El Bradey等[9]報(bào)道經(jīng)玻璃體腔內(nèi)注射AG3340可以明顯降低激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管兔模型新生血管滲漏的比例。上述研究證實(shí)，AG3340抑制MMPs在多種眼部疾病中具有應(yīng)用價(jià)值，但對(duì)于AG3340是否會(huì)抑制PDR纖維增生膜的形成目前仍缺乏報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，用AG3340預(yù)處理ARPE-19細(xì)胞可以部分逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲能力增加，其潛在機(jī)制可能與AG3340抑制細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)，部分逆轉(zhuǎn)了高糖環(huán)境下細(xì)胞周?chē)鶨CM組分(Fibronectin和Collagen Ⅳ)的降解，將更多的細(xì)胞穩(wěn)定在其正常的生理位置。

PDR會(huì)給患者的視功能帶來(lái)極大危害，早期篩查和針對(duì)性的視網(wǎng)膜激光光凝可以有效抑制PDR的發(fā)生。但由于血糖控制不佳或錯(cuò)過(guò)了早期診治的時(shí)間窗，仍有很多NPDR患者會(huì)向PDR轉(zhuǎn)變，尤其是在公共醫(yī)療體系不健全的國(guó)家。因此尋找其他能夠阻止PDR形成的方法一直是研究熱點(diǎn)。本研究利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)AG3340可以部分逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞遷移和侵襲，為尋找能夠阻止PDR纖維膜生成及進(jìn)展的有效藥物提供了思路，但仍需大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。